2016,
Vol. 25
2. 江苏省淡水水产研究所, 江苏 南京 210017
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)又名小龙虾，原产于美国中南部以及墨西哥东北部[1]，因其味道鲜美和营养丰富，已成为我国重要的水产养殖物种之一[2-3]。近年来，国内外克氏原螯虾的消费需求量快速增长[4-6]，优质苗种的缺乏在一定程度上约束了克氏原螯虾养殖产业的发展。性腺发育是甲壳动物进行有性生殖的基础，对于克氏原螯虾性腺发育的研究，将有助于推动克氏原螯虾养殖产业的发展。目前，有关克氏原螯虾性腺发育的研究，主要集中在性腺组织结构及发育分期方面，在分子水平上研究性腺发育机制尚显不足。因此，在分子水平上研究其参与性腺发育机制的调节具有重要意义。
泛素化途径是生物体内一种高效率和高选择性的蛋白降解途径。泛素化途径参与许多细胞过程，如细胞周期的调控、细胞信号转导、发育与分化和物质代谢等[7-9]。泛素结合酶UBE2r(ubiquitin-conjugating E2r，UBE2r)是泛素化途径中重要的泛素结合酶之一，由蛋白激酶Ck2磷酸化形成。近年来，UBE2r已先后从酵母、爪蟾和人类等生物中被成功分离出来。研究发现UBE2r在酿酒酵母细胞G1-S过渡期的调节中是必不可少的，是细胞周期的一种抑制剂[10]。YEW等[11]研究发现UBE2r基因在非洲爪蟾的卵中具有调节Cdk2-cyclinE启动的功能。REYMOND等[12]研究显示，UBE2r基因在人类细胞周期中，参与细胞核和细胞质的迁移，同时也在有丝分裂后期发挥作用。PATI等[13]报道，无论在减数分裂还是有丝分裂细胞周期中，UBE2r基因可能对cAMP诱导基因调控具有影响。沈冰玲等[14]对日本囊对虾的研究发现，UBE2r基因在性腺中高表达，且在性腺发育各时期表达存在显著差异，推测其在精子和卵子发生中发挥了重要作用。
本研究中我们利用RACE技术获得了克氏原螯虾UBE2r基因的序列全长，结合qRT-PCR技术和原位杂交技术，对克氏原螯虾UBE2r基因在不同组织及性腺发育过程中的表达情况进行研究。通过Fmoc法合成多肽C-SDNDIDDGDDSGNGES-NH2，制备人工抗体，并利用Western blot技术进一步验证其在蛋白层面的表达情况。本研究旨在为进一步探讨克氏原螯虾UBE2r基因的功能提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用克氏原螯虾于2015年采自江苏盱眙满江红龙虾产业园有限公司。克氏原螯虾于实验室暂养72 h，经低温麻醉后，活体解剖。收集眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、精巢和卵巢组织样品。基于克氏原螯虾卵巢的外部形态、颜色和组织学特征[15]，参照李胜等[16]对克氏原螯虾卵巢的分期方法，将卵巢分为6个时期：未发育期(O1)、发育早期(O2)、卵黄发生前期(O3)、卵黄发生期(O4)、成熟期(O5)和恢复期(O6)。参照黄文虎等[17]对精巢的分期方法，将克氏原螯虾精巢分为3个时期：精原细胞增殖期(T1)、精母细胞发生期(T2)和精子细胞生成期(T3)。从9个不同个体中分别取出各组织，等量混匀后液氮速冻，-80 ℃超低温保存，以备后续实验使用。用于原位杂交和组织学观察的组织，用4%多聚甲醛处理后，再经甲醇处理，-20 ℃保存。用于Western blot检测的组织经DEPC处理水清洗后立即投入液氮中，-80 ℃保存。
1.2 实验方法使用TRIzol法提取各组织的总mRNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计检测合格后，置于-80 ℃冰箱保存备用。基于已构建的克氏原螯虾性腺转录组文库[18]中UBE2r基因的部分序列，利用Primers 5.0[19]设计短片段引物F1、R1(表 1)进行目的片段扩增。按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech，美国)说明书进行反转录，以SMART cDNA为扩增模板，使用试剂盒自带的UPM引物与基因特异性引物，分别进行3′RACE和5′RACE扩增。反应体系为：41.5 μL Master Mix；2.5 μL cDNA模板；5 μL 10×Universal Primer A Mix；1 μL GSP-F2(或GSP-R2)。扩增程序为：94 ℃变性30 s；72 ℃退火3 min，5个循环；94 ℃变性30 s、70 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，5个循环；94 ℃变性30 s、68 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，25个循环。采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，中国) 切胶回收3′RACE产物及5′RACE产物，将PCR产物纯化后连接到Pgem-T Easy载体上，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，经蓝白斑筛选后挑选阳性克隆进行测序，实验中所用的引物及测序均由上海生工工程有限公司完成。
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表 1 实验引物及序列 Tab.1 The primers and sequences used in this experiments |
采用NCBI在线分析工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorfhttp:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf . html html)对所得到的序列进行开放阅读框和氨基酸预测，并对编码蛋白的各种基本理化特性进行预测。在线BLAST其他物种的UBE2r基因序列，结合BioEdit[20]软件对基因序列进行多重比对，用MEGA 4.0[21]软件构建NJ系统进化树。
1.4 Pc-UBE2r基因的表达分析分别以克氏原螯虾眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、肠道、肌肉、精巢和卵巢8个组织总RNA为模板，以及精巢发育的3个时期和卵巢发育的6个时期的组织总RNA为模板，使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒(TaKaRa，日本)合成用于RT-PCR反应的cDNA，定量引物为：RT-F3、RT-R3(表 1)。选择在克氏原螯虾各组织中可稳定表达的内参基因EIF来校正基因的表达量[22]。实时定量PCR反应按照SYBR® Premix ExTaqTM Ⅱ(Tli RnaseH Plus)试剂盒(TaKaRa，日本)说明书进行，PCR反应体系：12.5 μL 2×SYBR Green qRT-PCRtime PCR Master Mix；0.5 μL RT-F3；0.5 μL RT-R3；2 μL cDNA；9.5 μL RNzse/DNase free ddH2O。其中每个样品的目的基因和内参基因分别进行4次技术重复。PCR反应的扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法[23]计算Pc-UBE2r基因在不同组织以及性腺发育不同时期的相对表达量。应用SPSS 18.0 软件[24]对各数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并进行显著性分析(P＜0.01)。所有图片采用 SigmaPlot 12.5[25]软件绘制。
1.5 原位杂交石蜡切片经常规脱蜡，经3%H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤2次。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃或室温消化3～30 min，0.5 mol/L PBS洗3次×5 min，蒸馏水洗1次。按每张切片20 μL加预杂交液，恒温箱37～40 ℃放置2～4 h。用杂交液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，每张切片上加20 μL杂交液，恒温箱37～40 ℃杂交过夜。30～37 ℃左右2×SSC洗涤2次，每次5 min；0.5×SSC洗涤15 min；0.2×SSC洗涤15 min。恒温箱37 ℃放置30 min后，滴加生物素化鼠抗地高辛，于恒温箱37 ℃放置60 min后，用0.5 mol/L的PBS清洗4次，每次5 min。滴加SABC，室温放置30 min后，用0.5 mol/L的PBS清洗3次，每次5 min。使用DAB显色试剂盒进行显色后,显微镜下观察并拍照。
1.6 Western blot检测对提取的各组织蛋白进行SDS-PAGE电泳，用制备的UBE2r多克隆抗体作为一抗，对克氏原螯虾各组织蛋白进行Western blot 检测。电泳时每个上样孔加变性后的上样液40 μg，留一孔加10 μL预染的Marker。先用70 V恒压电泳，约30 min，后改用90 V恒压电泳。转印蛋白及免疫检测：200 mA恒流转膜70 min。转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5％BSA室温封闭2 h。取出膜，于摇床上用TBST洗膜5 min×3次。孵育袋中加入封闭液稀释的UBE2r抗体( 1∶1 000)，β-actin(Boster 1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jackson 1∶2 000)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(Jackson 1∶2 000)室温孵育2 h。膜于化学发光检测试剂(试剂A∶试剂B＝1∶1)反应2 min，取出膜，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。
2 结果 2.1 Pc-UBE2r 基因序列分析Pc-UBE2r基因序列全长3 671 bp (GenBank 登录号：KX091172 )，包括554 bp的5′端非编码区(5′-UTR)、729 bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)和2 389 bp 的3′端非编码区(3′-UTR)，在3′-UTR有典型的加尾信号AATAA。该序列可编码242个氨基酸，预测分子量大小为27.6 ku，等电点为4.17。UBE2r蛋白的82~97位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的一个结构域，且在该区域存在一个半胱氨酸残基(Cys94)活化位点。
2.2 多序列比对及系统进化分析经BLAST比对发现，Pc-UBE2r与节肢动物UBE2r的序列同源性较高(图 1)，与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus,ACA09717.1)UBE2r基因的同源性为97％，与二疣犀甲(Oryctes borbonicus,KRT82395.1)、美洲鲎(Limulus polyphemus,XP013783757.1)和黄翅菜叶蜂(Athalia rosae,XP012253743.1)的一致性分别为85％、76％和78％。采用邻接法(Neighbor joining，NJ)构建系统进化树，Pc-UBE2r先与日本囊对虾聚为一枝，再与其他节肢动物聚为一大枝(图 2)，鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物单独聚为一枝，结果与各物种的进化关系保持一致。
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图 1 Pc-UBE2r 和其他物种 UBE2r 氨基酸序列多重比较
Fig. 1 Alignment of the amino acid sequences of different UBE2r proteins
A.rosae. 黄翅菜叶蜂； C.canorus. 杜鹃； L.polyphemus. 美洲鲎； M.japonicus. 日本囊对虾； M.ochrogaster. 草原田鼠； O.borbonicus. 二疣犀甲； H.sapiens. 人类； X.tropicalis. 非洲爪蟾； P.clarkii. 克氏原螯虾。
所有氨基酸序列GenBank登录号 The GenBank Login number of amino acid sequence ：黄翅菜叶蜂 Athalia rosae，XP_012253743.1；杜鹃 Cuculus canorus，XP_011439446.1； 美洲鲎 Limulus polyphemus，XP_013783757.1； 日本囊对虾 Marsupenaeus japonicus，ACA09717.1； 草原田鼠 Microtus ochrogaster，XP_005362063.1； 二疣犀甲 Oryctes borbonicus，KRT82395.1； 人类 Homo sapiens，NP_004350； 非洲爪蟾 Xenopus tropicalis，AAI24047.1。 |
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图 2 Pc-UBE2r和其他物种UBE2r氨基酸序列系统进化分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of the UBE2r amino acid sequences between P. clarkii and other species
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qRT-PCR结果显示，Pc-UBE2r 基因在克氏原螯虾各组织中均有表达 (图 3)，其中眼、鳃、肝胰腺、心脏、肠和肌肉组织中的表达量较低，在性腺中显著高于其他组织(P< 0.05)。如图 4a所示，Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾卵黄发生前期(O3)表达量最高，在未发育时期表达量最低。在卵黄发生期以后，Pc-UBE2r的表达量开始逐渐减少。在精巢发育的不同时期中，在精母细胞发生期(T2期)中的表达量开始升高，且显著高于其他时期(P< 0.05)，在精子细胞生成期阶段 (T3期)表达量显著降低(图 4b)。
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图 3 Pc-UBE2r基因在不同组织间的表达特征
Fig. 3 Distribution pattern of Pc-UBE2r in various tissues
柱状图上标注的星号表示Pc-UBE2r的表达量在精巢和卵巢中显著高于其他组织(P< 0.05)。 The asterisk on the histogram indicates that the expression of Pc-UBE2r in testes and ovaries were significantly higher than other tissues (P< 0.05). |
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图 4 Pc-UBE2r基因在性腺不同发育时期的表达
Fig. 4 The expression of Pc-UBE2r during gonad developmental stage
O1. 未发育期； O2. 发育早期； O3. 卵黄发生前期； O4. 卵黄发生期； O5. 成熟期； O6. 恢复期； T1. 精原细胞增殖期； T2. 精母细胞发生期； T3. 精子细胞生成期。不同字母和星号表示有显著差异( P< 0.05)。 O1. no developmental stage; O2. early developmental stage; O3. previtellogenic stage; O4. vitellogenic stage; O5. mature stage; O6. post-spawning; T1. Spermatagonial cells proliferation stag; T2. spermatocyte generation stage; T3. sperm generation stage. Different letters and the asterisk represent significant difference (P< 0.05). |
原位杂交结果显示，卵巢未发育期 (O1期)，Pc-UBE2r的阳性信号均匀地分散在细胞质中。随着卵巢的逐渐发育，在卵巢发育早期(O2期)中，阳性信号逐渐迁移到细胞核的周围。在卵黄发生前期(O3期)和卵黄发生期(O4期)，阳性信号始终集中在细胞核的周围。在卵母发育成熟期(O5期)的细胞中，阳性信号逐渐迁移到滤泡细胞周围。当亲虾排完卵，卵巢进入恢复期(O6期)，阳性信号也逐渐消失(图版Ⅰ)。在精原细胞增殖期(T1)和精子形成期(T3)，Pc-UBE2r的阳性信号在精原细胞、精子细胞中分布很少或者没有分布。而在精母细胞发生期(T2)，阳性信号主要分布在初级精母细胞的周围(图版Ⅱ)。
2.5 组织总蛋白Western blot 检测利用Western blot技术检测UBE2r蛋白在克氏原螯虾眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、精巢及卵巢中的表达情况，发现其在眼柄、心脏、肠、肌肉、精巢和卵巢中均有表达，大小约为27.6 ku，与预测分子量大小一致。检测各组织的表达量，发现UBE2r蛋白在克氏原螯各组织中的表达量存在极显著差异(P＜0.01)，在精巢和卵巢中高表达，在眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、肠、肌肉等组织中低表达(图 5)。
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图 5 Pc-UBE2r 在克氏原螯虾各组织中的Western blot 检测
Fig. 5 Western blot detection of Pc-UBE2r in
different tissues of P.clarkii
eyestalk. 眼柄； gill. 鳃； he. 肝胰腺； ht. 心脏； in. 肠； mu. 肌肉； te. 精巢； ov. 卵巢。 |
泛素结合酶E2主要通过与泛素形成硫酯键作用使其与底物蛋白结合，从而使其转移到泛素连接酶E3上。作为泛素途径中重要的组成部分，其在结构上高度保守，在30％～40％的泛素结合酶中都有一个16 ku UBC保守区域。在该结构域中还存在一个硫酯形成所需的特异性半胱氨酸残基活化位点[26]。在酵母[27]的研究中发现，UBE2r基因特异性的C末端的缺失会造成一些酶不能进入酵母细胞S期。同样在人类的UBE2r基因中也发现，其通过特异性的C末端与细胞内其他蛋白发生特异性的相互作用以及介导其在细胞内的定位[28]。同源性比对发现，Pc-UBE2r基因序列与其他节肢动物UBE2r基因序列同源性较高，其中与日本囊对虾的同源性高达97％。系统进化分析表明，UBE2r在进化过程中保守性很高。据此可以推测Pc-UBE2r基因可能具有与日本囊对虾UBE2r基因同样的功能。
实时定量PCR结果显示，Pc-UBE2r 基因在克氏原螯虾不同组织中广泛表达，这与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 和斑节对虾(Penaeus monodon)中E2基因的表达模式较为一致[29-30] ，而且在精巢和卵巢中的表达量相对较高。同时Western blot 检测结果也显示，Pc-UBE2r蛋白在精巢和卵巢的表达水平显著高于其他组织。这些结果可能表明，Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾性腺中具有重要作用。MICHAEL和NEWPORT[31]在非洲爪蟾蜍的卵子提取物中发现，UBE2r基因负责介导负调节因子蛋白激酶Wee的降解，而Wee在细胞周期S期对有丝分裂有关键性的作用。精子和卵子在分裂过程中，需要发生蛋白质的合成和降解[32-33]，而UBE2r介导一些细胞周期过程中蛋白激酶的降解，来参与调控精子和卵子的发生。本研究中Pc-UBE2r基因在精巢和卵巢的发育过程中表达量有明显的变化。在卵巢中，Pc-UBE2r基因的表达量在O1期最低，在O3期表达量快速增长并到达最高值，随后表达量逐渐降低；在精巢中，Pc-UBE2r基因的表达量在T2期达到最高水平。在细胞周期过程中，各时相的过渡都需要细胞周期蛋白的降解，而大多数细胞周期蛋白都是通过泛素化途径降解的。由于卵巢和精巢中一些细胞周期所必需的蛋白质聚集，Pc-UBE2r的表达量在O1期和T1期都不高。随着细胞周期的进行，这些蛋白通过 Pc-UBE2r介导的泛素蛋白酶途径降解细胞内的蛋白，在卵巢发育O3期和精巢发育T2期的表达量达到最高。随着降解蛋白达到一个平衡状态，Pc-UBE2r的表达量开始逐渐降低，分别在卵巢发育O4期和精巢发育T3期出现下降的趋势。这些结果表明，克氏原螯虾精子和卵子的发生过程中，生殖细胞内蛋白的降解可能和UBE2r基因的活动有关。
已经有许多研究表明泛素及泛素相关基因在性腺发育和配子发生过程中发挥着重要作用[34-35]。在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中泛素C-末端水解酶L1被定位在卵黄发生前期的卵母细胞上[36]。戴燕彬等研究发现泛素(Ub)在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)卵巢中高表达[37]。沈冰玲等[14]对日本囊对虾的研究发现，UBE2r基因在性腺中高表达，且在性腺发育各时期表达存在显著差异。在雄性果蝇精巢中，UbcD1基因突变会引起雄性减数分裂的破坏，导致雄性不育[38]。ROEST 等对小鼠HR6B基因在精巢中的研究发现，该基因在染色体构建中有一定的作用，在精子发生时由于其突变，从而导致雄性小鼠不育[39]。本研究通过Pc-UBE2r mRNA在卵巢中的定位显示，Pc-UBE2r mRNA在未发育的卵母细胞中均有分布，随着卵母细胞的发育，逐渐迁移到卵黄发生前期、中期和后期卵母细胞的细胞核周围，最后分布在成熟卵母细胞的滤泡细胞中。这些结果与REYMOND等研究UBE2r基因在人类细胞周期中参与细胞核和细胞质迁移的结果一致。结合这些结果，我们推测Pc-UBE2r基因可能通过调控生殖细胞分裂和分化过程中的胞质重组而调节克氏原螯虾配子的发生过程。通过Pc-UBE2r mRNA在精巢中的定位显示，Pc-UBE2r的阳性信号主要在T2期精巢的次级精母细胞中高度表达，在其他时期的精细胞中阳性信号很弱或者没有。在T2期的精巢中，精母细胞大多处于第一次和第二次减数分裂时期，染色体出现分裂和重组，Pc-UBE2r在该时期精巢中高度表达。而这一研究结果和UBE2r在哺乳动物精子发生的减数分裂后期达到最高表达水平结果相似[40]。从这些研究来看，推测Pc-UBE2r基因可能在染色体构建过程中起着重要作用。
本研究从克氏原螯虾中获得了UBE2r基因的cDNA 全长，通过对其进行生物信息学和同源进化分析，以及在性腺发育过程中的差异表达与定位，证明了UBE2r基因在克氏原螯虾的性腺发育和配子发生过程中起着重要的作用，从而为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据。
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2. Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province, Nanjing 210017, Jiangsu, China