四川动物  2021, Vol. 40 Issue (1): 39-45

扩展功能

文章信息

葛焰, 王伟, 刘洁玉, 曾博
GE Yan, WANG Wei, LIU Jieyu, ZENG Bo
利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起搏模型
A Mouse Model of Light-Controlled Cardiac Pacing
四川动物, 2021, 40(1): 39-45
Sichuan Journal of Zoology, 2021, 40(1): 39-45
10.11984/j.issn.1000-7083.20200329

文章历史

收稿日期: 2020-08-22
接受日期: 2020-10-21
利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起搏模型
葛焰 , 王伟 , 刘洁玉 , 曾博 *     
西南医科大学心血管医学研究所, 医学电生理学教育部重点实验室, 四川泸州 646000
摘要:电刺激是人工控制心脏搏动频率的标准技术,但在实验研究中,这种方法有较大的局限性,如局部电解效应、刺激频率和时长受限、只能对目标范围内的所有细胞进行刺激、不能选择性作用于心肌细胞等。基于光遗传学技术,本研究构建了心肌细胞特异性表达光激活阳离子通道channelrhodopsin-2(ChR2)的转基因小鼠,采用特定频率的蓝光刺激使心肌细胞膜电位去极化,从而引发动作电位并控制心脏起搏。当蓝光刺激频率低于小鼠自发心脏搏动频率时,蓝光刺激造成暂时性的心律失常,去除蓝光照射后小鼠心跳恢复正常;当蓝光刺激频率高于小鼠自发心跳频率时,小鼠的心脏搏动完全由蓝光刺激支配,去除蓝光照射后恢复到自发搏动状态;失去自主搏动能力的小鼠心脏也可由蓝光刺激进行起搏;不表达ChR2的对照小鼠对蓝光刺激没有响应。本研究对基于光遗传学的光控心脏起搏技术进行了实验论证,在心肌电生理学特别是心律失常研究中有着非常重要的应用价值。
关键词光遗传学    光控心脏起搏    视紫红质通道蛋白2    心律失常    
A Mouse Model of Light-Controlled Cardiac Pacing
GE Yan , WANG Wei , LIU Jieyu , ZENG Bo *     
Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Insitute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan Province 646000, China
Abstract: Electrical stimulation is a standard technique for controlling cardiac beating frequency. However,in experimental studies,this method has critical technical limitations,such as local electrolysis effect,limited stimulation frequency and duration,stimulating all cells within the target range,and lack of selectivity on cardiomyocytes. Based on optogenetic technology,transgenic mice with specific expression of photoactivated cationic channel channelrhodopsin-2 (ChR2) in cardiomyocytes were constructed,and then blue light at specific frequency was used to stimulate cardiomyocytes and depolarize the membrane potential which can trigger the action potential and control the cardiac pacing. When the frequency of blue-light stimulation was lower than the spontaneous heart-beating frequency of mice,the blue-light stimulation caused temporary cardiac arrhythmia,while the heart beating of mice returned to normal after the removal of blue-light illumination. When the frequency of blue-light stimulation was higher than the spontaneous heart rate of the mice,the heart beats of mice were completely controlled by blue-light stimulation,and returned to the spontaneous beating state after removing the blue light. Moreover,mouse hearts failed to beat autonomously could also be paced by blue light,and ChR2-deficient mice showed no response to blue-light stimulation. Therefore,optogenetics-based light-controlled cardiac-pacing technique is experimentally demonstrated in this study,which has very important values' in cardiac electrophysiology,especially in the study of arrhythmias.
Keywords: optogenetics    light-controlled cardiac pacing    channelrhodopsin-2    arrhythmia    

电刺激心脏起搏是广泛用于临床治疗和实验室研究的心脏起搏技术,基本作用原理为使用起搏器即电脉冲信号发生器向局部心肌组织直接施加特定频率的电刺激,使该区域心肌细胞膜电位去极化,产生动作电位并将兴奋传导至相邻区域的心肌组织,使心脏激动和收缩(Roth,1994)。虽然电刺激心脏起搏器已经在临床应用上取得了很大的成功,但是在实验室研究,特别是使用小鼠作为疾病模型的心律失常研究中电刺激起搏还存在明显的技术缺陷,如只能用于引发动作电位的短暂去极化,不能长时间持续刺激(Bruegmann et al., 2010);导致不同部位的心肌产生不均匀的去极化和超极化区域(Gillis et al., 1996);电刺激作用于目标区域的所有细胞,包括心肌细胞、成纤维细胞、心肌浸润的巨噬细胞等,不能选择性作用于心肌细胞(Zaglia et al., 2019);电解组织液产生氢气、氧气、氯气等组织损伤性气体并改变局部pH值等(Merrill et al., 2005)。为了避免以上问题,需要开发新的心脏起搏技术对电刺激技术进行补充或替代。

光遗传学(Deisseroth et al., 2006)是利用基因重组技术,将光敏感的生物元件导入细胞、组织或个体中,对特定的生物学功能进行研究的新型技术手段,目前使用最多的光遗传学工具是视紫红质通道蛋白2 (channelrhodopsin-2,ChR2),该蛋白是一种蓝光激活的阳离子通道(Nagel et al., 2003),将ChR2表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上,利用一定强度的蓝光将其激活开放即可实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精细调控(Lerner et al., 2016;Lee et al., 2020)。心脏光遗传学是一个新兴的研究方向(Jia et al., 2011),一般是指将ChR2特异性表达于心肌细胞上,通过蓝光照射使ChR2通道开放,胞外阳离子流入细胞内,使细胞膜电位去极化,从而引发心肌细胞产生动作电位,电活动可以从少数心肌细胞向周围相邻的心肌细胞传导,最终使整个心脏兴奋和收缩(Entcheva,2013)。基于以上原理,本研究使用心肌特异性Cre重组酶表达小鼠与ChR2融合tdTomato荧光蛋白转基因小鼠进行杂交获得了心肌特异性ChR2-tdTomato表达小鼠,并使用蓝光照射对小鼠的心脏搏动进行了精确控制,成功构建了光控小鼠心脏起搏模型。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

αMHC-Cre和ChR2(H134R)-tdTomato转基因小鼠购自美国Jackson Laboratory,在西南医科大学实验动物中心SPF动物房进行繁育[实验动物生产许可证号:SCXK(川)2018-17, 实验动物使用许可证号:SCXK(川)2018-065],饲养过程中给予充足的饮水和饲料。动物实验经西南医科大学实验动物伦理委员会审核批准,在医学电生理学教育部重点实验室进行。

1.1.2 试剂

NaOH、Tris-HCl、琼脂糖、核酸染料、D2000 DNA Marker和TAE缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司,2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司,小鼠基因型鉴定引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成,麻醉药物戊巴比妥钠由西南医科大学统一订购分配使用。

1.2 方法 1.2.1 转基因小鼠繁殖策略

研究使用的αMHC-Cre转基因小鼠为αMHC启动子驱动的心肌特异性Cre重组酶表达小鼠,ChR2(H134R)-tdTomato转基因小鼠在通用型CAG启动子和ChR2(H134R)-tdTomato融合基因之间插入了2个LoxP位点和STOP终止序列,在没有Cre重组酶的情况下,ChR2(H134R)-tdTomato不表达。将2种转基因小鼠杂交后,在心肌细胞中表达的Cre重组酶对2个LoxP位点进行剪切和重组,中间的STOP序列被切除,ChR2(H134R)-tdTomato融合蛋白得以表达(图 1)。ChR2(H134R)是ChR2的突变体,在蓝光刺激下具有更高的活性,产生约2倍的光电流,去极化作用更显著(Nagel et al., 2005),但是基本特性与ChR2相同,后文中将其简称为ChR2。

图 1 转基因小鼠繁殖策略 Fig. 1 Crossbreeding strategy of transgenic mice
1.2.2 转基因小鼠基因型鉴定

2种转基因小鼠及其杂交后代的基因型鉴定使用αMHC-Cre和ChR2特异性引物(表 1)对鼠尾DNA进行PCR扩增,根据产物电泳结果判断基因型。鼠尾DNA提取采用碱裂解法,取鼠尾(0.5~1 mm)于300 μL 50 mmol·L-1 NaOH溶液中,100 ℃金属浴30 min,冷却后加入25 μL 1 mol·L-1 Tris-HCl (pH8.0)混匀,用作PCR模板。PCR体系(20 μL):ddH2O 7 μL,引物各1 μL,模板DNA 1 μL,2×Es Taq MasterMix 10 μL。PCR程序:95 ℃ 2 min; 94 ℃ 20 s,63/57 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,35个循环; 72 ℃ 1 min,10 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后成像分析。

表 1 转基因小鼠基因型鉴定引物 Table 1 Genotyping primers of transgenic mice
引物名称 序列(5’-3’) 退火
温度/℃
产物
大小/bp
αMHC-9543F ATGACAGACAGAT
CCCTCCTATCTCC
αMHC-9544R CTCATCACTCGTT
GCATCATCGAC
63 300
ChR2-oIMR9103 GGCATTAAAG
CAGCGTATCC
ChR2-oIMR9105 CTGTTCCTGT
ACGGCATGG
57 196
1.2.3 小鼠心脏荧光表型鉴定

取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥钠溶液,麻醉后手术开胸暴露心脏,用561 nm LED光源照射整个胸腔(图 2:A),使用590~650 nm波段滤光片和普通相机捕获tdTomato荧光并成像(图 2:B、C)。

图 2 小鼠心脏荧光表型和蓝光刺激 Fig. 2 Fluorescent phenotype and blue-light stimulation of mouse hearts A.麻醉小鼠开胸后用561 nm LED光源照射胸腔激发tdTomato荧光, B. αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心脏发出明亮的tdTomato荧光, C. αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+对照小鼠心脏无tdTomato荧光, D.麻醉小鼠连接呼吸机并进行心电图导联, E.蓝光刺激小鼠心脏进行光控起搏 A. Illumination of thoracic cavity with 561 nm LED light source to excite tdTomato fluorescence after thoracotomy in anesthetized mouse, B. Heart of αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+ mouse emitting bright tdTomato fluorescence, C. No tdTomato fluorescence in the heart of αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+ control mouse, D. Anesthetized mouse connected to a ventilator and electrodes for electrocardiography, E. Light-controlled pacing of mouse heart by blue-light stimulation
1.2.4 小鼠光控心脏起搏

取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥钠溶液,待小鼠麻醉约15 min后行气管插管(呼吸频率130次/min,呼吸时比5: 4,潮气量2 mL),手术开胸后暴露心脏,将蓝光刺激器对准心脏,使用针灸针穿刺四肢皮肤,连接导线进行心电图记录(图 2:D、E)。

2 结果 2.1 杂交小鼠基因型和荧光表型

将αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠进行杂交获得了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+(心肌特异性表达Cre和ChR2-tdTomato)、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-(心肌特异性表达Cre但不携带ChR2-tdTomato基因)和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+(不表达Cre,携带ChR2-tdTomato基因但由于上游终止序列的存在而无法表达)3种基因型的小鼠。在561 nm LED光源的激发下(图 2:A),αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠的心脏发出明亮的红色荧光且在其他部位没有荧光(图 2:B),说明ChR2-tdTomato融合蛋白在该基因型小鼠心脏中具有组织特异性的高水平表达。同样条件下,αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠心脏及其他部位均没有明显的荧光,说明ChR2-tdTomato没有表达。

2.2 心脏自主搏动小鼠的光控起搏

心肌表达ChR2-tdTomato的αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在连接呼吸机和开胸后,在没有蓝光刺激的情况下,心脏自主搏动的频率约为4 Hz(图 3:A); 当给予小鼠心脏2 Hz的蓝光刺激时,原先的自主搏动节律被打乱,出现明显的心律失常(图 3:B); 当蓝光刺激频率与自主搏动频率相同时,心跳频率维持在4 Hz(图 3:C); 当使用6 Hz蓝光刺激频率时,心脏搏动完全由光照支配,且表现为窦性心律(图 3:D); 当蓝光刺激频率提高至8 Hz时,心跳频率也随之变为8 Hz,但出现了短暂的心律失常(图 3:E); 当使用10 Hz的蓝光刺激时,小鼠心肌已不能承受快速的去极化,虽然心脏搏动仍较为规律,但心电图波形已出现严重的紊乱(图 3:F)。当撤除蓝光刺激之后,无论之前使用了何种刺激频率,小鼠心脏均可迅速恢复到4 Hz的自主搏动状态。

图 3 αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在不同蓝光刺激频率下的心电图 Fig. 3 Electrocardiogram of αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+ mice in response to blue-light stimulation with different frequencies
2.3 心脏停跳小鼠的光控起搏

为了检测因缺血损伤而无法自主搏动的心脏对蓝光刺激的反应,本研究将αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠麻醉后不连接呼吸机直接开胸,待心脏停跳后进行蓝光刺激,当刺激频率为1~5 Hz时,蓝光刺激可以有效引发小鼠心脏的搏动,搏动频率与刺激频率完全一致(图 4:A~C)。当蓝光刺激频率为7.5~10 Hz时,由于可能存在的心肌损伤,小鼠心率仅能维持在4~5 Hz内,无法进一步提高(图 4:D~F)。以上结果说明光遗传学技术具有起搏停跳心脏的能力,起搏效果可能与心肌损伤的程度密切相关。

图 4 心脏停跳αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在不同蓝光刺激频率下的心电图 Fig. 4 Electrocardiogram of αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+ mice without autonomous heart beating in response to blue-light stimulation with different frequencies
2.4 对照小鼠对蓝光刺激无响应

为了确认αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心脏的光控起搏是由心肌表达的ChR2引发的,本研究还对αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+ 2种不表达ChR2-tdTomato的对照小鼠进行了同样的实验,发现2种小鼠对5 Hz和10 Hz的蓝光刺激均没有响应,心率一直维持在6 Hz(图 5),这说明ChR2的表达是心脏光控起搏的决定因素。

图 5 αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+对照小鼠在不同蓝光刺激频率下的心电图 Fig. 5 Electrocardiogram of αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato- and αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+ control mice in response to blue-light stimulation with different frequencies
3 讨论

光遗传学是一种新兴的通过光敏感生物元件来控制生物学功能的技术手段,目前已被广泛应用于神经科学研究中,极大地促进了更为精细的神经元分类、投射和功能研究(Rajasethupathy et al., 2016)。然而,目前在心脏电生理研究中光遗传学的应用还较少,Arrenberg等(2010)在斑马鱼Danio rerio上实现了心脏节律的光遗传学控制,借助黄光激活的阴离子通道halorhodopsin(NpHR)(Schobert & Lanyi,1982)和蓝光激活的ChR2成功构建了心动过速、心动过缓、房室传导阻滞和心脏骤停等疾病模型。同时,ChR2也被证明可以在小鼠体内实现光控心脏起搏(Bruegmann et al., 2010)。在体外培养的人诱导多能干细胞分化的心肌细胞上联合使用ChR2与遗传编码的钙离子和膜电位荧光探针,可以实现心肌细胞的起搏及钙瞬变和膜电位同步记录,从而进行高通量的药物心脏毒性检测(Dempsey et al., 2016)。除了直接对心肌细胞进行光遗传学操控,在交感神经上表达ChR2并进行光刺激可以使离体的小鼠心脏的搏动加快、收缩增强,更易发生心律失常(Wengrowski et al., 2015)。与之相对,在交感神经上表达光驱动的质子外流泵ArchT(Han et al., 2011),可以显著抑制交感神经的兴奋并保护动物免于发生心律失常(Yu et al., 2017)。另外,利用光遗传学技术,心脏浸润的巨噬细胞也被发现在心脏电活动传导尤其是房室传导过程中发挥着重要作用(Hulsmans et al., 2017)。

利用心肌组织特异性表达ChR2的转基因小鼠,本研究也对使用光遗传学技术进行心脏节律控制进行了探讨,不仅验证了蓝光刺激ChR2对正常状态小鼠心脏的精准调控,还对因缺血损伤停止搏动的小鼠心脏进行了不同频率的起搏测试,发现短时停跳的心脏在蓝光刺激下也有产生搏动的能力。由于本研究使用的LED蓝光刺激器光斑较大,无法将照射范围控制在心脏局部较小范围,未能比较对窦房结、心房、心室等不同部位进行蓝光刺激的效果差异,这是本研究的一个重要局限,在后期研究中可以通过使用光斑较小的激光光源进行多部位刺激和更深入的探讨。此外,伴随单细胞测序技术的广泛应用,越来越多的心肌细胞亚型也已被发现(Zhou & Zhang,2020),构建并使用各细胞亚型特异性的Cre小鼠结合ChR2光遗传学刺激(Wang et al., 2017),将有助于理解各亚型心肌细胞的电生理特性差异,是深入理解心脏功能和心律失常的发生机制的重要技术手段。

参考文献
Arrenberg AB, Stainier DY, Baier H, et al. 2010. Optogenetic control of cardiac function[J]. Science, 330(6006): 971-974. DOI:10.1126/science.1195929
Bruegmann T, Malan D, Hesse M, et al. 2010. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo[J]. Nature Methods, 7(11): 897-900. DOI:10.1038/nmeth.1512
Deisseroth K, Feng G, Majewska AK, et al. 2006. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits[J]. The Journal of Neuroscience, 26(41): 10380-10386. DOI:10.1523/JNEUROSCI.3863-06.2006
Dempsey GT, Chaudhary KW, Atwater N, et al. 2016. Cardiotoxicity screening with simultaneous optogenetic pacing, voltage imaging and calcium imaging[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 81: 240-250. DOI:10.1016/j.vascn.2016.05.003
Entcheva E. 2013. Cardiac optogenetics[J]. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 304(9): 1179-1191. DOI:10.1152/ajpheart.00432.2012
Gillis AM, Fast VG, Rohr S, et al. 1996. Spatial changes in transmembrane potential during extracellular electrical shocks in cultured monolayers of neonatal rat ventricular myocytes[J]. Circulation Research, 79(4): 676-690. DOI:10.1161/01.RES.79.4.676
Han X, Chow BY, Zhou H, et al. 2011. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex[J/OL]. Frontiers in Systems Neuroscience, 5: 18[2020-04-20]. https://doi.org/10.3389/fnsys.2011.00018.
Hulsmans M, Clauss S, Xiao L, et al. 2017. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart[J]. Cell, 169(3): 510-522. DOI:10.1016/j.cell.2017.03.050
Jia Z, Valiunas V, Lu Z, et al. 2011. Stimulating cardiac muscle by light:cardiac optogenetics by cell delivery[J]. Circulation Arrhythmia and Electrophysiology, 4(5): 753-760. DOI:10.1161/CIRCEP.111.964247
Lee HN, Mehta S, Zhang J. 2020. Recent advances in the use of genetically encodable optical tools to elicit and monitor signaling events[J]. Current Opinion in Cell Biology, 63: 114-124. DOI:10.1016/j.ceb.2020.01.007
Lerner TN, Ye L, Deisseroth K. 2016. Communication in neural circuits:tools, opportunities, and challenges[J]. Cell, 164(6): 1136-1150. DOI:10.1016/j.cell.2016.02.027
Merrill DR, Bikson M, Jefferys JG. 2005. Electrical stimulation of excitable tissue:design of efficacious and safe protocols[J]. Journal of Neuroscience Methods, 141(2): 171-198. DOI:10.1016/j.jneumeth.2004.10.020
Nagel G, Brauner M, Liewald JF, et al. 2005. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses[J]. Current Biology, 15(24): 2279-2284. DOI:10.1016/j.cub.2005.11.032
Nagel G, Szellas T, Huhn W, et al. 2003. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(24): 13940-13945. DOI:10.1073/pnas.1936192100
Rajasethupathy P, Ferenczi E, Deisseroth K. 2016. Targeting neural circuits[J]. Cell, 165(3): 524-534. DOI:10.1016/j.cell.2016.03.047
Roth BJ. 1994. Mechanisms for electrical stimulation of excitable tissue[J]. Critical Reviews in Biomedical Engineering, 22(3-4): 253-305.
Schobert B, Lanyi JK. 1982. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump[J]. The Journal of Biological Chemistry, 257(17): 10306-10313. DOI:10.1016/S0021-9258(18)34020-1
Wang Y, Lin WK, Crawford W, et al. 2017. Optogenetic control of heart rhythm by selective stimulation of cardiomyocytes derived from Pnmt(+) cells in murine heart[J/OL]. Scientific Reports, 7: 40687[2020-04-20]. https://doi.org/10.1038/srep40687.
Wengrowski AM, Wang X, Tapa S, et al. 2015. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function[J]. Cardiovascular Research, 105(2): 143-150. DOI:10.1093/cvr/cvu258
Yu L, Zhou L, Cao G, et al. 2017. Optogenetic modulation of cardiac sympathetic nerve activity to prevent ventricular arrhythmias[J]. Journal of the American College of Cardiology, 70(22): 2778-2790. DOI:10.1016/j.jacc.2017.09.1107
Zaglia T, Di Bona A, Mongillo M. 2019. A light wand to untangle the myocardial cell network[J/OL]. Methods and Protocols, 2(2): 34[2020-05-10]. https://doi.org/10.3390/mps2020034.
Zhou Y, Zhang J. 2020. Single-cell transcriptomics:new insights in heart research[J]. Circulation, 141(21): 1720-1723. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.046043