2016,
Vol. 25
2. 宁波检验检疫科学技术研究院, 浙江 宁波 315012;
3. 通威股份有限公司, 四川 成都 610041
罗非鱼是我国重要的水产养殖品种。由于受到养殖环境和水体微生物活动的影响，部分罗非鱼产品常会产生严重异味[1-2]。对异味物质的组成成分[3-4]、来源[5-7]和影响[8]进行研究后，发现土臭素(geosmin，GSM)和2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol，2-MIB)是造成土腥味和土霉味的两种关键物质。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)结合多种样品前处理技术可以高效准确地测定这两种化合物[9-11]。
研究还发现，以颤藻、鱼腥藻等蓝藻为首的浮游藻类和部分放线菌是造成水体中异味发生的微生物来源，并且对GSM和2-MIB的含量及分布造成影响[12-14]。王赛[15]认为养殖池塘的底质决定了水质和藻类的变化，进一步对养殖产品体内的异味含量产生作用。目前以藻类对异味物质影响的研究居于多数，而比较不同养殖方式与土腥味物质间关系的研究却鲜有报道。因此，本实验利用吹扫捕集结合气相色谱-质谱联用技术(P&T-GC-MS)检测罗非鱼池水中GSM和2-MIB的含量，比较养殖方式、养殖地区和养殖时间对养殖水体中两种土腥味物质的影响，为提高我国罗非鱼品质，改善养殖方式提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料气相色谱-质谱联用仪为Agilent 6890N Network GC System和5975 inert XL Mass Selective Detector (美国Agilent公司)；吹扫捕集装置为P & T Eclipse4660 ( 美国O I Analytical公司)。色谱纯甲醇；异味标准物质为：二甲基异莰醇(2-MIB)和土臭味素(GSM)标准品浓度均为100 μg/mL，溶于甲醇保存(美国SUPELCO公司)。
于2011年对我国广东茂名及海南文昌地区的207家罗非鱼养殖场的养殖状况进行现场采访调查[16]，并建立数据库。本文通过该数据库，使用分层随机抽样法，分别于2013年5月、8月与10月期间，在茂名区域随机选择15个罗非鱼养殖场进行水样采集，其中包括3处水库养殖，6处立体养殖(罗非鱼和家猪立体养殖)和6处精养池塘；海南文昌地区随机选择7个，其中包括1处水库养殖和6处精养池塘。水样采集深度取水面下0.5 m，采水器采集后盛满在塑料采集瓶里，-20 ℃条件保存，于分析前解冻。
1.2 实验方法将2-MIB和GSM两种标准品原溶液等体积混合后，用水稀释得到各浓度的标准贮备液，随后再逐级稀释得到工作贮备液，浓度分别为1、5、10、50、100 μg/L。取5 mL溶液进入吹扫捕集装置进行吹扫，每组浓度重复进样6次，以目标物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作曲线。在样品中加入外标10 μg/L，检测实验方法回收率及精密度。样品水样取5 mL，加入1 g氯化钠并完全溶解，利用气密性注射器直接进入吹扫捕集装置进行分析。
1.3 检测仪器设置吹扫捕集装置采用高纯氮气为吹扫载气(99.9%)，捕集阱为Trap9；25 ℃下吹扫11 min，吹扫流速40 mL/min；脱附解析温度为180 ℃，脱附时间4 min；烘焙温度200 ℃，烘焙时间20 min，剩余参数参照仪器说明。
GC-MS分析条件为：色谱柱型号：HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent19091J-433)。不分流进样，进样口温度为220 ℃，起始柱温40 ℃，保持2 min；之后以20 ℃/min速率逐渐提升并最终达到220 ℃，持续15 min。离子源温度230 ℃，四极杆温度为 150 ℃，接口温度280 ℃，载气为高纯氦气(99.999%)，流速1 mL/min；采用质谱选择离子方式，确定m/z 95为2-MIB定量特征离子，出峰时间6.48 min；m/z112为GSM定量特征离子，出峰时间为8.08 min。
1.4 数据分析采用SPSS 18软件对测得的实验数据进行单因子方差分析，统计结果以平均值±标准差(x±SD)的形式表示，设显著性水平为P< 0.05。以Excel工具制作图表。
2 结果与分析 2.1 2-MIB和GSM标准物质及样品检测结果表 1显示了两种检测化合物的部分参数，2-MIB与GSM的工作曲线分别为y=290.84x+298.89和y=66.108x+78.78，相关系数(r)均大于0.995。回收率范围从87.3%至103.8%；测定了10 μg/L 浓度下2-MIB和GSM的相对标准偏差(RSD)，分别为4.7%和4.3%，参数结果表明实验方法满足检测需求。
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表 1 PT & GC-MS系统的参数检验 Tab.1 The selected ions,retention time,linearity,recovery and relative standard deviation for PT & GC-MS system |
5月、8月和10月期间3种养殖方式的水体中2-MIB与GSM的含量测定结果见表 2和表 3。其中文昌水库采样点未检测到2-MIB和GSM，茂名水库采样点在5月未检测出GSM。在检出的样品中，2-MIB浓度变化为4.57~65.61 μg/L；检出GSM的浓度变化为2.93~11.77 μg/L。由于采样池塘随机分布，其水化性质不同，因此造成组内差异较大。
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表 2 罗非鱼不同养殖水体中2-MIB含量分布 Tab.2 Concentration of 2-MIB in the different tilapia culture waters |
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表 3 罗非鱼不同养殖水体中GSM含量分布 Tab.3 Concentration of GSM in the different tilapia culture waters |
对比三类养殖模式水体中的平均2-MIB含量发现，同一时期内，水库养殖水中的2-MIB含量最低，而立体养殖模式含量最高(图 1)，且3种模式两两之间均存在显著差异(P< 0.05)。鱼猪立体养殖池塘水体中2-MIB浓度在8月及10月期间大都高于10 μg/L，超过人类能感受到异味的嗅觉阈值。在比较同一养殖模式下不同时期水中2-MIB浓度后发现，5月份最低，8月上升，10月则普遍下降，基本呈现低-高-低的变化趋势。除茂名立体养殖模式的5月与8月之间存在显著差异(P< 0.05)外，其他模式内部在不同时间段之间并没有发现明显差异(表 2)。
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图 1 罗非鱼不同养殖模式的水体2-MIB浓度变化
Fig. 1 Concentration of 2-MIB in three types of tilapia culture waters
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全投料精养作为两地主要养殖方式，茂名纯投料养殖鱼池的平均2-MIB浓度为16.33~24.84 μg/L，文昌地区2-MIB浓度为9.343~15.17 μg/L，前者均高于后者，但是同时期内二者之间并未发现显著差异(表 2)。
2.3 水体中GSM含量与养殖模式、时间、养殖地点的关系不同模式3个时期共66个样本中，有56个鱼池水体中测量到GSM，占84.8%，除5月的水库采样点未检测到GSM存在外，其他时期各类养殖模式下测量到的GSM浓度水平也都较低(图 2)，基本低于人类嗅阈值。结果显示，3种模式之间不存在显著差异；3个时期的变化为：水体中 5月平均GSM最低，8月最高，二者间没有显著差异(表 3)；同样，同时期文昌与茂名的平均GSM含量之间也未发现差异(表 3)。
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图 2 罗非鱼不同养殖模式的水体GSM浓度变化
Fig. 2 Concentration of GSM in three types of tilapia culture waters
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水体的富营养化程度与水体异味的产生存在关联[17-18]。有研究认为，蓝藻的丰度与2-MIB呈正相关性，以及“水华”的形成也容易导致异味问题的发生[2, 19-20]。养殖环境中由于各种污染物排入水中，导致水中营养物浓度增大，这为某些浮游藻类和放线菌的大量生长提供了条件，它们能释放导致异味产生的次生化合物[17-18]。然而，能产生异味的微生物种类却不尽相同，即使是同一种微生物，在不同生长过程中产生的作用也会不同[1, 14, 21]。环境因素间互相促进、作用以及掩盖，使得异味物质成分和产源复杂化。因此本实验将养殖环境作为一个整体，比较不同养殖模式下异味物质的变化规律。结果表明，不同时期内各养殖模式之间的平均2-MIB浓度均具有显著差异；其中水库养殖最低，鱼猪立体养殖最高，且超过人类嗅阈值。由于茂名地区有大量鱼猪鱼禽混养池塘，陆地上牲畜或禽类排泄物等直接进入鱼池，会导致水体富营养化加剧，使得水中异味物质浓度上升。因而养殖模式的不同会对养殖水体的2-MIB及GSM物质含量造成影响。
3.2 GSM与2-MIB和养殖季节的关系两处地区5月期间，2-MIB和GSM浓度水平最低，至8月最高，8至10月期间总体上为下降趋势，仅立体养殖模式中水体的2-MIB含量在8月期间显著提升。除此之外，不同月份间异味含量并没有显著的差异。YAGI[22]对琵琶湖南部库区异味问题的研究中指出，2-MIB和GSM通常出现在7月到10月期间。WESTETHOFF等[23]对水库的研究也表明，2-MIB浓度到夏天时有增加的趋势。通常情况下，随着鱼类摄食生长和温度上升，水质环境变差，浮游植物增加，藻类从生长到死亡转换周期短，尤其在夏季时最为明显，而此时也是鱼池里异味最重的时间段。本实验的检测结果符合此类趋势，说明季节变化能够引起异味物质含量的改变。
3.3 GSM与2-MIB和养殖地区的关系美国学者[24]早期对美国东南部4个州485个养鲶池异味物质分析显示：路易斯安那州2-MIB存在最普遍，同时阿拉巴马州则是GSM最为普遍。徐立蒲等[25]在对北京淡水鱼池和天津寡盐水鱼池进行了研究对比后发现，北京淡水鱼池中的主要土腥异味物质成分是GSM，天津寡盐水鱼池水中主要异味物质成分是2-MIB。不同地区的土腥味物质组成及含量有所差别。本实验检出异味的池塘中，2-MIB 含量基本高于GSM含量。故推断文昌和茂名地区罗非鱼养殖池塘水中2-MIB为主要土腥味物质，这与桂佳对广东33座水库的调查结果相符合[20]。在池塘精养模式下，虽然同时期茂名地区2-MIB及GSM浓度始终高于文昌地区，但二者间并没有显著差异，故不能仅依据这些数据来证明两地养殖水质存在优劣之分。
不同罗非鱼养殖地区的土质(底泥)、水质和气候等存在差异，这些差异必然使异味物质成分和来源复杂化；环境因素间也能互相促进、作用、抑制甚至掩盖异味物质的形成和变化。通过长期稳定的监测以及科学的统计分析有助于探究环境对异味的影响作用，这有待进一步深入研究。
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2. Ningbo Academy of Inspection and Quarantine of the P. R. China, Ningbo 315012, Zhejiang, China;
3. Tongwei Group Co. Ltd, Chengdu 610041, Sichuan, China