上海海洋大学学报  2016, Vol. 25 Issue (1): 86-96   PDF    
两种LD50计算方法对副溶血性弧菌毒力的比较研究
董雪红, 田敏, 季策, 马文元, 张庆华     
上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306
摘要:副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原。为了比较7株不同来源的Vp对斑马鱼的毒力大小及致病能力,采用急性毒性试验测定96 h内Vp对斑马鱼的半数致死剂量(median lethal dosage, LD50),用累积法和Bliss法对比分析LD50指标。结果显示:VpKNH1无致病性。其他菌株感染后,均表现出腹部出血,腹腔有腹水,内脏出血等症状。用累积法和Bliss法分析人类致病菌株ATCC17802、ATCC33847及水生动物致病菌株Vp13、Vp31、Vp41、Vp57共6株不同来源的副溶血性弧菌的LD50,累积法计算得到的LD50分别为6.0×107、7.4×107、3.9×107、1.6×108、1.6×108、9.3×107 CFU/mL;Bliss法得到的LD50分别为:5.0×107、7.6×107、3.6×107、1.5×108、1.6×108、9.4×107 CFU/mL。研究结果发现两种计算方法得出的LD50数值差距较小,结果相似,不同菌株毒力强弱的顺序均为:Vp13> ATCC17802> ATCC33847> Vp57> Vp31≥ Vp41>VpKNH1。综上所述,累积法及Bliss法均可用于检测细菌毒力大小,但由于计算机的发展使得Bliss计算方法更加简便,为更优的选择。
研究亮点: ##LiangDian##
关键词副溶血性弧菌    斑马鱼    LD50    累积法    Bliss法    

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原,不仅是重要的海水动物弧菌病的病原[1, 2],给水产养殖业造成极大的经济损失,而且极易引起食物中毒、肠胃炎等疾病,严重的可导致败血症甚至死亡,对人类健康危害巨大[1, 2, 3]。该菌毒力因子众多,致病机理复杂。利用毒力基因,如直接耐热溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、TDH相关不耐热肠毒素(TDH-related heat-labile toxin,TRH)、不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)等评价细菌的致病特性已得到普遍认可[4, 5, 6],但运用这些毒力因子进行检测仍不能较好地判断不同菌株之间的毒力差异。最好最直接的方法是运用动物模型来进行半数致死剂量(median lethal dosage,LD50)的测定。LD50的概念最早于1927年由英国生物学家TREVE提出,用导致一半动物死亡的剂量来表示药物的毒性大小。根据医学主题词表的定义,LD50是指能杀死一半试验总体的有害物质、有毒物质或游离辐射的剂量。一般是用有毒物质质量和实验生物质量之比进行表示(mg/kg或CFU/mL)。

LD50现今已经广泛应用于医学、药学、动物医学(兽医学)、植物医学(植物保护学)、微生物学、生态学、毒理学等生命科学研究领域,成为衡量毒性大小的重要参数,在病原菌(包括人类、动植物的病原菌)的毒力评价中成为经典的方法,很难被替代[7]。目前较为常用的方法有3种:一种是改良寇氏法,但要求是正态分布[8, 9, 10],即最低剂量呈现反应率0%(Pn=0),最高剂量出现反应率100%(Pm=1),才能得到精确结果;一种是Bliss法[11],计算比较精确可靠,卫生部要求新药必须用Bliss法进行LD50测定评估;第3种方法是累积法,累积法也称ReeD-Muench法[12],在微生物学中比较常用[13],但结果比较粗略。

斑马鱼作为有效的人类传染病模型[14, 15]和水生病原菌疾病模型[16]具有明显的优势:成鱼体型较小,一般体长4~6 cm;生长发育快,受精后24 h主要器官原基基本形成;生长周期短,3~4个月即性成熟,且易于饲养。本文运用累积法、Bliss法,利用斑马鱼模型比较来源于人类、环境和水生动物的7株Vp的毒力大小,以期为Vp的致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验用鱼

实验所用斑马鱼为同一种系,均为AB系斑马鱼,购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所斑马鱼平台。所用斑马鱼约为4 cm,10月龄,大小、健康状况基本相同。实验前至少驯养7 d,使适应实验环境,但不适宜长期饲养(<2个月),实验前停食1 d,以防剩余的饵料及粪便影响水质。驯养期间,死亡率不得超过5%,否则需重新更换斑马鱼进行驯养。养殖方法参照WESTERFIELD[17](或http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)进行。

1.2 实验菌株

副溶血性弧菌ATCC17802、VpKNH1由加州大学洛杉矶分校(University of California,Los Angeles,UCLA)王艳玲博士惠赠,ATCC33847、Vp13、Vp31、Vp41、Vp57由上海海洋大学赵勇教授惠赠,其中后4种菌株均分离自南美白对虾。

1.3 主要试剂

主要试剂:硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)(北京路桥技术有限责任公司,CM402);胰蛋白胨(上海生工生物工程有限公司,73049-73-7);酵母膏(上海生工生物工程有限公司,8013-01-2);Tris(amresco,77-86-1);氯化钠(Sigma,7647-14-5)。

LBS液体培养基 (1 L):950 mL 蒸馏水,50 mL 1 mol/L Tris pH 7.5,10 g 胰蛋白胨(tryptone),5 g酵母膏(yeast extract),20 g NaCl。

1.4 主要仪器

Milli-Q Direct 8超纯水系统(品牌:Millipore,型号:Milli-Q Direct 8),离心机(品牌:eppendorf,型号:5810R),恒温摇床(品牌:Innova,型号:40R)。

1.5 菌液准备

将-80 ℃冰箱终浓度为15%甘油保存的7株副溶血性弧菌在TCBS平板上分离纯化,37 ℃培养箱内培养过夜。挑取单克隆接种到3 mL LBS液体培养基,置于37 ℃摇床,200 r/min培养过夜。将过夜菌液重新接种到新的LBS液体培养基摇菌,16 h左右测OD600,平板计数后备用。将OD600为1.26的菌液(约1.6×108 CFU/mL)4 000 r/min离心10 min,弃上清,用0.85%生理盐水清洗沉淀3遍,加入1/100 LBS体积的0.85%生理盐水悬浮沉淀,菌液浓度为1.60×1010CFU/mL,并将此菌液进行10-1、10-2、10-3、10-4倍稀释得到浓度分别为1.6×109、1.6×108、1.6×107和1.6×106 CFU/mL的菌液备用。

1.6 Vp人工感染斑马鱼的预实验

为确定正式试验所需浓度范围,我们选取较大范围的浓度梯度,各浓度分别为1.6×1010、1.6×109、1.6×108、1.6×107和1.6×106 CFU/mL。每个浓度随机3尾鱼,不设平行组,实验持续48~96 h。每日至少两次记录各容器内的死亡率,并及时取出死鱼。求出24 h 100%死亡的浓度和96 h无死亡的浓度。如果依此预实验结果无法确定正式实验所需的浓度范围,应另选其他浓度范围再次进行预实验。

1.7 Vp人工感染斑马鱼的正式实验

根据预实验结果3倍梯度稀释浓度为1.6×109 CFU/mL的菌液,使浓度梯度分别为5.3×108、1.8×108、6.0×107、2.0×107和6.7×106 CFU/mL,进行斑马鱼感染实验。采用腹腔注射的人工感染方式,每组10尾斑马鱼,每尾鱼10 μL菌悬液。同时设阴性对照组,注射等量0.85%生理盐水。每组设3个平行实验。接种后,各组分开饲养于不同的水族箱中,定时观察。统计12、24、36、48、72及96 h的累积死亡数,死亡数取3个平行数据的平均值。

1.8 LD50的计算方法

ReeD-Muench方法:参照顾兵等[18]的实验方法进行。要求每组实验动物数量相等,并且剂量呈等比数列的剂量假定一动物感染较低稀释度的菌液,如仍能生存,则在感染较高稀释度时,也应当生存,所以积累总计栏内,各组应生存动物总数是由感染较低稀释度而生存的动物数向感染较高稀释度而生存的动物数累加而得。相反若一动物死于较高稀释度的菌液,则应死于较低的稀释度,所以总计死亡动物数时,是由较高稀释度致死的数目向较低稀释度致死的数目累加而得。故先将实验中的死亡动物数和存活动物数进行累加求和,再用此两者的数值计算每个浓度下的累积死亡率。由于累积的死亡率的线性较不累积时的要好,故此方法只运用一个累积死亡率大于50%和一个小于50%的2组数据即可得到一条直线,并将此条直线近似认为是死亡率和剂量对数相关的直线,50%死亡率的点在该直线上。根据数学方法算出一个比例系数r,取反对数即可得到LD50

式中:a为大于50%的死亡率;m为其对应的剂量对数;b为小于50%的死亡率;n为其对应的剂量对数。累积法计算较方便,故较多地应用于微生物学,特别是在稀释分析中;可粗略进行LD50的判断,但误差较大。

Bliss法:Bliss法又称加权法,参照顾兵等[18]和黎七雄等[19]的实验方法进行。

将实验所得存活率由百分率与概率单位转换表查出其概率单位,又称经验概率单位(yem)。

在坐标纸上,用对数剂量与经验概率单位 (yem)构成点绘制直线,并由直线找出各对数剂量相当的概率单位即期望概率单位(Y)。计算作业概率单位(y),对Y值进行校正:

式中:(Y-P/Z)是所有动物都生存时的概率单位,全距(1/Z)为极大值与极小值间的距离;P为实验所得动物死亡率,各参数由作业概率单位的极大值、极小值、全距与权重系数表查出;将各点进行加权(nw),用X2作直线性检验。如果各个点不显著偏离直线,即可进行回归直线方程计算,如果由直线方程得到的期望概率单位( Y1)与前次的不够接近,则需对Y1再次校正; 将各X值代入方程Y2= $\bar y$ + b (X - $\bar x$ )。反应率等于0.5时,将Y2= 5代入方程: Y2= $\bar y$ + b(X - $\bar x$ )得到的值即为 LD50的对数值。

Bliss法是目前最为可靠、精确的LD50测定方法。早期,因为其计算过程太过烦琐,故难以得到推广。但随着计算机的普及,研究者更多运用基于Bliss法的计算程序计算LD50。本文亦运用Bliss软件计算LD50

2 结果 2.1 预实验结果

预试验结果显示VpKNH1没有致病性,注射该菌的斑马鱼未见死亡,所以正式实验时只用其余6株Vp进行感染。被Vp感染死亡的斑马鱼腹部充血,腹腔内有腹水,内脏器官出血。并且得出24 h 100%死亡率为1.6×109 CFU/mL、96 h内无死亡的浓度为1.6×106 CFU/mL。正式实验菌液浓度在此两浓度之间进行设定。

2.2 ATCC17802感染斑马鱼LD50的计算结果

人类致病菌株ATCC17802感染斑马鱼后,试验结果显示,当注射浓度为5.3×108 CFU/mL的菌液12 h时,斑马鱼累积死亡数即过半,36 h后全部死亡,为急性感染。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法从表中直接得出96 h时ATCC17802菌株的LD50为6.0×107 CFU/mL(表1)。运用Bliss法计算得到的LD50为5.0×107 CFU/mL(表2)。

表1 累积法计算ATCC17802感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 1 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrafish infected by ATCC17802 at 96 h

表2 Bliss法计算ATCC17802感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 2 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by ATCC17802 at 96h

回归方程Y=-2.91+1.03X;Y为期望概率单位;X为剂量对数。以下回归方程中出现的变量意义与此相同。半数致死量LD50=5.0×107 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=(1.6×107-1.3×108) CFU/mL。

2.3 Vp13感染斑马鱼LD50的计算结果

水生动物致病菌株Vp13感染斑马鱼后,试验结果显示,当注射浓度为5.3×108 CFU/mL的菌液12 h时,斑马鱼即全部死亡,为急性感染。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法直接得出96 h时Vp13菌株的LD50为3.9×107 CFU/mL(表3)。运用Bliss法计算得到的LD50为3.6×107 CFU/mL(表4)。

表3 累积法计算Vp13感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 3 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp13 at 96 h

表4 Bliss法计算Vp13感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 4 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp13 at 96 h

50%的死亡率对应的剂量浓度位于6.0×107 CFU/mL与2.0×107 CFU/mL之间。死亡率每增加一个百分点,剂量对数增加:(7.8-7.3)/ (64.7-27.8) =0.01。死亡率从27.8%增加到50%,剂量对数增加为:0.01×(50-27.8)=0.3。lgLD50=0.3+7.3=7.6,取反对数得LD50=3.9×107 CFU/mL。

回归方程Y=-5.97+1.45X,半数致死量 LD50=3.6×107 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=(1.6×107~7.2×107) CFU/mL。

2.4 ATCC33847感染斑马鱼LD50的计算结果

人类致病菌株ATCC33847感染斑马鱼后,试验结果显示,当注射浓度为5.3×108 CFU/mL的菌液12 h时,斑马鱼死亡率即达到90%,为急性感染。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法计算得出96 h时ATCC33847菌株的LD50为7.4×107 CFU/mL(表5)。运用Bliss法计算得到的LD50为7.6×107 CFU/mL(表6)。

表5 累积法计算ATCC33847感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 5 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrafish infected by ATCC33847 at 96 h

表6 Bliss法计算ATCC33847感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 6 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by ATCC33847 at 96 h

50%的死亡率对应的剂量浓度位于1.8×108 CFU/mL与 6.0×107 CFU/mL之间。死亡率每增加一个百分点,剂量对数增加:(8.3-7.8)/ (73.7-44.4) =0.02。死亡率从27.8%增加到50%,剂量对数增加为:0.02×(50-44.4)=0.09。lgLD50=0.1+7.8=7.9,取反对数得LD50=7.4×107 CFU/mL。

回归方程Y=-5.15+1.29X,半数致死量 LD50=7.6×107 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=(3.5×107~1.8×108) CFU/mL。

2.5 Vp57感染斑马鱼LD50的计算结果

水生致病菌Vp57感染斑马鱼后,结果显示,当注射菌液浓度为5.3×108 CFU/mL时,12 h的死亡率即达到80%,为急性感染。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法计算得出96 h时Vp57菌株的LD50为9.3×107 CFU/mL(表7)。运用Bliss法计算得到的LD50为9.4×107 CFU/mL(表8)。

表7 累积法计算Vp57感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 7 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp57 at 96 h

表8 Bliss法计算Vp57感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 8 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp57 at 96 h

50%的死亡率对应的剂量浓度位于1.8×108 CFU/mL与 6.0×107 CFU/mL之间。死亡率每增加一个百分点,剂量对数增加:(8.3-7.8)/ (75-33.3)=0.01。死亡率从27.8%增加到50%,剂量对数增加为:0.01×(50-33.3)=0.2。lgLD50=0.2+7.8=8.0,取反对数得LD50=9.3×107 CFU/mL。

回归方程Y=-8.66+1.71X,半数致死量LD50=9.5×107 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=5.1×107-1.9×108 CFU/mL。

2.6 Vp31感染斑马鱼LD50的计算结果

水生致病菌Vp31感染斑马鱼后,结果显示,当注射菌液浓度为5.3×108 CFU/mL时,12 h的死亡率达到70%,为急性感染。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法计算得出96 h时Vp31菌株的LD50为1.6×108 CFU/mL(表9)。运用Bliss法计算得到的LD50为1.5×108 CFU/mL(表10)。

表9 累积法计算Vp31感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 9 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrfish infected by Vp31 at 96 h

表10 Bliss法计算Vp31感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 10 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp31 at 96 h

50%的死亡率对应的剂量浓度位于1.8×108 CFU/mL与 6.0×107 CFU/mL之间。死亡率每增加一个百分点,剂量对数增加:(8.3-7.8)/ (53.3-22.2) =0.02。死亡率从27.8%增加到50%,剂量对数增加为:0.02×(50-22.2)=0.4。lgLD50=0.4+7.8=8.2,取反对数得LD50=1.6×108 CFU/mL。

回归方程Y=-8.95+1.71X,半数致死量 LD50=1.5×108 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=(8.0×107-3.3×108) CFU/mL。

2.7 Vp41感染斑马鱼LD50的计算结果

水生致病菌Vp41感染斑马鱼后,结果显示,当注射菌液浓度为5.3×108 CFU/mL时,12 h的累积死亡率达到40%,毒力较弱。注射生理盐水的对照组感染期间未发现死亡现象。运用累积法计算得出96 h时Vp41菌株的LD50为1.6×108 CFU/mL(表11)。运用Bliss法计算得到的LD50为1.6×108 CFU/mL(表12)。

表11 累积法计算Vp41感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 11 ReeD-Muench method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp41 at 96 h

表12 Bliss法计算Vp41感染斑马鱼96 h LD50 Tab. 12 Bliss method to calculate LD50 of zebrafish infected by Vp41at 96 h

50%的死亡率对应的剂量浓度位于1.8×108 CFU/mL与 6.0×107 CFU/mL之间。死亡率每增加一个百分点,剂量对数增加:(8.3-7.8)/ (52.9-25) =0.02。死亡率从27.8%增加到50%,剂量对数增加为:0.02×(50-25)=0.43。lgLD50=0.4+7.8=8.2,取反对数得LD50=1.6×108 CFU/mL。

回归方程Y=-5.64+1.30Log(X),半数致死量 LD50=1.6×108 CFU/mL,LD50(Feiller校正)95%的可信限=(7.9×107~5.3×108) CFU/mL。

2.8 不同计算方法比较各菌株毒力结果

综上所述,用累积法计算得到Vp13、ATCC33847、ATCC17802、Vp57、Vp31和Vp41共6株菌株的LD50分别为:3.9×107、7.4×107、6.0×107、9.3×107、1.6×108和1.6×108 CFU/mL。用Bliss法计算得到此6株菌株的LD50分别为:3.6×107、7.6×107、5.0×107、9.4×107、1.5×108和1.6×108 CFU/mL。综合两种方法计算得到的7株Vp的毒力强弱均为:Vp13>ATCC17802>ATCC33847>Vp57>Vp31≥Vp41>VpKNH1(表13)。

表13 不同计算方法比较不同Vp菌株的毒力大小 Tab. 13 Different calculation method to compare the virulence of Vp strains
3 讨论

本文首次运用斑马鱼模型比较了来源于环境、人类宿主及水生动物宿主的7株副溶血性弧菌的毒力大小,这对于比较不同来源、含有不同致病基因的Vp毒力大小提供了良好的方法,为今后深入研究其致病机理奠定了理论依据。细菌毒力的检测方法主要包括:菌落形态分析、毒力因子基因水平、蛋白水平、细胞模型、动物模型等方法[19, 20],这些方法从不同层次和角度为细菌的致病性及细菌和宿主之间的相互作用提供了很多信息。目前用副溶血性弧菌的许多毒力基因,如tlh、trh、tdh等用于评价其毒力特征,但都不能给出定量的评价标准。LD50及类似概念,如半数致死浓度(median lethal concentration,LC50)、半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50)、半数效应浓度(median effective concentration,EC50)因能衡量毒性大小而成为重要的参考依据[7],现已广泛应用于生命科学研究领域。虽然早在1959年动物学家RUSSELL和微生物学家BURCH对动物实验提出代替(replacement)、改进(refinement)和减少(reduction)的“duc概念”,即在生命科学研究中应采取其他手段来代替动物实验,改进实验方法,减少动物数量和痛苦,提倡动物保护和动物福利,但动物实验目前仍无法完全被其他技术所替代[7]。因此,尽量减少动物用量,改进实验方法是毒理学评价发展的主要趋势。斑马鱼作为低等的脊椎动物,近年来成为感染性疾病的理想模型,正是符合以上发展趋势的结果[15]

目前LD50的计算方法有很多,如:寇氏法[8]、回归直线法[21]、序贯法[22]、霍恩氏法[23]又称目测图解法、改良寇氏法[9]、logistic模型法[24]、固定剂量法[25]等。其中以Bliss创建、后为FISHER、FINNEY所发展的加权概率单位法(又称Bliss法)在数理上最为严谨精密,成为标准的LD50计算方法[26, 27, 28]。尽管LD50测算方法经过几十年研究已有许多重要进展,但似乎目前还无法提出一种任何条件下都能令人满意的方法。本研究因结果不是正态分布,无法运用寇氏法进行计算,所以我们选用有代表性的累积法及Bliss法2种方法分别对6株致病性Vp进行毒力分析,发现这2种方法得到的LD50结果相似,有较好的吻合性。累积法计算方便,更多地运用在微生物学中,尤其在稀释分析中[13];但此法最大的缺点是不考虑操作误差,是近似值,使得计算结果不够精确,只可以作为实验过程中LD50的粗略判断。Bliss法是目前最为精确、可靠的LD50测定方法。由于其在数理上严谨精密,甚至称其为机率单位正规法。在早期,因为其计算过程太烦琐,很难推广。随着计算机的普及,研究者更多运用基于Bliss法的计算程序计算LD50[29, 30],使得Bliss方法计算过程更加简单准确,是计算LD50更好的选择。我们认为,Bliss法是评价6株Vp毒力强弱的很好方法。

虽然动物模型是最好最直接的测定LD50的方法,但若比较很多菌株的毒力,就需要大量的试验动物,如小鼠、大鼠、豚鼠或猪等,这样不但实验费用会明显提高,而且也会使工作量加大,浪费人力、物力和财力。而斑马鱼成鱼体型小,生长发育快,生长周期短且易于饲养,实验成本低廉,而且,斑马鱼具备天然免疫系统和获得性免疫系统,因此,近年来,用斑马鱼来替代以上实验动物进行感染性疾病模型成为普遍采用的理想方法。本研究结果表明斑马鱼对副溶血性弧菌致病菌株易感,可以用来测定LD50,评价其毒力大小。对比不同来源的致病菌结果发现人类致病菌和水生动物致病菌的LD50结果没有显著性差异。人类致病菌对斑马鱼也有致病性,表明两种宿主对副溶血性弧菌的易感性有平行关系,在一定程度上斑马鱼可以代替小鼠等实验动物作为研究副溶血性弧菌的动物模型。对比国内外的不同Vp毒力发现,Vp13菌株的致病力最强,而Vp41菌株的致病力最弱。这2株菌均为国内菌株。而3株国外菌株,除VpKNH1分离自夏威夷海域的环境样品,为无毒菌株外,ATCC33847、ATCC17802的毒力与其余3株国内菌株相似。对比发现,国外的2株Vp,ATCC17802含trh毒力基因,而VpKNH1不含毒力基因,没有溶血性。国内的4株Vp:Vp13、Vp31、Vp41及Vp57,均分离自南美白对虾,含有tdh。ATCC17802和ATCC33847均含tlh,不同之处在于trhtdh,但LD50指标反映的毒力接近,而对于含有tdh的Vp13和Vp41而言,LD50指标反映的毒力差异明显,所以,很难只依据毒力基因的有无判断细菌的致病性。虽然,细菌种属是菌株毒力的内在关键影响因素,但也因分离时间不同,所传代次不同,对其致病力有所影响,这些应在菌种使用和保藏过程中予以重视。

目前,对于应用斑马鱼进行LD50判断Vp的毒力大小还缺乏相应的标准。PARANJPYE等[31]采用腹腔注射的方式测定V. parahaemolyticus RIMD2210633菌株对斑马鱼的LD50为5.46×105 CFU/mL,NEELY等[32]采用腹腔和肌肉注射的方式,测定化脓链球菌S. pyogenesHSC5菌株对斑马鱼的LD50相似,均为103 CFU/mL。PRESSLY等[33]研究发现,斑马鱼腹腔注射104和105 CFU/mL的迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)死亡率分别为30%和60%。陆承平和陈怀青[34]对Ah 的毒力判断依据是,将LD50<105 CFU/mL者视为强毒株,LD50在106~107 CFU/mL者为中毒株,LD50>107CFU/mL者为弱毒株或无毒株。若根据该依据判断,这7株Vp都属于弱毒株或无毒株,主要原因可能是:(1)实验室多次传代造成毒力减弱,实验前未进行复壮;(2)实验菌株不是斑马鱼的原始病原菌,不同宿主传播致毒力减弱,有待深入研究。因此笔者认为,考虑到不同的试验动物以及不同种属的细菌,不同时间内的LD50反映的毒力强弱判断依据应有差异。对于Vp而言,今后需要在大样本调查的基础上,根据LD50指标建立合理的毒力判断标准。

总之,本文利用斑马鱼模式脊椎动物,采用LD50测定方法对7株不同来源的Vp进行了毒力比较,加深了毒力基因与其致病性的关系认识,为今后深入研究其致病机理奠定了理论依据。

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The comparative study on the LD50 to evaluate the virulence of Vibrio parahaemolyticus using two calculation methods
DONG Xuehong, TIAN Min, JI Ce, MA Wenyuan, ZHANG Qinghua     
Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: The Vibrio parahaemolyticus(Vp) is paid much attention to as a zoonosis pathogen at present.In order to compare the virulence and pathogenicity of seven Vp strains from different sources, we used zebrafish as the model to test median lethal dosage (LD50)by acute toxicity experiment within 96h, and analyzed the data with ReeD-Muench method and Bliss method.The results suggested that the LD50 tested by ReeD-Muench method of human pathogenic bacteria (ATCC17802, ATCC33847) and aquatic animal pathogens(Vp13, Vp31, Vp41, Vp57)were 6.0×107, 7.4×107, 3.9×107, 1.6×108, 1.6×108, 9.3×107CFU/mL, respectively and 5.0×107,7.6×107,3.6×107,1.5×108,1.6×108,9.4×107 CFU/mL, respectively, with Bliss method. The results showed that these two kinds of calculation methods had little difference for the LD50, and the virulence of these seven different Vp strains were as follows: Vp13 > ATCC17802 > ATCC33847 > Vp57 > Vp31 > Vp41 > VpKNH1.To conclude, ReeD-Muench method and Bliss method can both be used to test Vp strains virulence.However, Bliss calculation method is more simple and accurate than the ReeD-Muench method with the development of computer technology.As a result, it is the better choice for LD50.
Key words: Vibrio parahaemolyticus    zebrafish    LD50    ReeD-Muench method    Bliss method