四川动物  2022, Vol. 41 Issue (2): 154-161

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卢英楠, 袁悦, 孔雨晨, 吉欣宇, 史海涛, 洪美玲, 丁利
LU Yingnan, YUAN Yue, KONG Yuchen, JI Xinyu, SHI Haitao, HONG Meiling, DING Li
MAPKs信号通路抑制剂对红耳龟渗透压调节基因表达的影响
Effect of MAPKs Signaling Pathway Inhibitors on the Expression of Osmotic Pressure Regulation-Related Genes in Trachemys scripta elegans
四川动物, 2022, 41(2): 154-161
Sichuan Journal of Zoology, 2022, 41(2): 154-161
10.11984/j.issn.1000-7083.20210268

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收稿日期: 2021-08-02
接受日期: 2022-01-12
MAPKs信号通路抑制剂对红耳龟渗透压调节基因表达的影响
卢英楠 , 袁悦 , 孔雨晨 , 吉欣宇 , 史海涛 , 洪美玲 , 丁利 *     
热带岛屿生态学教育部重点实验室, 海南省热带动植物生态学重点实验室, 海口 571158
摘要:为了解丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路对盐度耐受下红耳龟Trachemys scripta elegans渗透压相关调节基因的影响,本研究应用JNK、ERK、p38MAPK抑制剂处理红耳龟后,置于淡水及5‰盐度水环境中,24 h后取肾脏组织,应用实时荧光定量PCR方法检测渗透压调节相关基因的mRNA相对表达量。结果表明,盐度环境下红耳龟肾脏中水通道蛋白3(AQP3)、热休克蛋白70(HSP70)、醛糖还原酶(AR)、糖皮质激素诱导蛋白激酶(SGK1)、肌醇转运蛋白(SMIT)的mRNA相对表达量显著升高,与淡水组差异显著(P<0.05)。不同浓度的JNK、ERK、p38MAPK抑制剂均能下调HSP70、AR的mRNA相对表达量,与未用抑制剂处理的5‰盐度组相比,差异显著(P<0.05);此外,ERK、p38MAPK抑制剂显著降低了AQP3 mRNA相对表达量(P<0.05),JNK、p38MAPK抑制剂显著降低了SMIT mRNA相对表达量(P<0.05);SGK1 mRNA相对表达量随p38MAPK抑制剂浓度的增加呈下降趋势,且在高浓度(25 mg·kg-1)下的表达量最低(P<0.05)。研究结果表明,红耳龟在适应半咸水过程中,MAPKs信号通路对渗透压有一定的调节作用。
关键词入侵物种    渗透压调节    盐度耐受    MAPK信号通路    抑制剂    
Effect of MAPKs Signaling Pathway Inhibitors on the Expression of Osmotic Pressure Regulation-Related Genes in Trachemys scripta elegans
LU Yingnan , YUAN Yue , KONG Yuchen , JI Xinyu , SHI Haitao , HONG Meiling , DING Li *     
Key Laboratory of Tropical Island Ecology, Ministry of Education, Hainan Key Laboratory of Tropical Animal and Plant Ecology, Haikou 571158, China
Abstract: In order to understand the effect of MAPKs signaling pathway on osmotic pressure regulation-related genes in saline-tolerant red-eared slider (Trachemys scripta elegans), three inhibitors (JNK, ERK and p38MAPK) were applied, and then the red-eared sliders were placed in freshwater and salinity water (5‰). After 24 h, the kidney tissue was extracted. The mRNA relative expression levels of osmotic pressure regulation-related genes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that compared to the freshwater group, the mRNA relative expression levels of AQP3, HSP70, AR, SGK1 and SMIT in red-eared sliders in salinity water were significantly increased (P < 0.05). By contrast, the presence of JNK, ERK and p38MAPK inhibitors significantly decreased the expression of HSP70 and AR (P < 0.05). In addition, both ERK and p38MAPK inhibitors could significantly reduce the expression of AQP3 (P < 0.05). JNK and p38MAPK inhibitors significantly decreased the expression of SMIT (P < 0.05). The relative expression level of SGK1 mRNA decreased with the increasing concentration of p38MAPK inhibitor and reached the lowest at the concentration of 25 mg·kg-1. This study suggests that MAPKs signaling pathway can regulate osmotic pressure of T. s. elegans in adapting to brackish water.
Keywords: invasive species    osmotic pressure regulation    salinity tolerance    MAPKs signaling pathway    inhibitors    

红耳龟Trachemys scripta elegans自20世纪80年代引入我国以来,对本地龟类的生存与繁殖造成了严重的威胁(Kai & Shi,2017)。该物种原生活在湖泊、沼泽、池塘、小溪等植被丰富的淡水环境中(Swingland & Gibbons,1991),但国内外研究发现红耳龟还可在咸水环境中生存(Morin,1990)。杨江波(2014)野外调查发现,红耳龟可在海南南渡江(盐度5.3‰~14.6‰)的半咸水环境中生存,幼体也可在半咸水附近的沙滩孵出;室内模拟实验也表明,红耳龟在盐度低于15‰的水环境中可存活3个月以上(Hong et al., 2014);环境中盐度的改变可显著影响动物渗透压调节(Brocker et al., 2012),红耳龟可通过离子和非离子的转运进行渗透压调节以应对环境盐度的增加(Hong et al., 2014),但红耳龟适应盐度环境的渗透压调节机制尚不清楚。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)及其亚家族信号通路在动物应对高渗胁迫渗透压调节过程中发挥重要作用(Cakir & Ballinger,2005Raja et al., 2017)。MAPKs由c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular-regulated kinase,ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)3类蛋白激酶组成,可通过磷酸化将上游信号传递至下游应答分子,通过级联反应直接或者间接进行盐度胁迫下的渗透压调节(Cakir & Ballinger,2005Raja et al., 2017)。目前,关于MAPKs信号通路在动物响应盐度应激中的研究集中在鱼类、两栖动物和哺乳动物,如将高渗溶液作用于日本鳗鲡Anguilla japonica鳃原代细胞(Chow & Wong,2011)、底鳉Fundulus heteroclitus鳃上皮细胞(Kültz & Avila,2001)后,JNK、ERK和p38MAPK活性均显著升高;对湖蛙Rana ridibunda心脏灌注过量NaCl溶液,p38MAPK活化,而低渗溶液刺激后p38MAPK变化不明显,说明p38MAPK在高渗调节中起重要作用(Aggeli et al., 2002)。也有研究表明,MAPKs信号通路在高渗条件下主要通过激活下游渗透压保护基因,如:糖皮质激素诱导蛋白激酶(SGK1)(Bell et al., 2000)、热休克蛋白70(HSP70)(Kim,2006)、肌醇转运蛋白(SMIT) (Bissonnette et al., 2008)、醛糖还原酶(AR)(Winges et al., 2016)、水通道蛋白3(AQP3)(Lei et al., 2017)等的高表达来发挥作用,以抵抗高渗带来的不利影响,在维持细胞稳态中发挥重要作用。

目前关于MAPKs信号通路是否参与龟类的渗透压调节以及是否对渗透压调节基因产生影响等尚不清楚。本研究将3种抑制剂(JNK、ERK、p38MAPK)作用于红耳龟,并对其进行盐度胁迫处理,探究MAPKs抑制剂对渗透压调节相关基因mRNA转录水平的影响,以期了解红耳龟在适应半咸水过程中MAPKs信号通路对渗透压的调节作用。

1 材料和方法 1.1 试验动物和饲养条件

红耳龟购自海口泓旺农业养殖有限公司。试验在海南师范大学生命科学学院龟鳖养殖室进行。试验前,将体型较统一、活力好、健康的幼龄个体(体质量120.37 g±10.25 g)驯养2周以适应养殖室环境。驯养期间1周喂食2次,并于喂食后24 h更换养殖水体,养殖水体pH7.45±0.26,溶解氧含量8.40 mg·L-1±0.31 mg·L-1。驯养结束后,分为淡水组(对照组)、淡水+MAPKs抑制剂(不同浓度)组、5‰盐度组、5‰盐度+MAPKs抑制剂(不同浓度)组,每组8只,组间体质量无显著性差异,试验期间停止喂食。

1.2 主要试剂

JNK抑制剂(SP600125)(货号:S1876)、MEK1/2抑制剂(U0126)(货号:S1901)、p38MAPK抑制剂(SB203580)(货号:S1863)、二甲基亚砜(DMSO)(货号:ST038)均购自上海碧云天生物技术有限公司。Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix(货号:RK21204)购自ABclonal Technology Co.,Ltd.。PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 试验方法 1.3.1 JNK抑制剂(SP600125)处理

将红耳龟随机分为8组,每组8只:淡水组、淡水+JNK抑制剂组(SP600125浓度:5 mg·kg-1、15 mg·kg-1、25 mg·kg-1)、5‰盐度组、5‰盐度+JNK抑制剂组(SP600125浓度:5 mg·kg-1、15 mg·kg-1、25 mg·kg-1)。SP600125使用DMSO溶解后腹腔注射,同时给淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

1.3.2 MEK1/2抑制剂(U0126)处理

将红耳龟随机分为8组,每组8只:淡水组、淡水+MEK1/2抑制剂组(U0126浓度:1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1)、5‰盐度组、5‰盐度+MEK1/2抑制剂组(U0126浓度:1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1)。U0126使用DMSO溶解后腹腔注射,同时给淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

1.3.3 p38MAPK抑制剂(SB203580)处理

将红耳龟随机分为8组,每组8只:淡水组、淡水+p38MAPK抑制剂组(SB203580浓度:5 mg·kg-1、15 mg·kg-1、25 mg·kg-1)、5‰盐度组、5‰盐度+p38MAPK抑制剂组(SB203580浓度:5 mg·kg-1、15 mg·kg-1、25 mg·kg-1)。SB203580使用DMSO溶解后腹腔注射,同时向淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

1.4 盐度处理及样品采集

抑制剂处理后,将红耳龟置于淡水和5‰盐度水环境中24 h,麻醉后处死,取肾脏组织,-80 ℃保存。

1.5 总RNA的提取和反转录

常规Trizol法提取样品总RNA,微量核酸蛋白定量仪NanoDropTMOne/OneC检测总RNA浓度和纯度。以1 μg的总RNA为模板进行反转录,反转录体系及条件参照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书。

1.6 实时荧光定量PCR

通过GenBank和实验室红耳龟转录组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117354) 确定基因序列,运用Primer-BLAST进行引物设计(表 1)。以内参基因β-actin为参照进行实时荧光定量PCR分析,反应体系参照Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒说明书,反应条件为:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环; 运用2-ΔΔCt法分析AQP3、HSP70、SMIT、SGK1、AR的mRNA相对表达量。

表 1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR
基因 GenBank登录号 引物序列(5'-3') 产物长度/bp
β-actin MH195268.1 F: GCACCCTGTGCTGCTTACA
R: CACAGTGTGGGTGACACCAT
190
AQP3 F: ACTAGTGAGGCAAGCACTGG
R: CACAGTCAAGAAGCCTCCGT
118
HSP70 XM_034778730.1 F: ACCTCTTCGCAGTGTTCTGG
R: GGCCTCATCTGCGTTCAAAG
157
SMIT XM_034752326.1 F: AGGTCTGCTGGCAATCACTG
R: AGGGAAGGTCAGAGGTGACA
266
SGK1 XM_034765612.1 F: TGCACTGGGTTACTTGCACT
R: AGCAAGGTACTCAGGTGTGC
172
AR XM_034781910.1 F: CCAGAGGAATGTGGCAGTCA
R: GAGGATGGTTTCCATCTCCTCA
109
1.7 统计与分析

使用Kolmogorow-Smironov检验数据是否符合正态分布,若数据符合正态分布,则采用t检验或ANOVA分析。若数据不符合正态分布,则采用Kruskal-Wallis非参数检验比较组间的差异显著性,并采用Mann-Whitney U非参数检验比较组内差异显著性。试验结果用x±SE表示,统计分析采用SPSS 17.0。显著性水平设置为α=0.05。

2 结果 2.1 MAPKs抑制剂对AQP3基因表达水平的影响

与淡水组相比,5‰盐度组AQP3 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),淡水+不同浓度的JNK、ERK、p38MAPK抑制剂组中,AQP3 mRNA相对表达量无显著变化(P>0.05)。但5‰盐度+不同浓度的ERK、p38MAPK抑制剂组中,AQP3 mRNA相对表达量均显著下调,与5‰盐度组之间的差异显著(P<0.05),但不同浓度的ERK、p38MAPK抑制剂组间AQP3 mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。5‰盐度+不同浓度的JNK抑制剂组中,AQP3 mRNA相对表达量的组间差异不显著(P>0.05;图 1)。

图 1 MAPKs抑制剂对AQP3 mRNA相对表达量的影响 Fig. 1 Effects of MAPKs inhibitors on the expression of AQP3 mRNA 不同小写字母代表 5‰盐度组内不同抑制剂浓度的差异显著性(P<0.05); * P<0.05; 下同 Different lowercase letters represent there is a significant difference within the 5‰ salinity group (P < 0.05); * P < 0.05; the same below
2.2 MAPKs抑制剂对HSP70 mRNA基因表达水平的影响

与淡水组相比,5‰盐度组的HSP70 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中,HSP70 mRNA相对表达量无显著变化(P>0.05)。5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中,3种抑制剂均下调了HSP70 mRNA相对表达量,与5‰盐度组之间的差异显著(P<0.05),且在JNK、ERK、p38MAPK抑制剂浓度分别为5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、25 mg·kg-1时,HSP70 mRNA相对表达量最低(图 2)。

图 2 MAPKs抑制剂对HSP70 mRNA相对表达量的影响 Fig. 2 Effects of MAPKs inhibitors on the expression of HSP70 mRNA
2.3 MAPKs抑制剂对AR mRNA基因表达水平的影响

与淡水组相比,5‰盐度组的AR mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中,AR mRNA相对表达量无显著变化(P>0.05)。5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中,JNK抑制剂浓度为15 mg·kg-1时,AR mRNA相对表达量较5‰盐度组显著下调(P<0.05),浓度为5 mg·kg-1、25 mg·kg-1时的AR mRNA相对表达量与5‰盐度组之间的差异不显著(P>0.05);ERK抑制剂浓度为5 mg·kg-1、10 mg·kg-1时,AR mRNA相对表达量比5‰盐度组显著下调(P<0.05);p38MAPK抑制剂浓度为5 mg·kg-1、15 mg·kg-1时,AR mRNA相对表达量比5‰盐度组显著降低(P<0.05;图 3)。

图 3 MAPKs抑制剂对AR mRNA相对表达量的影响 Fig. 3 Effects of MAPKs inhibitors on the expression of AR mRNA
2.4 MAPKs抑制剂对SGK1基因表达水平的影响

与淡水组相比,5‰盐度组的SGK1 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。在5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中,随着p38MAPK抑制剂浓度的增加,SGK1 mRNA相对表达量呈下降趋势,且在浓度为25 mg·kg-1时,SGK1 mRNA相对表达量最低(P<0.05);随ERK抑制剂浓度增加,SGK1 mRNA相对表达量虽表现出下降的趋势,但各组间差异不显著(P>0.05);JNK抑制剂组与5‰盐度组的SGK1 mRNA相对表达量之间差异不显著(P>0.05)(图 4)。

图 4 MAPKs抑制剂对SGK1 mRNA相对表达量的影响 Fig. 4 Effects of MAPKs inhibitors on the expression of SGK1 mRNA
2.5 MAPKs抑制剂对SMIT基因表达水平的影响

与淡水组相比,5‰盐度组的SMIT mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。在5‰盐度+抑制剂各组中,JNK、p38MAPK抑制剂组中SMIT mRNA相对表达量均下调,与5‰盐度组相比差异显著(P<0.05);ERK抑制剂组与5‰盐度组相比,SMIT mRNA相对表达量无显著变化(P>0.05;图 5)。

图 5 MAPKs抑制剂对SMIT mRNA相对表达量的影响 Fig. 5 Effects of MAPKs inhibitors on the expression of SMIT mRNA
3 讨论

盐度是影响水生生物生存的重要环境因子,外界环境中的盐度急剧升高时,会造成机体细胞失水、离子浓度增加、DNA损伤、细胞骨架重排、转录和翻译受到抑制等问题,为了使细胞在高渗下维持正常功能和稳态,机体进化出一系列机制(Dmitrieva & Burg,1998;Burg et al., 2007)。通过激活高渗响应信号MAPKs通路以适应高盐环境,本研究发现,MAPKs信号通路抑制剂显著降低了AQP3、SGK1、SMIT、HSP70等的表达,说明MAPKs信号调控的渗透压调节基因在红耳龟入侵半咸水环境中起到了一定的保护作用。

MAPKs是从酵母到人类高度保守的信号蛋白,在高渗条件下,MAPKs可迅速激活,并发挥多种功能,在渗透胁迫信号传导中起关键作用,如调节细胞体积以及下游渗透压调节基因的表达等(Kültz & Burg,1998de Nadal et al., 2002de Hoffmann et al., 2009)。在MAPKs众多调控基因中,AQP3作为传统的选择性水通道蛋白,参与水的分泌、吸收及细胞膜内外平衡调节(李金库等,2021),高渗条件下SGK1在维持体内Na+、K+稳态中发挥重要作用(Kaneko et al., 1990Arteaga,2005Flores et al., 2005Aoi et al., 2006), AR和SMIT通过积累有机渗透物质山梨醇和肌醇等参与高渗条件下的渗透调节(Bagnasco et al., 1987Miyakawa et al., 1999),而HSP70的高表达可减少高渗对细胞的损害(Yang et al., 2009)等,以上渗透压调节基因在机体应对高渗胁迫、维持细胞稳态中均发挥重要作用。而MAPKs作为其上游调控因子可以直接或者间接对其进行调控。如在高渗环境中阻断p38MAPK可以抑制HSP70的转录水平(Sheikh-Hamad et al., 1998);高盐生长环境诱发DNA损伤,p53被活化,促进ERK1/2的磷酸化,磷酸化ERK1/2诱导SGK1的高表达(You et al., 2004);阻断狗肾脏细胞p38MAPK活性可以抑制高渗条件下的钠/肌醇转运(Bissonnette et al., 2008);高渗条件下在人视网膜色素上皮细胞中加入ERK、p38MAPK抑制剂会显著抑制AR的表达(Winges et al., 2016);AQP3缺失小鼠的p38、JNK和ERK磷酸化水平显著下降(Lei et al., 2017)等。本研究也发现,红耳龟在进入盐度环境后,相关的渗透压调节基因表达显著上调,在应用特异性抑制剂阻断MAPKs信号通路后,其中,ERK、p38MAPK抑制剂可显著降低AQP3、AR mRNA相对表达量,3种抑制剂均可显著降低HSP70 mRNA的相对表达量,而SGK1的表达水平主要受p38MAPK抑制剂的调控,JNK、p38MAPK抑制剂可以显著降低SMIT mRNA相对表达量,且随着JNK抑制剂浓度的升高,抑制效果加强。结合试验结果,推测外来淡水物种红耳龟入侵半咸水环境过程中,在响应高渗胁迫初期,可能通过提高渗透压调节因子SGK1表达,促使Na+快速进入细胞,并通过AQP3吸水来恢复细胞体积,在适应高渗压力下的离子跨膜运输中发挥作用。此外,为了克服高渗带来的不利影响,有机渗透物质可能成为红耳龟在应对高渗环境下的保护剂,依靠转运蛋白积累包括肌醇和山梨糖醇来平衡渗透性变化(Ho,2006Alfieri & Petronini,2007)。HSP70高渗条件下的合成水平增加,则是用来修复或降解细胞内变性蛋白质,从而提高肾脏组织对渗透压剧烈变化的适应能力(Yang & Feige,1992)。而MAPKs信号通路参与了上述渗透压相关基因的调控过程,并通过提高渗透压调节基因的转录水平以抵消外界盐度变化引起的渗透压不平衡所造成的破坏性后果。但MAPKs信号通路作用是错综复杂的,不只1条支路对渗透压保护基因有调节作用,多是两者或三者共同参与渗透压调节(崔文晓,2020)。p38MAPK作为红耳龟响应高渗应激的重要感知途径,在调节下游渗透压保护基因AQP3、HSP70、AR、SGK1、SMIT的表达中发挥着不可替代的作用。

4 结论

红耳龟在入侵半咸水环境后,会通过提高AQP3、HSP70、AR、SMIT、SGK1等渗透压调节基因mRNA的转录水平以抵御外界的不良影响。MAPKs信号通路抑制剂显著降低了相关渗透压调节基因的表达,说明MAPKs信号通路参与了红耳龟在适应半咸水过程中的渗透压调节过程。

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