2016,
Vol. 25
2. 浙江省淡水水产研究所 浙江省鱼类健康与营养重点实验室, 浙江 湖州 313001
鱼类的必需氨基酸有10种，苯丙氨酸是其中之一[1]，它在鱼体内可直接参与蛋白质的合成，饲料中苯丙氨酸缺乏可引起实验鱼体蛋白质合成下降，表现为蛋白质沉积和体蛋白含量下降，添加苯丙氨酸后则明显改善上述状况。而饲料中苯丙氨酸过量对鱼类生长的影响存在明显的种间差异，主要表现为对鱼体生长产生抑制作用和对鱼体生长无显著性影响两类[2]。除直接参与鱼体蛋白质合成外,苯丙氨酸还可在苯丙氨酸羟化酶作用下转变成酪氨酸，发挥其生理功能。酪氨酸除作为鱼类体蛋白质合成原料外，还可在蛋白质中作为磷酸基团受体，在受体酪氨酸动力酶作用下，其羟基与经转运的磷酸基团结合，实现磷酸化，使体内蛋白质活性变化[3]。同时，酪氨酸还是鱼类体内生成甲肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、肾上腺素及多巴胺等激素或神经递质的前体，对调节生长和其他生命活动有着重要的作用[1]。另有研究表明鱼类对苯丙氨酸的需求可部分被酪氨酸所替代，即酪氨酸对苯丙氨酸有节约作用[2]。
草鱼(Ctenopharyngodon idellus Valenciennes)是传统的淡水“四大家鱼”之一，是我国养殖产量较高的淡水养殖品种，对其营养需求的研究较多[4-11]，其研究成果对草鱼配合饲料的开发和应用起到了极大的推进作用。但对其必需氨基酸需求的研究尚不完善，仅见精氨酸[8]、赖氨酸[9]、苏氨酸[10]和异亮氨酸[11]等需求量的报道。本实验是通过在一定酪氨酸水平下探讨不同苯丙氨酸水平对草鱼鱼种生长、饲料利用等指标的影响，从而得出其适宜的苯丙氨酸需求量，为开发氨基酸平衡的草鱼高效配合饲料提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验鱼实验鱼为浙江省淡水水产研究所实验基地同塘培育的当年鱼种。选取体质健壮、规格整齐的个体，放入已经编号的水族箱中，用实验基础饲料驯养1周，待实验鱼均能较好摄食后，进行正式实验。实验鱼共420尾，随机分成7组，每组3重复，每个重复放鱼20尾。每组实验鱼的初始体质量为13.21 g。
1.2 实验饲料实验饲料以酪蛋白、明胶和晶体氨基酸混合物为蛋白源，氨基酸模式与测定的实验草鱼全鱼总氨基酸为36%的氨基酸模式一致(苯丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸除外)，用晶体苯丙氨酸调节饲料苯丙氨酸水平，用天冬氨酸和谷氨酸(1∶1)调整百分比。实验饲料设计配方的原料组成及营养水平见表 1，苯丙氨酸实测水平分别为0.82%、1.06%、1.20%、1.42%、1.63%、1.88%和2.12%(占饲料的质量分数)。实验饲料制作时，先将原料粉碎，并过60目筛，所有晶体氨基酸用羧甲基纤维素钠包膜后[8]，再与其他原料混合，搅拌均匀后，用绞肉机挤压成型，制成直径0.20 cm、长度0.30 cm的硬颗粒饲料，于50 ℃烘干，冷却后入塑料袋包装,置于4 ℃冰箱冷藏备用。实验饲料必需氨基酸组成见表 2。
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表 1 实验饲料组成及营养水平(干物质基础) Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) |
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表 2 实验饲料的必需氨基酸组成(干物质基础) Tab.2 Essential amino acid composition of the experimental diet (DM basis) |
实验在浙江省淡水水产研究所实验基地进行。养殖系统为室内玻璃缸循环水养殖系统，水族箱养殖水体为0.8 m×0.5 m×0.4 m，每个缸内配有生物过滤装置和气石。实验用水为经过充分曝气的自来水，日换水量为总水体的一倍，连续充气。投饲方法采用饱食投喂，08：00、12：00和16：00各投喂一次。实验期间，水温25～30 ℃，pH 7.4～8.0，溶氧>5.0 mg/L，氨氮0.14～0.20 mg/L，亚硝酸盐0.02～0.05 mg/L。实验期间每天记录投饲量。
1.4 取样及分析实验开始前随机取鱼作为初始鱼样。饲养实验结束后，对实验鱼停饲24 h后计数并称重；每缸随机取鱼10尾为一混合样，用于测定实验鱼的全鱼组成；另取5尾鱼称量全长和体质量，于冰盘上解剖取内脏和肝脏称重。
水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分的测定参照AOAC的方法[12]:水分测定采用失重法在105 ℃烘干至恒重；粗蛋白质测定采用凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗灰分测定采用马福炉550 ℃焚烧法。每个样品测定2个平行样。
1.5 计算公式实验鱼的增重率(weight gain rate,WGR)、饲料效率(feed efficiency,FE)、成活率(survival rate,SR)、蛋白质积累率(protein retention efficiency,PRE)、脏体比(viscera index,VSI)、肝体比(hepatosomatic index,HSI)和肥满度(condition factor,CF)计算公式如下：
(1)
式中：WGR为增重率；Wt为草鱼终末体质量(g)；Wo为草鱼初始体质量(g)。
(2)
式中：FE为饲料效率；Wt为草鱼终末体质量(g)；Wo为草鱼初始体质量(g)；Wf为摄食饲料干质量(g)。
(3)
式中：SR为成活率；Nt为每缸鱼剩余条数；No为每缸鱼最初条数。
(4)
式中：PRE为蛋白质积累率；Pr为鱼体蛋白质积累量(g)；Pf为蛋白质摄取量(g)。
(5)
式中：VSI为脏体比；Wv为内脏质量(g)；Wb为鱼体质量(g)。
(6)
式中：HSI为肝体比；Wh为肝脏质量(g)；Wb为鱼体质量(g)。
(7)
式中：CF为肥满度；Wb为鱼体质量(g)；L为体长(cm)。
1.6 数据处理及统计分析实验数据采用平均数±SD表示，采用SPSS 11.5 for Windows软件(one-way ANOVA)对所得实验数据进行单因素方差分析，若有显著差异再做SNK多重比较确定组间差异性。显著水平P采用0.05，若P<0.05为差异显著。采用折线回归分析模型[13]来分别拟合鱼体增重率、饲料效率及蛋白质积累率与苯丙氨酸水平之间的关系，求得草鱼鱼种苯丙氨酸的需求量。
2 结果 2.1 草鱼鱼种生长情况饲料苯丙氨酸水平对鱼体增重率、饲料效率和蛋白质积累率有显著影响(P<0.05)。鱼体增重率、饲料效率和蛋白质积累率随饲料苯丙氨酸水平从8.2提高到12 g/(kg干饲料)而显著升高，但继续升高则不再有显著变化。饲料苯丙氨酸水平对成活率、脏体比、肝体比和肥满度无显著影响(P>0.05)，见表 3。
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表 3 饲料苯丙氨酸水平对草鱼鱼种生长和饲料利用的影响 Tab.3 Effects of dietary phenylalanine level on growth performance of grass carp |
饲料酪氨酸水平约5.5 g/(kg干饲料)时，以鱼体增重率为指标，经折线模型回归分析，求得草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸的需求量为12.73 g/(kg干饲料 )，见图 1；用饲料效率为指标，经折线模型回归分析，求得草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸需求量为12.20 g/(kg干饲料)，见图 2；以蛋白质积累率为指标，经折线模型回归分析，求得草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸需求量为12.55 g/(kg干饲料)，见图 3。
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图 1 饲料中苯丙氨酸水平对草鱼鱼种增重率的影响
Fig. 1 Effect of dietary phenylalanine on WGR of juvenile grass carp
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图 2 饲料中苯丙氨酸水平对草鱼鱼种饲料效率的影响
Fig. 2 Effect of dietary phenylalanine on FE of juvenile grass carp
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图 3 饲料中苯丙氨酸水平对草鱼鱼种蛋白质积累率的影响
Fig. 3 Effect of dietary phenylalanine on PRE of juvenile grass carp
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草鱼鱼种全鱼粗蛋白质随饲料苯丙氨酸水平从8.2 g/kg提高到12 g/kg而不断升高，但继续升高则不再有显著变化。饲料苯丙氨酸水平对全鱼水分、粗脂肪和粗灰分无显著影响(P>0.05)。
3 讨论 3.1 饲料中苯丙氨酸水平对草鱼鱼种生长、饲料利用和蛋白质积累率的影响苯丙氨酸作为一种必需氨基酸，在促进水生动物的生长和蛋白质代谢中发挥着重要的作用[14]。本实验结果表明，饲料中苯丙氨酸含量低于12 g/(kg干饲料)时(饲料1和饲料2)，随着饲料中苯丙氨酸含量的降低，草鱼鱼种的生长不断减慢，饲料效率不断降低，而且鱼体蛋白质积累率和实验结束时鱼体粗蛋白质含量均呈显著下降。其原因可能是当草鱼鱼种摄食苯丙氨酸含量不足的饲料后，因必需氨基酸不平衡，一方面限制了利用氨基酸合成体蛋白质，另一方面造成体内有过多的氨基酸被分解，使鱼体因排出多余的氨而额外消耗能量，从而影响了草鱼的生长和饲料的利用。而当饲料中苯丙氨酸的含量达到一定量时，鱼的生长和饲料效率达到最佳，而且进一步提高饲料中苯丙氨酸含量，则不再有显著变化。同时饲料中苯丙氨酸在该范围中变化，鱼体蛋白质积累率和实验结束时鱼体粗蛋白质含量也均不再显著变化，表明此时饲料苯丙氨酸水平均能满足草鱼正常生长需要，当饲料苯丙氨酸水平超过最低需要量后，虽然必需氨基酸平衡被再次打破，但饲料氨基酸总量保持不变，不会给鱼体造成负影响。该结果与对银鲈 (Bidyanus bidyanus Mitchell)[15]、遮目鱼(Chanos chanos Forsskal)[16]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss Walbaum)[17]和大磷大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha Walbaum)[18]等研究结果相似。但也有研究因实验鱼的种类、实验剂量及饲料酪氨酸水平等条件不同而得到的结果与此并不完全一致。对印鲮(Cirrhinus mrigala Hamilton)[19]的研究表明，当饲料苯丙氨酸水平超过最低需要量的一定范围时，鱼体的生长不受影响，但饲料苯丙氨酸水平继续升高，鱼体的生长、饲料效率及蛋白效率均显著下降；而对喀拉鲃(Catla catla Hamilton)[20]和南亚野鲮(Labeo rohita Hamilton)[21]的研究中则发现，当饲料苯丙氨酸水平超过最低需要量后，鱼体生长、饲料效率和蛋白效率均出现下降。因此这些研究认为饲料中过高剂量的苯丙氨酸可能导致其在体内积累而产生毒性，对鱼类生长有一定的负面作用，但引起这种负面作用的机理尚有待深入研究加以明晰。
3.2 草鱼鱼种对苯丙氨酸的需要量鱼类对苯丙氨酸需要量主要根据生长实验出现的剂量-生长效应，采用不同数学模型进行回归分析加以确定[1]。已有报道所采用的数学回归模型主要有折线模型(Broken-line regression)或二次曲线模型(Quadratic regression)。本实验采用增重率作为效应指标，用折线回归模型，得出草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸的需求量为12.73 g/(kg干饲料)。在研究鱼类苯丙氨酸的需求量时，除用生长指标作为确定需求量依据外，许多研究还用其他的一些指标加以验证，发现饲料效率、蛋白质效率、蛋白质积累率、苯丙氨酸积累率和RNA/DNA也是非常好的有效指标[19-20, 22]。本实验分别采用饲料效率和蛋白质积累率作为效应指标得出的草鱼鱼种苯丙氨酸需求量为12.20 g/kg和12.55 g/kg，与用生长指标得出的需求量比较相近，表明饲料效率和蛋白质积累率作为确定苯丙氨酸需求量验证指标也是有效的。因此草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸适宜需求量为12.20～12.73 g/(kg干饲料)，饲料酪氨酸水平约5.5 g/(kg干饲料)，占饲料粗蛋白的3.39%～3.54%。这一结果高于团头鲂[22]的2.74%~2.97%饲料蛋白，低于喀拉鲃16.9 g/(kg干饲料)[20]，造成这种差异的原因可能是实验动物及条件的不同。
另外，已有研究证明鱼类饲料中酪氨酸可节约部分苯丙氨酸,而酪氨酸对苯丙氨酸的等效替代值因鱼的种类不同而略有差异。如鲤鱼(Crprinus carpio Linnaeus)为60%[14]、虹鳟为48%[17]、印鲮为36%[19]、喀拉鲃为37%[20]、遮目鱼为46%[23]、斑点叉尾(Ictalurus punctatus Ranfinesque)为50%[24]。本实验中草鱼对饲料苯丙氨酸需求量是在饲料酪氨酸水平固定[5.5g/(kg干饲料)]的情况下求得，今后有必要进一步研究确定饲料中酪氨酸对苯丙氨酸的节约作用。
3.3 饲料中苯丙氨酸水平对草鱼鱼种全鱼体组成的影响国内外关于饲料苯丙氨酸水平对鱼体组成的影响已有一些报道。REN等[22]用含不同水平苯丙氨酸(0.57%～2.04%)的饲料饲养团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih)9周后发现，饲料苯丙氨酸水平对鱼体水分、粗蛋白质和粗脂肪均有显著影响，但不影响粗灰分含量。AHMED等[19]、ZEHRA等[20]和KHAN等[21]发现饲料苯丙氨酸水平对印鲮、喀拉鲃和南亚野鲮(初始体质量约0.6 g)的鱼体水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分均有显著影响(表 4)。KIM[17]发现饲料苯丙氨酸水平对虹鳟全鱼粗蛋白质和粗脂肪影响显著。而马志英等[25]研究则认为，饲料苯丙氨酸水平对异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)的全鱼水分、粗蛋白质、粗脂肪均无显著影响。本研究中饲料苯丙氨酸水平仅对草鱼全鱼粗蛋白质含量有显著影响，而对全鱼水分、粗脂肪和粗灰分均无显著影响。不同研究者得到的结果并不相同。其原因除与鱼的种类不同有关外，还可能与实验鱼生长阶段、生长速度、实验剂量范围等因素存在差异有关。
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表 4 草鱼鱼种全鱼生化组成 Tab.4 Whole fish composition of grass carp |
本实验条件下，在饲料酪氨酸水平为5.5 g/(kg干饲料)时，以鱼体增重率、饲料效率和蛋白质积累率为指标，求得草鱼鱼种对饲料苯丙氨酸需求量为12.20～12.73 g/(kg干饲料)，占饲料粗蛋白的3.39%～3.54%。
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2. Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, Zhejiang, China