四川动物  2019, Vol. 38 Issue (6): 686-694

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张君利, 刘超兰, 郭义东, 林家富
ZHANG Junli, LIU Chaolan, GUO Yidong, LIN Jiafu
云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究
Isolation and Identification of Bacillus with Antimicrobial Activity from the Lakes of Yunnan, Guizhou, and Sichuan Provinces
四川动物, 2019, 38(6): 686-694
Sichuan Journal of Zoology, 2019, 38(6): 686-694
10.11984/j.issn.1000-7083.20190043

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收稿日期: 2019-01-27
接受日期: 2019-08-12
云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究
张君利 , 刘超兰 , 郭义东 , 林家富 *     
成都大学四川抗菌素工业研究所, 抗生素研究与再评价四川省重点实验室, 成都 610052
摘要:为从湖泊沉积物中筛选出对动物病原菌具有抑菌活性的芽孢杆菌Bacillus ,采用纯培养方法对云贵川地区9个湖泊样品中的芽孢杆菌进行分离、16S rRNA基因序列测定和发酵,以4株常见动物病原菌作为对象,对芽孢杆菌次级代谢产物进行活性检测,筛选有抗菌活性的菌株,并对活性菌株的发酵产物进行液相色谱-质谱联用技术分析。结果显示,在9个湖泊样品中共分离出47株芽孢杆菌,筛选出13株有抗菌活性的菌株,且其产生的脂肽类抗生素对动物病原菌显示出较好的抗菌活性。本研究不仅扩大了芽孢杆菌物种资源信息库,为后续开展芽孢杆菌次生代谢产物研究奠定理论依据。同时也为开发新型动物致病菌抗生素提供了新的途径。
关键词湖泊沉积物    芽孢杆菌    动物病原菌    抗菌活性    
Isolation and Identification of Bacillus with Antimicrobial Activity from the Lakes of Yunnan, Guizhou, and Sichuan Provinces
ZHANG Junli , LIU Chaolan , GUO Yidong , LIN Jiafu *     
Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University, Antibiotics Research and Re-Evaluation Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610052, China
Abstract: To test the antimicrobial activities of Bacillus species, a total of 244 bacterial strains were previously isolated from the sediments of lakes in Yunnan, Guizhou, and Sichuan provinces of China. The strains were identified by sequencing the 16S rRNA gene. After fermentation, the antimicrobial activities of the secondary metabolites of Bacillus was determined by using 4 strains of common animal pathogenic bacteria, Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , and Candida albicans . The fermented products of strains were analyzed by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. The results showed that 47 isolates from 9 lake samples were identified as Bacillus , and 13 of which were found to have antimicrobial activities by producing the lipopeptide antibiotics. This study expands the current understanding of Bacillus species resources, lays a theoretical foundation for further studies on the secondary metabolites of Bacillus , and also opens a new avenue for the discovery of antibiotics against animal pathogens.
Keywords: lake sediments    Bacillus    animal pathogens    antibacterial activity    

近年来,由于畜禽行业抗生素的过度使用,细菌耐药性不断增强,使中国成为世界上动物源性细菌耐药性最严重的国家之一(胡燕等,2013)。临床分离的畜禽常见病原菌(大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巴氏杆菌Pasteurella、沙门氏菌Salmonella、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa等)可耐受抗菌药物达5~20种,引起了人们对动物疾病防治的高度重视。与此同时,60%以上的人体病原菌来自动物。一些人畜共患病原菌特别是食源性病原菌的出现,也对我国的动物源食品安全和公众健康构成了严重威胁(Theuretzbacher,2013)。原有病原菌抗耐药情况还未缓和,新病原菌抗耐药又不断出现,促使人类寻找新型抗生素和抗菌药物(Olga,2017)。目前已有的生物活性物质基本是从土壤放线菌中获得的(谭悠久等,2011)。但是,由于陆地资源的过饱和挖掘,使得发现更多新化合物和新菌种越来越难。因此,人们开始把海洋、湖泊、极端环境、植物内生等作为新的研究对象,以期利用新的生长环境获得新的微生物资源,提高新化合物及活性化合物的发现几率。

本课题组前期从云贵川地区的9个湖泊沉积物中分离出244株菌,鉴定为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes以及异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus 4个门,芽孢杆菌属Bacillus、链霉菌属Streptomyces和库特氏菌属Kurthia等24属。经过菌株的活性初筛,发现芽孢杆菌属活性较好。因此,本文将从湖泊沉积物芽孢杆菌的分离、鉴定及抗动物病原菌活性评价等方面进行阐述,为利用湖泊来源的芽孢杆菌及其脂肽类抑菌物质、进一步开发抗动物病原菌的新型微生物药物提供菌种资源和理论依据。

1 材料与仪器 1.1 样品来源

对云贵川地区的9个湖泊进行深度采样,每个湖泊采集1份水体沉积物样品(表 1),密闭的50 mL离心管保存于冰盒,72 h内送至实验室培养。

表 1 样品信息 Table 1 Sampling information
湖泊 省份 水温/℃ pH 盐度
滇池 云南 23.06 9.42 0.17
洱海 云南 23.88 9.16 0.14
大理西湖 云南 22.59 8.94 0.22
程海 云南 26.22 9.53 0.62
泸沽湖 云南 20.89 10.83 0.10
红枫湖 贵州 27.37 10.08 0.13
百花湖 贵州 26.56 10.15 0.16
马湖 四川 25.72 10.40 0.05
邛海 四川 28.83 9.80 0.14
1.2 主要仪器和试剂

PCR 扩增仪(Bio-Rad,美国);LDZM-80KCS 立式压力蒸汽灭菌器(申安,上海);ZF-20D 暗箱式紫外分析仪(远怀,上海);超净工作台(安泰,苏州);电子生化培养箱(东联,哈尔滨);1200系列液相色谱-质谱联用仪(Agilen,美国);LC-20AD 液相色谱仪(岛津,日本);实验室其他常规仪器。

TIANGEN 酵母基因组DNA 提取试剂盒;2× TSINGKE Master Mix,10×Loading Buffer;DL2000 DNA Maker;标准品98% surfactin,90% iturin(Sigma);其他试剂均为分析纯。

1.3 培养基

分离培养基:LB 琼脂培养基和海洋(2216E)培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司;发酵培养基:LB 肉汤培养基;动物病原菌培养基:LB 琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 动物病原菌

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌Candida albicans均由四川抗菌素工业研究所菌保中心提供。

2 实验方法 2.1 菌株分离纯化

使用稀释涂布法分离菌株:首先将沉积物样品放置于超净工作台,过夜风干,称取2 g,加入18 mL灭菌蒸馏水,震荡2 h。其次将混悬液梯度稀释至10-1~10-6,分别取100 μL悬浊液均匀涂布于营养琼脂平板,37 ℃培养48 h。根据菌落质地、大小、颜色和光泽等特征,挑取形态差异明显的单菌落。最后重复2~3次,镜检,将已纯化的菌株于25%甘油中-80 ℃保存。

2.1.1 形态特征

菌株在37 ℃的LB 培养基中生长48 h后,将细菌细胞悬浮在0.85%(w/v)的NaCl溶液中,在镀镍网上加热干燥,并用磷钨酸染色,使用电子显微镜观察细胞的大小和形态;通过悬滴法(Bowman,2000)检测细胞的运动能力;通过革兰氏染色法(Smibert,1994)鉴别菌株。

2.1.2 生理生化特征

温度:将实验菌株接种到LB 固体培养基,在不同的温度(4~50 ℃,间隔5 ℃)下培养,此外,在28 ℃和37 ℃培养菌株,确定最适生长温度和范围。pH:将30 ℃条件下培养好的菌株接种到不同 pH 值(pH=5~11,间隔0.5)的LB液体培养基中培养3~5 d,观察菌株的生长情况,测定菌株在OD600 时的吸光度,以确定最适生长 pH 及范围。盐度耐受:在LB 固体培养基上分别添加不同浓度的NaCl (范围0~10%,间隔1%)(w/v)检测菌株对NaCl的耐受程度。酶学特征:过氧化氢酶活性、氧化酶活性测定参考Cui等(2001)的方法。吲哚、明胶、七叶苷的实验均参考细菌系统鉴定手册。

2.2 菌株16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

通过DNA 试剂盒提取基因组DNA。采用20 μL反应体系进行PCR 扩增,即DNA 模板2 μL,2×TSINGKE Master Mix 10 μL,27F(10 μmol·L-1)1 μL,1492R(10 μmol·L-1)1 μL,超纯水6 μL。27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')为细菌通用引物。PCR 扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,通过Bio-Rad凝胶成像仪观察电泳结果。

PCR 扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,将所得各菌株16S rRNA基因序列通过NCBI 数据库进行Blast比对,以相似性较高的标准菌株的16S rRNA序列作为参照对象进行种属菌属分类。根据菌株比对结果,采用MEGA 7.0(Kumar et al ., 2016)以邻接法(Neighbor-Joining)(Saitou & Nei,1987)构建系统发育树。分析各湖泊之间的菌种分布以了解不同环境之间、不同种之间、环境与种之间的关系。

2.3 菌株发酵及抗菌活性检测

用接种环挑取斜面培养基上已纯化菌株的适量菌体接种于装有40 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中,置于30 ℃、200 r·min-1的摇床培养2~3 d。离心取上清,加浓盐酸调至 pH2,沉淀过夜。12 000 r·min-1、30 min,离心去上清,向沉淀中加入2 mL甲醇溶解,最后过0.22 μm微孔滤膜,将甲醇浸提液通过减压浓缩至蒸干,然后称重,并将粗提物用甲醇再次溶解配置成10 mg·mL-1的母液备用。使用动物病原菌进行抗菌活性检测。

采用滤纸片抑菌圈法对菌株进行抗菌活性检测。分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种于LB液体培养基中,白色念珠菌接种于PDA 液体培养基中,置于37 ℃、180 r·min-1的摇床上培养18 h,获得种子液。在超净工作台中,分别吸取100 μL种子液加入到45 ℃左右的100 mL的LB琼脂培养基和PDA 培养基中,摇匀后倒平板。待平板凝固后,分别将含有约10 μL粗提物母液的灭菌滤纸片(直径8 mm)以合适的间距放置于平板上,每组设置3个平行试验。于37 ℃培养24 h,同等条件下设置空白对照,观察有无透明圈并记录大小。

2.4 活性菌株次级代谢产物的LC-MS 分析

对粗提物和配制成1 mg·mL-1的标准品进行LC-MS 检测,参照标准品对次级代谢产物的活性成分进行分析。液相色谱条件为C18-MS-Ⅱ(2.6 mmφ×250 mm,TSK);进样量20 μL;柱温25 ℃;流动相为(A)乙腈和(B)水。洗脱条件为:0~10 min,A 20%~50%,B 80%~50%;10~50 min,A 50%~65%,B 50%~35%;50~60 min,A 50%~65%,B 50%~35%;流速0.6 mL·min-1。紫外检测波长为210 nm。

质谱条件为:ESI电喷雾;正离子模式;雾化气压力1.0×105 Pa;毛细管电压3 500 V;氮气干燥,流速为10 L·min-1,250 ℃;扫描范围300~1 800 m/z。

3 结果及分析 3.1 菌株分离鉴定

菌株的表型特征显示,芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌,菌落呈光滑圆形、不透明、乳白色。生理生化特征显示其在pH为6~8,温度为25~37 ℃,NaCl浓度为0~5%的培养条件下生长良好,属于严格好氧或兼性厌氧菌;细胞大小为0.3~2.2 μm×2.1~7.0 μm。其中,多数菌株的VP显示阳性;氧化酶和过氧化氢酶呈阳性;七叶苷、明胶水解,不产生吲哚(表 2表 3)。

表 2 菌株的表型特征 Table 2 Phenotypic characteristics of strains
菌株 菌落形态,颜色 革兰氏染色 细胞形状/大小/运动性
SIIA-Z148 圆形,表面光滑,米白色 阳性 直径3.0~5.0 μm
SIIA-Z790,SIIA-Z66,SIIA-Z37 白色 阳性 杆状,运动
SIIA-Z605,SIIA-Z578 圆形至略微不规则,略微凸起,浅橙黄色 不定 棒状,0.5~0.7 μm×1.2~3.5 μm
SIIA-Z669,SIIA-Z798 扁平,圆形,直径5~8 mm,桃红色 阳性 运动
SIIA-Z586 扁平,圆形,直径6~8 mm,白色 阳性 杆状,运动
SIIA-Z833,SIIA-Z654 不透明,光滑,圆形,直径1.0~2.0 mm,深棕色 阳性 杆状,运动
SIIA-Z626 乳白色 阳性 杆状,0.5~1.0 μm×2.0~4.0 μm,运动
SIIA-Z96,SIIA-Z252,SIIA-Z161,SIIA-Z153 圆形,略微凸起,不透明,黄褐色 阳性 运动
SIIA-Z173 平面光滑,不透明 不定 杆状,2.5~5.1 μm×0.8~1.3 μm,运动
SIIA-Z585 圆形,不透明,乳白色 阳性 直径0.8~1.0 μm,运动
SIIA-Z858,SIIA-Z656,SIIA-Z665,SIIA-Z573 圆形凸起,橙红色 阳性 杆状,0.4~0.7 μm×1.1~2.0 μm,运动
SIIA-Z663 黄色 不定 杆状,0.50~1.09 μm×2.0~3.0 μm,运动
SIIA-Z610 中央略微凸起,光滑,圆形,直径1~3 mm,乳白色 阳性 杆状
SIIA-Z811 半透明凸起,边缘不规则,直径0.5~1.2 mm 阳性 圆形杆状,0.6~0.8 μm×2.0~3.0 μm
SIIA-Z620 黏液状,半透明凸起,乳白色 阳性 杆状,0.5~0.8 μm×2.0~2.5 μm,运动
SIIA-Z602,SIIA-Z539 有晕圈,圆形,乳白色 阳性 杆状,0.7~0.9 μm×2.2~3.7 μm,运动
SIIA-Z783 不透明,黏液,白色 阳性 棒状,运动
SIIA-Z64 不透明,圆形,直径2~3 mm,白色 阳性 杆状
SIIA-Z160,SIIA-Z163 光滑,圆形,直径3.8 mm±0.2 mm,黄色 阳性 杆状,1.2~1.3 μm×2.2~2.5 μm
SIIA-Z761 半透明,光滑,白色 阳性 棒状,0.9 μm×4.0 μm,运动
SIIA-Z536,SIIA-Z582,SIIA-Z556,SIIA-Z842,SIIA-Z537,SIIA-Z530,SIIA-Z531 不透明,圆形,直径2~3 mm,乳白色 阳性 长杆状,0.5~0.58 μm×1.7~1.9 μm,运动
SIIA-Z154 不透明,灰白色 阳性 棒状,0.5~0.6 μm×1.8~2.0 μm
SIIA-Z165 边缘不规则,淡黄色 阳性 棒状,运动
SIIA-Z550 小圆形,边缘整齐,光滑,乳白色 阳性 棒状,运动
SIIA-Z623 圆形,不透明,乳白色 阳性 棒状,0.6~1.0 μm×3.0~4.0 μm
SIIA-Z580,SIIA-Z540 无光泽的颗粒状,乳白色 阳性 杆状,1.2~1.6 μm×2.5~3.2 μm
SIIA-Z650 光滑,圆形,直径3~4 mm,浅橙黄色 阳性 杆状,0.9~1.2 μm×3.3~5.3 μm

表 3 菌株的生理生化特征 Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains
菌株 温度/℃
(最佳温度/℃)
盐度/%
(最佳盐度/%)
pH
(最佳pH)
氧化酶 过氧化氢酶 七叶苷 明胶 吲哚 VP检测
SIIA-Z148 10~45(30) 0~4(0) 5~9(6) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z790,SIIA-Z66,SIIA-Z37 8~45(30) 0~2(0) 6~8(5) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z605,SIIA-Z578 30~37(35) 0~5(2) 6~7(7) 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z669,SIIA-Z798 10~37(28) 0~10(5) 6~10(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z586 10~40(37) 0~7(3) 6~10(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z833,SIIA-Z654 10~40(28) 0~7(0) 0~7(6) 阴性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z626 4~45(37) 0~4(1) 6~8(7) 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z96,SIIA-Z252,SIIA-Z161,SIIA-Z153 5~45(37) 0~5(1) 6~8.5(7) 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性
SIIA-Z173 17~37(30) 2~5(2) 6~9.5(8) 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z585 25~45(37) 0~5(0) 7~8(7) 阴性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z858,SIIA-Z656,SIIA-Z665,SIIA-Z573 15~40(37) 0~10(4) 5~8(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
SIIA-Z663 10~45(37) 0~10(3) 4.5~8(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z610 25~40(37) 0~10(3) 4~10(7) 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性
SIIA-Z811 20~40(37) 0~9(5) 7~9(8) 阴性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z620 15~45(37) 0~10(1) 5~10(7) 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z602,SIIA-Z539 10~45(35) 0~10(0) 6~10(7) 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z783 25~37(37) 0~1(0) 7~8(8) 阴性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
SIIA-Z64 10~39(30) 0~7(1) 5~10(7) 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z160,SIIA-Z163 25~45(37) 0~3(0) 6~8(6.5) 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z761 10~50(30) 0~7(2~4) 6~9(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性
SIIA-Z536,SIIA-Z582,SIIA-Z556,SIIA-Z842,SIIA-Z537,SIIA-Z530,SIIA-Z531 8~45(30) 0~10(1~3) 6~10(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z154 7~35(30) 0~2(0) 6~8(7) 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z165 15~30(28) 0~4(0) 6~10(7) 阳性 阳性 阴性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z550 10~40(28) 0~4(0) 6~10(7.5) 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
SIIA-Z623 10~37(30) 0~9(0) 7~8(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z580,SIIA-Z540 10~45(35) 0~5(0) 5~9(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性
SIIA-Z650 15~37(30) 0~2(0) 6~7(7) 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性
3.2 菌株16S rRNA基因序列测定及系统发育分析 3.2.1  16S rRNA测序分类

使用上述处理方法根据菌落表型特征和16S rRNA鉴定,共分离得到47株芽孢杆菌,有26种,最多的为漳州芽孢杆菌Bacillus zhangzhouensis (7株),食丁酸芽孢杆菌Bacillus butanolivorans和海口芽孢杆菌Bacillus haikouensis各4株,高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 3株,其余各种为2株或1株(表 4)。

表 4 湖泊沉积物中分离的芽孢杆菌种类 Table 4 Species of Bacillus isolates from different lake sediments
菌株 物种
SIIA-Z536,SIIA-Z582,SIIA-Z556,SIIA-Z842,SIIA-Z537,SIIA-Z530,SIIA-Z531 漳州芽孢杆菌Bacillus zhangzhouensis
SIIA-Z96,SIIA-Z252,SIIA-Z161,SIIA-Z153 食丁酸芽孢杆菌Bacillus butanolivorans
SIIA-Z858,SIIA-Z656,SIIA-Z665,SIIA-Z573 海口芽孢杆菌Bacillus haikouensis
SIIA-Z790,SIIA-Z66,SIIA-Z37 高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis
SIIA-Z160,SIIA-Z163 特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis
SIIA-Z602,SIIA-Z539 崛越氏芽孢杆菌Bacillus horikoshii
SIIA-Z669,SIIA-Z798 阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai
SIIA-Z605,SIIA-Z578 海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris
SIIA-Z580,SIIA-Z540 东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensis
SIIA-Z833,SIIA-Z654 深褐芽孢杆菌Bacillus atrophaeus
SIIA-Z173 简单芽孢杆菌Bacillus simplex
SIIA-Z165 耐寒短杆菌Brevibacterium frigoritolerans
SIIA-Z586 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium
SIIA-Z610 海泥芽孢杆菌Bacillus oceanisediminis
SIIA-Z811 地下芽孢杆菌Bacillus subterraneus
SIIA-Z550 盐敏芽孢杆菌Bacillus halmapalus
SIIA-Z761 天神芽孢杆菌Bacillus tianshenii
SIIA-Z663 黄海芽孢杆菌Bacillus marisflavi
SIIA-Z154 威恩施蒂凡芽孢杆菌Bacillus weihenstephanensis
SIIA-Z64 谷氨酸芽孢杆菌Bacillus luti
SIIA-Z626 栗褐芽孢杆菌Bacillus badius
SIIA-Z585  Bacillus encimensis 
SIIA-Z650 印度芽孢杆菌Bacillus indicus
SIIA-Z783 病研所芽孢杆菌Bacillus idriensis
SIIA-Z148 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus
SIIA-Z623 运动芽孢杆菌Bacillus mobilis
SIIA-Z620 斯韦泽伊芽孢杆菌Bacillus swezeyi
3.2.2 系统发育分析

47株芽孢杆菌自聚类分析(图 1)显示,首先,各湖泊沉积物样品中所分离出的菌株分别聚为一簇,说明同一环境中的菌株之间亲缘关系相近;而不同地区的菌株大不相同,说明地区之间可能由于气候和经纬度差异,造成微生物种群差异。其次,菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z530、SIIA-Z537 和SIIA-Z531 均来自邛海,且聚为一簇,可靠度达78%,同源性较高。菌株SIIA-Z858、SIIA-Z656、SIIA-Z665 和SIIA-Z573 均来自泸沽湖,且聚为一簇,可靠度高达100%,同源性非常高,进化关系极为相近,说明同一生境更易产生亲缘关系相近的菌种。最后,来自洱海的菌株SIIA-Z536、来自红枫湖的SIIA-Z582与邛海分离出的菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z537、SIIA-Z530、SIIA-Z531 均属漳州芽孢杆菌,说明不同环境可以产生相同菌种。可见湖泊生境对于微生物多样性研究有着重要意义。

图 1 菌株基于16S rRNA基因序列分析构建的系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic dendrogram constructed based on 16S rRNA gene sequences
3.3 发酵产物对病原菌的活性研究

采用琼脂扩散法对47株菌株发酵粗提物进行抗菌活性筛选(表 5)。结果显示,共13株发酵粗提物对动物病原菌显示出抗菌活性。其中,对金黄色葡萄球菌显示出抗菌活性的菌株较多,有10株,对白色念珠菌有抗菌活性的5株,对大肠杆菌有抗菌活性的4株,而对铜绿假单胞菌显示出抗菌活性的仅2株。为明确活性化合物种类,将进一步对活性菌株的发酵粗提物进行LC-MS 分析。

表 5 芽孢杆菌次级代谢产物对动物病原菌的抗菌活性 Table 5 Antimicrobial activity of Bacillus submetabolites against animal pathogens
菌株 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
大肠杆菌
Escherichia coli
白色念珠菌
Candida albicans
铜绿假单胞菌
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus luti SIIA-Z64 +++ + - ++
Bacillus tequilensis SIIA-Z160 + - - -
Bacillus butanolivorans SIIA-Z153 - - + -
Bacillus atrophaeus SIIA-Z654 +++ + - -
Bacillus weihenstephanensis SIIA-Z154 + - ++ -
Bacillus cereus SIIA-Z148 + - - -
Bacillus butanolivorans SIIA-Z96 + - + -
Bacillus altitudinis SIIA-Z66 - + - -
Bacillus halmapalus SIIA-Z550 ++ - + -
Bacillus mobilis SIIA-Z623 - + - -
Bacillus marisflavi SIIA-Z663 + - - +
Bacillus altitudinis SIIA-Z790 + - - -
Bacillus aryabhattai SIIA-Z798 ++ - + -
  注:+有抑菌活性,-无抑菌活性
  Notes:+bacteriostatic activity,-no bacteriostatic activity
3.4 活性菌株代谢产物的LC-MS 分析

对13株有抗菌活性菌株的发酵粗提物进行LC- MS 分析,结果表明,芽孢杆菌所产生活性化合物主要为脂肽类。通过LC-MS 检测到4种不同的质谱峰,各活性特征峰的分子量及根据质荷比推断产物归属类别如表 6所示。发酵粗提物中,检测到 surfactins质子峰的芽孢杆菌9株,均为C13~C15的 surfactins质子峰,m/z=1 007.9、1 023.4和1 037.7,为相差1个亚甲基(-CH2-)的同系物;检测到 fengycins质子峰的芽孢杆菌5株,均为C15、C16的 fengycins质子峰,m/z=1 449.3和1 464.9,也为相差1个亚甲基(-CH2-)的同系物;检测到 iturins质子峰的芽孢杆菌6株,其中,bacillomycin L 质子峰4株,bacillomycin D 质子峰2株。分析发现,有14株产表面活性素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌或大肠杆菌有抑菌活性,有2株产丰原素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对铜绿假单胞菌有抑菌活性,有5株产伊枯草素类抗菌脂肽的芽孢杆菌对白色念珠菌有抑菌活性。

表 6 活性芽孢杆菌菌株的LC-MS分析 Table 6 LC-MS analysis of active Bacillus strains
菌株 质荷比推断产物 分子量
M M+H+ M+Na+
Bacillus luti SIIA-Z64 Surfactin A (C13) 1 006.9 1 007.9 1 029.9
Bacillomycin D (C14) 1 030.2 1 031.2 1 053.2
Fengycin A (C15) 1 448.3 1 449.3 1 471.3
Bacillus tequilensis SIIA-Z160 Surfactin A (C13) 1 006.9 1 007.9 1 029.9
Surfactin B (C14) 1 022.4 1 023.4 1 045.4
 Bacillus butanolivorans SIIA-Z153 Bacillomycin L (C13) 1 021.5 1 022.5 1 044.5
Bacillus atrophaeus SIIA-Z654 Surfactin B (C14) 1 022.4 1 023.4 1 045.4
Surfactin C (C15) 1 036.7 1 037.7 1 059.7
Bacillus weihenstephanensis SIIA-Z154 Fengycin A (C15) 1 448.3 1 449.3 1 471.3
Bacillomycin L (C13) 1 021.5 1 022.5 1 044.5
 Bacillus cereus SIIA-Z148 Surfactin C (C15) 1 036.7 1 037.7 1 059.7
Bacillus butanolivorans SIIA-Z96 Surfactin A (C13) 1 006.9 1 007.9 1 029.9
Bacillomycin D (C15) 1 043.6 1 044.6 1 066.6
Bacillus altitudinis SIIA-Z66 Surfactin A (C13) 1 006.9 1 007.9 1 029.9
Surfactin C (C15) 1 036.7 1 037.7 1 059.7
Bacillus halmapalus SIIA-Z550 Fengycin B (C16) 1 463.9 1 464.9 1 486.9
Bacillomycin L (C14) 1 033.5 1 034.5 1 056.5
Bacillus mobilis SIIA-Z623 Surfactin A (C13) 1 006.9 1 007.9 1 029.9
Surfactin B (C14) 1 022.4 1 023.4 1 045.4
Bacillus marisflavi SIIA-Z663 Fengycin A (C15) 1 448.3 1 449.3 1 471.3
Surfactin C (C15) 1 036.7 1 037.7 1 059.7
Bacillus altitudinis SIIA-Z790 Surfactin B (C14) 1 022.4 1 023.4 1 045.4
Surfactin C (C15) 1 036.7 1 037.7 1 059.7
Bacillus aryabhattai SIIA-Z798 Fengycin A (C15) 1 448.3 1 449.3 1 471.3
Bacillomycin L (C14) 1 033.5 1 034.5 1 056.5
4 讨论

芽孢杆菌可产生多种抗菌物质,其中大部分为脂肽类化合物,脂肽属于非核糖体肽,而非核糖体肽是当前的研究热点。目前,我国对抗菌脂肽的研究还不够深入,即使在发达国家,也是一个新的领域。国内外对芽孢杆菌脂肽类化合物的研究大部分集中在抗真菌,尤其是抗植物病原真菌,只有少部分研究集中在抗细菌(李红亚等,2017),对抗动物病原菌的研究则更鲜有。

据报道,芽孢杆菌产生的脂肽类化合物有表面活性素家簇、伊枯草素家簇和丰原素家簇(Tsuge et al ., 2001Koumoutsi et al ., 2004Moyne et al ., 2004Chen et al ., 2006)。其中,iturins和 fengycins作为农业生产中常见植物真菌疾病的生物防治药(Romero et al ., 2004, 2007Luo et al ., 2015)。Surfactins主要对细菌产生抑制作用(罗楚平等,2011Zeriouh et al ., 2011Gordillo & Maldonado,2012Meena & Kanwar,2015)。近年来,由于动物病原菌抗耐药情况的日益严重,人们开始尝试将芽孢杆菌脂肽类化合物用于动物病原菌的防治,效果显著。已有研究表明,在畜禽生产中芽孢杆菌具有调节动物肠道菌群平衡、抑制动物病原菌、防治消化道疾病以及提高机体免疫力等作用(李红亚等,2017)。在西方国家芽孢杆菌已被应用于人的功能性食品和动物饲料添加剂(叶小兰,杨倩,2011)。与细菌素等抗菌物质相比,芽孢杆菌所产生的抗菌脂肽杀菌范围更广、效率更高、毒副作用更小、稳定性更好。此外,抗菌脂肽对血凝、病毒和肿瘤也有很好的抗性。综上所述,由芽孢杆菌生产的脂肽类抗生素在农业、医药以及化妆品行业都具有巨大的应用前景(Aarrebola et al ., 2010)。

国内外大多从土壤环境中分离产抗菌脂肽的芽孢杆菌,且研究对象多为单一菌株。本研究从湖泊沉积物中分离出47株芽孢杆菌,以4株常见动物病原菌为检定菌进行活性检测,筛选出13株活性菌株,LC-MS技术对13株芽孢杆菌发酵产物的分析显示,有3种脂肽类抗生素,分别为表面活性素、伊枯草素和丰原素。活性检测表明,脂肽类抗生素对动物病原菌有显著的抗菌活性。本研究为丰富特殊生境中芽孢杆菌资源在畜禽疾病控制方面的研究提供了新的菌种资源。

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