褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)属鲽形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、牙鲆属(Paralichthys),是主要的广盐性底栖鱼类,主要分布于我国的黄渤海、东海及朝鲜半岛、日本、俄国远东沿岸等地区[1]。由于褐牙鲆生长速度较快、个体大、肉质细嫩、营养丰富,因此成为国内外主要的海水增养殖鱼类之一。作为典型的广盐性鱼类,褐牙鲆在春季繁殖时期由深海洄游至浅水海域等地区进行产卵繁殖,常出现迁徙到河口水域的现象,而该区域常常遭受淡水河流的冲击[2, 3, 4],鱼类生存水体的盐度将发生相应的改变。基于这些情况,褐牙鲆为了保持机体内环境的稳态,必须进行渗透压调节[5]。
广盐性鱼类耐盐性较强,强而快速的渗透压调节能力使鱼类迅速适应各种情况引起的盐度变化[6],在这个过程中鱼类下丘脑-垂体-肾上腺(HPI)轴被激活,分泌多种激素来调整机体以适应多变的生活环境。皮质醇(cortisol,COR)和生长激素(growth hormone,GH)是鱼类适应高盐水体的重要激素,被认为有提高硬骨鱼对海水高盐环境耐受力的作用,促进鳃氯细胞增殖分化,增强Na+-K+-ATPase(NKA)、钠钾氯转运蛋白活性及对水的吸收和离子排放能力[7, 8]。催乳素(prolactin,PRL)与GH均为垂体多肽激素,具有一个共同结构,通过与跨膜域受体结合形成二聚体发挥生物学功能,除参与生长繁殖外,也影响生物体内渗透压调节,但PRL与GH在渗透压调节中的功能不同,它是淡水及广盐性硬骨鱼类适应淡水、咸淡水生活并降低鱼体渗透性的重要调节激素[9, 10]。但是目前对鱼类适应盐度变化的研究主要集中在幼鱼,而关于成鱼在低盐适应方面的研究较少,本实验通过探讨盐度骤降对褐牙鲆成鱼血浆中渗透压、离子含量以及激素的影响为研究广盐性鱼类在低盐环境中渗透压调节机理提供基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料及驯化实验用褐牙鲆购自中国水产科学研究院北戴河中心实验站昌黎养殖场,为1.5年龄同一家系全雌褐牙鲆。实验前褐牙鲆暂养于圆柱形水池中,直径为7 m,高为2 m,养殖用水采用过滤海水,盐度30,水温(20±1) ℃,24 h流水充氧,保持自然光照。每天下午17:00 准时定点投喂鲜活杂鱼,第二天7:00清池吸除残饵,暂养1周。
1.2 盐度胁迫实验设计实验挑选体型相近、健康无疾病、活力强,体重(600±100) g的褐牙鲆。实验用缸为圆柱形流水缸(直径90 cm,高60 cm)。盐度30为对照组、盐度3为实验组,盐度3的低盐海水使用曝气自来水和砂滤自然海水配置。盐度胁迫实验期间停止喂食,水质管理不变。
暂养期结束后,将褐牙鲆随机分别放入盐度30海水对照组实验缸和盐度3低盐海水实验组实验缸中,一个实验组6个平行实验缸,每个实验缸放置1条褐牙鲆。
1.3 样品采集与分析在转移前0 h取空白组样品,实验开始后分别于8 h、1 d、2 d、5 d、8 d和14 d采集对照组和实验组样品。将褐牙鲆迅速捞出并擦干体表水分和粘液,断尾取血,用带有肝素钠抗凝剂的离心管收集1 mL,4 000 r/min、4 ℃ 离心15 min,取上清液,迅速放置于-80 ℃冰箱中保存待测。
血浆COR、PRL、GH采用放射性免疫法(RIA)在西安核仪厂XH6080放免仪测定(试剂盒购自北京北方生物技术研究所),血浆渗透压在露点渗透压仪(VAPRO PRESSURE OSMOMETER-5200,美国)测定,血浆Na+、K+、Cl-浓度的测定使用离子色谱仪(THERMO SCIENTIFIC DIONEX ICS-900,美国)。
1.4 数据处理用GraphPad Prism 5.0 Demo和SPSS 17.0软件进行数据统计分析。对实验数据进行单因子方差分析,并对不同处理间的数据进行Duncan氏多重比较,以P< 0.05作为差异显著的标准,实验数据用平均值±标准误表示。
2 结果 2.1 低盐胁迫对褐牙鲆渗透压的影响表1数据显示,0 h空白组血浆渗透压平均水平为(355.18±3.30) mmol/kg,与对照组各处理时间相比无显著性差异;在转移至盐度3的海水后,血浆渗透压即呈下降趋势,并在1 d时显著下降至最低,为(315.50±5.63) mmol/kg,渗透压在2 d时有小幅度回升,但低于对照组,并在此后维持在322~338 mmol/kg之间,且在2、5、8和14 d显著低于对照组(P< 0.05)。
如表2所示,转移后,对照组中血浆Na+含量随时间变化在140~180 mmol/L之间波动,与空白组相比无显著差异;而在转移至盐度3的海水后,血浆Na+含量8 h时显著下降,为(117.82±13.84)mmol/L,在随后几天保持在该水平,并呈现小幅度地上下浮动,且在1、5、8和14 d显著低于对照组(P< 0.05)。
血浆K+浓度在对照组各处理间虽有差值,但组间以及与空白组无差异;转移至盐度3后血浆K+逐渐上升,并在1 d时增至最高值(0.83±0.03)mmol/L,并显著高于同时期对照组(P< 0.05),在2 d时下降至0 h空白组水平且稍高于对照组,并在之后保持平衡。
对照组与空白组的血浆Cl-浓度无显著性差异;转入盐度3后,8 h时血浆Cl-浓度开始下降并在1 d下降至最低,为(116.19±3.17)mmol/L,随后维持稳定水平,并低于对照组,并在1、5和14 d差异显著(P< 0.05),血浆Cl-与Na+浓度的变化趋势相近。
2.3 低盐胁迫对皮质醇、生长激素和催乳素等激素的影响由表3可知,空白组血浆COR为(8.92±0.79) ng/mL,与对照组无显著差异,且对照组COR含量维持在一个相对稳定的水平;转入盐度3的海水后,血浆COR在1 d时升至最高值,为(10.33±0.98) ng/mL,但与对照组无显著性差异,在2 d时下降至(5.44±0.38) ng/mL,显著低于对照组(P< 0.05),在随后胁迫时间里,实验组COR稳定在较低水平。
对照组血浆GH在1 d时显著升高并高于同期实验组,为(11.68±1.24)ng/mL(P< 0.05),2 d后逐渐回降并稳定在空白组水平;实验组中血浆GH在处理初期略有下降,之后稳定,除1 d外,实验组褐牙鲆血浆GH各处理时间与对照组和空白组无显著性差异。
空白组血浆PRL为(1 253.00±84.54)μU/mL,浓度虽高但与对照组各处理间相比无显著差异;而转移到盐度3的海水后,PRL浓度在短时间内小幅度降低,在2 d显著升高达到最高值后稳定,并在2、5、8和14 d显著高于相同处理时间的对照组(P< 0.05),但在8 d和14 d时血浆PRL与胁迫处理前期相比有小幅下降趋势。
3 讨论硬骨鱼对盐度骤变的适应主要分为两个过程:一是被动地对外界环境进行适应阶段,这一过程将诱导激发鱼类机体渗透压调节生理机制的改变;二是神经内分泌系统参与其中,从而对渗透压进行主动调节[11]。渗透压调节至稳态所需时间因物种、个体发育时期及盐度变化范围不同而有所差异[11, 12, 13],银鲳幼鱼(Pampus argenteus)由盐度36进入低盐度25及14水体后,血浆渗透压在2~3 d内稳定,且随着水体盐度的下降而下降,盐度变化与渗透压呈正相关 [12],在对军曹鱼(Rachycentron canadum)稚鱼的急性盐度胁迫过程中,由盐度37的海水进入到盐度5以及淡水后,在3 h内渗透压下降后并经过一个小幅度的回升后降至一个稳定的水平[13]。在本实验中褐牙鲆成鱼在从盐度为30转移至3的急性降盐过程中,褐牙鲆未出现死亡现象,并随着盐度的下降,渗透压随之下降,并在1 d下降后同样经过一个小幅度回升的主动适应后达到稳定水平,与上述军曹鱼低盐胁迫实验所得结果相似。潘鲁青[11]在对褐牙鲆幼鱼急性盐度实验亦有此变化规律,但褐牙鲆幼鱼在经过3 d的应激期后又经过3 d调整后才最终达到稳定状态,而本实验褐牙鲆成鱼在经过2 d的适应调整后就达到了一个稳态,说明褐牙鲆成鱼相对幼鱼具有更强的渗透压调节能力。
硬骨鱼机体在应对环境变化时,平衡机体渗透压主要是通过水与Na+、K+、Cl-等离子的摄入与排出[14],且大多数硬骨鱼体内Na+和Cl-含量同环境盐度和渗透压的变化趋势相似[15, 16, 17]。发现广盐性雀鳝鱼(Atractosteus spatula)幼鱼分别在盐度0、8、16和24的水体中养殖30 d后,血浆Na+和Cl-含量随盐度增高而显著增加[17]。而当广盐性海水鱼类进入淡水后,鱼鳃的NKA活性降低,减少了细胞内Na+的泵出及K+的吸收,从而维持内环境与外界水体中盐离子浓度平衡[14]。军曹鱼(R. canadum)稚鱼在急性低盐胁迫过程中,血清渗透压、Na+和Cl-浓度与盐度呈线性正相关,K+浓度呈负相关[13],在本次褐牙鲆成鱼的急性低盐胁迫过程中也呈现出相同趋势,Na+和Cl-随盐度下降而降低,并随着时间的延长趋于稳定,而血浆K+浓度也在盐度3的海水1 d时显著高于对照组,但施氏鲟幼鱼在高盐度15和20组的K+浓度基本保持不变[17]。因此大多数广盐性硬骨鱼类体内Na+和Cl-随环境水体盐度变化而变化,并与渗透压相似,但K+浓度的波动则因鱼种属差别、盐度耐受性不同而出现不同结果。
当鱼体遭受外界环境压力时,HPI被激活,引起COR等应激激素的合成与释放,因而COR能反映生物体受到的应激刺激[18]。此外,COR作为鱼类适应海水环境的一个重要调节激素,能够促进鳃氯细胞的盐度耐受力和增殖分化、增强鳃NKA活性以及NKAα-subunit的基因表达[7, 8]。高盐和低盐适应的金头鲷(Sparus aurata)经注射COR后,鳃NKA活性显著增加,血浆离子和渗透压显著降低,而转移到低盐水体24 h后渗透压显著降低[19]。本实验显示褐牙鲆成鱼在由高盐海水进入低盐海水时血浆COR先上升后下降并趋于稳定,由于受到应激,HPI轴分泌COR至血液并于8~24 h内明显上升并达到最大值,随着时间延长和褐牙鲆对水体的适应,COR的含量下降至(5.44±0.38)ng/mL并低于对照组,表明机体在减少分泌并清除COR,因此鳃内的NKA活性降低,离子的交换吸收能力下降,达到机体内环境平衡。班红琴[20]对虹鳟(Oncorhynchus masou)盐度驯化过程中也发现将虹鳟转移至高盐时血清COR含量先上升后有所下降,但高于淡水。说明鱼体在盐度变化后首先应对受到的外界环境压力,后又转化为渗透压调节机制来适应水体盐度,与本实验的COR变化趋势一致,但本实验为低盐适应,所以COR的含量稳定后,显著低于海水对照组。
除COR参与到鱼类高盐环境中的渗透调节之外,GH、IGF-Ⅰ、甲状腺素等激素也直接或间接发挥作用[19, 21, 22, 23]。由于GH的促生长作用,GH能增强NKA及钠钾氯协同转运蛋白能力及鳃氯细胞体积及数量,进一步促进了鱼类对海水的适应。注射GH(0.02~0.2 μg/g)能够显著降低莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)血浆渗透压,增加鳃NKA活性[24]。同时在高盐环境适应7 d及更长时间的金头鲷、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)分泌到血液中的GH也高于低盐或淡水环境中的含量[19, 25, 26]。曾霖等[16]对大菱鲆(Panalichthys lethostigma)幼鱼在不同盐度下驯化的结果也表明GH在36盐度组最高,12盐度组最低。本实验结果血浆GH含量在1 d出现显著性差异,且有低盐水体中低于高盐水体的趋势,说明GH能在高渗环境适应中发挥重要的作用,在低盐度的水体中功能有所退化。
PRL与前两种激素的作用有所不同,它是广盐性鱼类适应淡水生活的重要调节激素,并且在鱼类适应海水环境时与COR和GH等激素形成拮抗作用[19]。PRL在降低NKA酶的活性,防止体内离子的流失和体外水分的进入,降低体内器官的渗透性等方面起到重要的作用[9,19]。对广盐性鱼类金头鲷体外注射绵羊PRL后发现,无论在盐度40还是盐度5的海水中,金头鲷鳃NKA活性均降低 [19]。而长期适应淡水的罗非鱼血浆PRL、脑垂体PRL mRNA和鳃组织中PRL受体的表达量同样显著高于盐水环境[27, 28]。将海水适应的罗非鱼由海水转移至淡水后,血浆PRL随时间逐渐上升在1 h和24 h显著高于海水组[29]。本实验褐牙鲆血浆PRL自2 d后高于对照组,并在2、5和8 d时有显著性差异,与上述结果一致。PRL在褐牙鲆成鱼的低盐适应过程中起着重要作用。而在进入低盐8 h和1 d时浓度较低可能是由于褐牙鲆机体处于应激状态,HPI轴起着更重要的作用,下丘脑垂体分泌的PRL暂被抑制,这种情况在上述的莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)低盐胁迫实验中也存在。
本实验结果显示,作为广盐性鱼类代表褐牙鲆成鱼在急性低盐胁迫环境下,神经内分泌参与调节,分泌的COR、PRL、GH等激素共同作用能迅速调整机体渗透压,Na+、Cl-、K+等机体内环境指标能够在1~2 d的短时间内适应低盐水体,且相对于幼鱼具有更加成熟完善的渗透压调节机制和渗透压调节能力,说明褐牙鲆成鱼能够应对并适应环境中由于各种原因造成的环境水体盐度的下降并生存下来,但其渗透压调节的机制及在低盐水体中生存生长状态仍需进一步研究。
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