四川动物  2018, Vol. 37 Issue (4): 406-414

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张泽源, 秦耀光, 李枢强
ZHANG Zeyuan, QIN Yaoguang, LI Shuqiang
应用DNA条形码技术鉴别寄生紫薇绒蚧的跳小蜂
Application of DNA Barcoding in Identification of Encyrtid Parasitoids of Acanthococcus (=Eriococcus) lagerstroemiae
四川动物, 2018, 37(4): 406-414
Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(4): 406-414
10.11984/j.issn.1000-7083.20170291

文章历史

收稿日期: 2017-09-21
接受日期: 2018-04-23
应用DNA条形码技术鉴别寄生紫薇绒蚧的跳小蜂
张泽源1 , 秦耀光2 , 李枢强2*     
1. 中国人民大学附属中学分校, 北京 100080
2. 中国科学院动物进化与系统学重点实验室, 中国科学院动物研究所, 北京 100101
摘要:紫薇绒蚧Acanthococcus(=Eriococcuslagerstroemiae是危害石榴Punica granatum L.和紫薇Lagerstroemia indica L.的重要害虫。跳小蜂是紫薇绒蚧的寄生性天敌,对防治紫薇绒蚧有重要作用。本研究通过饲养中国不同地区紫薇绒蚧若虫或雌成虫获取跳小蜂样本,利用DNA条形码技术对9种跳小蜂进行物种鉴定。共获取了93个跳小蜂样本的线粒体COⅠ基因序列。分析结果显示,9种跳小蜂种间遗传距离为0.073 2~0.186 4,平均为0.111 0;种内遗传距离为0~0.026 5,平均为0.007 4。9种跳小蜂的种间遗传变异远大于种内遗传变异。DNA条形码技术可以快速、准确鉴定这9种跳小蜂以弥补形态分类学的不足。
关键词跳小蜂     线粒体COⅠ基因     物种鉴定     紫薇绒蚧    
Application of DNA Barcoding in Identification of Encyrtid Parasitoids of Acanthococcus (=Eriococcus) lagerstroemiae
ZHANG Zeyuan1 , QIN Yaoguang2 , LI Shuqiang2*     
1. Division of the High School Affiliated to Renmin University of China, Beijing 100080, China;
2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: Acanthococcus (=Eriococcus) lagerstroemiae is an important pest of Punica granatum L. and Lagerstroemia indica L. and broadly distributed in China. Encyrtid parasitoids play a key role in the control of A. (=Eriococcus) lagerstroemiae. We obtained samples of the encyrtid parasitoids by rearing them from nymphs of A. (=Eriococcus) lagerstroemiae collected from different areas of China. DNA barcoding approach was applied to the identification of encyrtid parasitoids and followed by a preliminary morphological identification. DNA sequence data of the mitochondrial COⅠ gene were generated from 93 individuals of encyrtid parasitoids. The results showed that the inter-specific COⅠ divergence was 0.073 2~0.186 4 with an average of 0.111 0; and the intra-specific COⅠ variation was 0~0.026 5 with an average of 0.007 4. The inter-specific COⅠ divergence was greatly larger than intra-specific COⅠ variation in the encyrtid parasitoid species. Our results indicated that, as a complementary approach to morphology, DNA barcoding can help us to rapidly and accurately identify the encyrtid species.
Keywords: encyrtid parasitoids     mitochondrial COⅠ gene     species identification     Acanthococcus (=Eriococcus) lagerstroemiae    

紫薇绒蚧Acanthococcus (= Eriococcus) lagerstroemiae隶属于半翅目Hemeptera毡蚧科Eriococcidae,常被称为紫薇绒粉蚧、石榴毡蚧、石榴绒粉蚧,在我国分布广泛(赵洋民等,1997姜年俊,许惠,1998贺冬英等,2008赵文娟等,2016),国外分布于韩国、日本等,是危害石榴Punica granatum L.和紫薇Lagerstroemia indica L.的主要害虫(张钦书,孟庆喜,1990马金华,2011)。2004年紫薇绒蚧首次在北美被发现,目前在美国12个州有分布(Merchant et al., 2014Wang et al., 2016),被认为是危害紫薇的重要入侵生物(Wang et al., 2016)。随着农药应用比重减小,利用寄生蜂防治紫薇绒蚧变得日益重要。

姜年俊和许惠(1998)焦浩和张玉俊(2011)在紫薇绒蚧防治研究中提到了寄生蜂的作用,但未明确具体的种类。根据徐志宏和黄建(2004)的记载,寄生紫薇绒蚧的跳小蜂有4种:绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus (=Aphycus) eriococci、绵蚧阔柄跳小蜂Metaphycus pulvinariae、绒蚧亚翅跳小蜂Submicroterys eriococci和食绒蚧亚翅跳小蜂Submicroterys eriococcophagus,但是否均寄生紫薇绒蚧需进一步核实。准确鉴定寄生紫薇绒蚧的跳小蜂物种是研究其生物学特性及保护与利用的前提和基础。但跳小蜂种类多、个体微小(通常为1~2 mm),利用形态特征鉴定时常常需要制作玻片标本并在显微镜下观察分类特征。另外,隐存种现象在昆虫中非常普遍(Bickford et al., 2007),营寄生生活昆虫的该现象可能更加突出(Smith et al., 2008),这导致仅依靠形态特征对跳小蜂进行种类鉴定变得愈加困难,而且容易产生误差。DNA条形码技术作为一种辅助物种鉴定的工具(Hebert et al., 2003),近年来得到了广泛应用,在昆虫鉴定方面应用前景广阔(肖金花等,2004张合彩,乔格侠,2008宋南等,2013)。近几年,该技术在寄生蜂鉴定中同样表现出很高的应用价值(Zhou MJ et al., 2012Zhou QS et al., 2014),不但解决了一些近缘种、隐存种等分类学难题,同时也对阐明寄生蜂对寄主的专化性起到了重要作用(Zhang et al., 2011Chesters et al., 2012Zhou et al., 2018)。

本研究首先对寄生紫薇绒蚧的跳小蜂种类做了野外调查,获取了北京、山东、江苏、江西、湖北、湖南、云南、黑龙江、内蒙古、广西、宁夏、四川、山西和海南的跳小蜂样本。针对跳小蜂体型小、外部形态变异程度难以把握等分类中的难题,采用分子生物学方法,利用线粒体COⅠ基因的特异性片段(DNA条形码)来区分和识别寄生紫薇绒蚧的几种跳小蜂,为今后紫薇绒蚧寄生蜂的快速鉴定和深入系统研究提供有效数据参考。

1 材料和方法 1.1 样本的采集、保存和鉴定

本研究中的寄生蜂,除特别指出,均是育自紫薇绒蚧的若虫或雌成虫,紫薇绒蚧的采集和饲养方法参考Zhang等(2011)。野外采集带有紫薇绒蚧的老龄若虫或成虫的植物枝条并尽快带回实验室观察。在室内将带有紫薇绒蚧若虫或成虫的枝条剪短,放在塑料杯或者尼龙袋中饲养;每天观察出蜂情况,发现有羽化的寄生蜂即用毛刷将其收集于塑料管中,用无水乙醇浸泡杀死,-4 ℃存放。在体视镜下检视收集到的标本,参考文献(徐志宏,黄建,2004Zhang & Huang,2004Wang et al., 2014)进行初步形态分类并通过专家的复核。每个形态种选取一定的样本用于分子研究,并对所选样本拍照,便于后期进一步核对。材料样本信息见表 1

表 1 跳小蜂样品采集信息 Table 1 Sampling information of encyrtids
编号
Code
形态种名
Species
地点
Locality
时间
Collecting date
寄主植物
Host plant
GenBank登录号
GenBank
accession No.
11-096 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 北京海淀 2008/05/04 紫薇Lagerstroemia indica MH119345
11-319 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 北京海淀 2008/05/10 紫薇Lagerstroemia indica MH119346
E4-028A 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119347
E4-028B 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119348
11-067A 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖北荆州 2011/05/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119349
11-067B 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖北荆州 2011/05/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119350
11-067C 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖北荆州 2011/05/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119351
E2-001A 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖南郴州 2013/04/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119352
E2-001B 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖南郴州 2013/04/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119353
E2-001C 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖南郴州 2013/04/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119354
E2-001D 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖南郴州 2013/04/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119355
E2-001E 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 湖南郴州 2013/04/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119356
E3-154A 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119357
E3-154B 细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119358
TMe-1A 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2004/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119359
TMe-1B 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2004/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119360
TMe-1C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2004/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119361
TMe-1D 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2004/08 紫薇Lagerstroemia indica MH119362
11-305 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2006/05/16 石榴Punica granatum MH119363
E4-028C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119364
E4-028D 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119365
E4-028E 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119366
E4-028F 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 北京海淀 2014/05/15 紫薇Lagerstroemia indica MH119367
E3-104 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 山东莱州 2012/10/14 紫薇Lagerstroemia indica MH119380
E3-104B 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 山东莱州 2012/10/14 紫薇Lagerstroemia indica MH119379
E3-104C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 山东莱州 2012/10/14 紫薇Lagerstroemia indica MH119378
E3-105 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 山东莱州 2012/10/14 紫薇Lagerstroemia indica MH119381
E3-105B 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 山东莱州 2012/10/14 紫薇Lagerstroemia indica MH119382
10-116A 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119370
10-116B 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119371
10-116C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119372
10-116D 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119373
E4-122A 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119374
E4-122B 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119375
E4-122C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119376
E4-122D 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119377
E2-136 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江西南昌 2012/10/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119368
E2-137 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 江西南昌 2012/10/13 紫薇Lagerstroemia indica MH119369
E3-154C 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119384
E3-154D 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119385
E3-154E 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119386
E3-154F 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 云南蒙自 2013/04/21 紫薇Lagerstroemia indica MH119387
E3-212 绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci 云南文山 2013/04/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119383
07-93 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 北京朝阳 2012/09/04 紫薇Lagerstroemia indica MH119388
E2-103A 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 北京海淀 2012/07/17 紫薇Lagerstroemia indica MH119389
E2-103B 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 北京海淀 2012/07/17 紫薇Lagerstroemia indica MH119390
09-010A 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119391
09-010B 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119392
09-010C 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119393
09-010D 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119394
09-010E 绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119395
E2-046A 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 北京海淀 2012/07/17 紫薇Lagerstroemia indica MH119396
E2-046B 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 北京海淀 2012/07/17 紫薇Lagerstroemia indica MH119397
10-117 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119398
10-118A 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119399
10-118B 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 江苏南京 2009/10/12 紫薇Lagerstroemia indica MH119400
E3-002A 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 云南文山 2013/04/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119406
E3-002B 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 云南文山 2013/04/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119407
E3-002C 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 云南文山 2013/04/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119408
E4-123A 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119401
E4-123B 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119402
E4-123C 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119403
E4-123D 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119404
E4-123E 绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci 湖北黄冈 2014/06/22 紫薇Lagerstroemia indica MH119405
11-092 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae 北京海淀 2014/06/20 糖槭Acer saccharum MH119409
E2-030B 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae 黑龙江哈尔滨 2012/06/10 糖槭Acer saccharum MH119410
E2-030C 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae 黑龙江哈尔滨 2012/06/10 糖槭Acer saccharum MH119411
E2-030D 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae 黑龙江哈尔滨 2012/06/10 糖槭Acer saccharum MH119412
E2-030E 水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae 黑龙江哈尔滨 2012/06/10 糖槭Acer saccharum MH119413
E1-190A 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 内蒙古贺兰山 2010/08/10 未知Unknown MH119414
E1-190B 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 内蒙古贺兰山 2010/08/10 未知Unknown MH119415
E1-190C 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 内蒙古贺兰山 2010/08/10 未知Unknown MH119416
E1-190D 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 内蒙古贺兰山 2010/08/10 未知Unknown MH119417
E2-122A 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 北京昌平 2009/04/25 未知Unknown MH119418
E2-122B 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 北京昌平 2009/04/25 未知Unknown MH119419
E2-122C 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 北京昌平 2009/04/25 未知Unknown MH119420
E2-122D 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 北京昌平 2009/04/25 未知Unknown MH119421
E2-122E 加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon 北京昌平 2009/04/25 未知Unknown MH119422
E2-097 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 云南景洪 2012/05/14 未知Unknown MH119423
E2-189 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 四川攀枝花 2009/04/25 榕树Figus sp. MH119424
E5-117A 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 广西宜州 2009/04/25 假连翘Duranta repens MH119425
E5-117C 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 广西宜州 2009/04/25 假连翘Duranta repens MH119426
E5-117D 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 广西宜州 2009/04/25 假连翘Duranta repens MH119427
E5-117E 杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi 广西宜州 2009/04/25 假连翘Duranta repens MH119428
08-58 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 山西五台山 2007/07/18 未知Unknown MH119429
10-007 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 山西五台山 2009/07/20 未知Unknown MH119430
10-173A 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 宁夏银川 2010/07/06 未知Unknown MH119431
10-173B 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 宁夏银川 2010/07/06 未知Unknown MH119432
10-173C 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 宁夏银川 2010/07/06 未知Unknown MH119433
E1-222A 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 内蒙古贺兰山 2010/08/11 未知Unknown MH119434
E1-222B 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 内蒙古贺兰山 2010/08/11 未知Unknown MH119435
E1-222C 亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens 内蒙古贺兰山 2010/08/11 未知Unknown MH119436
07_04 刷盾跳小蜂(外群)Encyrtus sp. (outgroup) 海南五指山 2007/05/15 未知Unknown MH119344
1.2 基因组总DNA的提取

先用蒸馏水冲洗选取的跳小蜂虫体,放于滤纸上,晾干后使用试剂盒(Qiagene Tissue DNA Kit)提取各样品的DNA,过程严格按照试剂盒说明书操作。凝胶电泳检测DNA质量。将合格的DNA样品放入4 ℃备用,或-20 ℃长期保存。

1.3 PCR扩增

目的线粒体COⅠ基因片段扩增选用的引物对参考Zhang等(2011)。PCR扩增的反应体系:5 μL 10×buffer PCR缓冲液,25 mM MgCl2,5 mM dNTP混合液,0.5 U TaqDNA聚合酶,正反向引物各10 pmol和5 μL DNA模板。PCR扩增反应程序为:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,回收后的产物送测序公司用ABI3730测序仪双向测序。

1.4 数据处理

获得的线粒体COⅠ基因片段与GenBank下载的COⅠ基因序列经Clustal W(Thompson et al., 1994)比对后用BioEdit 7.0.5 (Hall,1999)进一步编辑,使用MEGA4(Tamura et al., 2007)分析各序列的碱基组成、保守位点、变异位点、转换与颠换的比值(R)等。选取刷盾跳小蜂Encyrtus sp.为外群,采用邻接法(NJ法)构建基因树(K2P模型),并计算种间和种内遗传距离。另外使用BarcodingR(Zhang et al., 2017)对寄生紫薇绒蚧的跳小蜂以及阔柄跳小蜂属Metaphycus属内种间和种内遗传距离的间隔进行分析评估。

2 结果和分析

外部形态特征分类结果显示,本次收集的寄生紫薇绒蚧的跳小蜂为绒蚧阔柄跳小蜂、细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus、绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE和绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci。阔柄跳小蜂属内其他非寄生紫薇绒蚧的种类分别为水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae、加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon、杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi和亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens

2.1 COⅠ基因片段序列碱基组成

本研究共获取了93个跳小蜂样本的线粒体COⅠ基因片段序列(GenBank登录号:MH119344~ MH119436),其中,绒蚧阔柄跳小蜂29条、细柄阔柄跳小蜂14条、绒蚧花翅跳小蜂8条、绒蚧皂莫跳小蜂13条、水木坚蚧阔柄跳小蜂5条、加蒙阔柄跳小蜂9条、杰氏阔柄跳小蜂6条、亮光阔柄跳小蜂8条、刷盾跳小蜂1条。另外,从NCBI数据库中获取黄色阔柄跳小蜂Metaphycus flavus序列1条(GenBank登录号:FM210164)(Pasquer et al., 2009)。截取COⅠ基因序列两端不可靠的碱基后得到长度为612 bp的碱基矩阵。MEGA4分析结果显示,在线粒体COⅠ条形码区域中,A与T的含量非常高(A=28.8%,C=12.4%,G=15.1%,T=43.6%)。GC含量在密码子第三位点平均为8.7%,明显低于第一位点和第二位点(平均为34.4%和39.4%)。共检测到391个保守位点,221个变异位点,R=0.87。

2.2 分子系统树分析

以刷盾跳小蜂为外群,基于94条跳小蜂线粒体COⅠ基因序列数据矩阵构建NJ树,结果(图 1)显示,内群93条跳小蜂COⅠ基因序列聚成9个大的分支,并且除黄色阔柄跳小蜂序列少无法统计支持率外,其他每个分支都有>95%的支持率。这9个分支分别对应9个形态种,其中,阔柄跳小蜂属为单系群。此外,绒蚧阔柄跳小蜂分成了2个较为明显的分支,表明该种内部存在较明显的分化。

图 1 基于跳小蜂COⅠ基因序列构建的邻接树 Fig. 1 Neighbour-Joining tree based on the COⅠ sequences of encyrtids
2.3 种间和种内的遗传距离

应用MEGA4计算9种跳小蜂线粒体COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离。结果显示(表 2),绒蚧阔柄跳小蜂的种内遗传距离最大,为0~0.054 9,平均为0.026 5;细柄阔柄跳小蜂和绒蚧皂莫跳小蜂的种内平均遗传距离次之,分别为0.014 7和0.010 4。跳小蜂各种间平均遗传距离为0.073 2~0.186 4(表 3),其中,绒蚧花翅跳小蜂和绒蚧皂莫跳小蜂的种间平均遗传距离最大,为0.186 4;细柄阔柄跳小蜂和黄色阔柄跳小蜂的种间平均遗传距离最小,为0.073 2。对NJ树上绒蚧阔柄跳小蜂2个较明显的分支进行遗传距离分析显示,它们之间的平均遗传距离为0.041 8,分支内平均遗传距离分别为0.018 6(分支1)和0.003 7(分支2)。本研究中9种跳小蜂线粒体COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离显示,各跳小蜂的种内遗传距离与种间遗传距离间没有重叠区域,即种间遗传距离和种内遗传距离之间有间隔(图 2)。

表 2 9种跳小蜂的种内平均遗传距离 Table 2 Intra-species genetic distance of encyrtids
物种
Species
种内平均遗传
距离(范围)
Intra-species genetic
distance (range)
标准误
Standard error
绒蚧皂莫跳小蜂
Zaomma eriococci
0.010 4(0~0.016 6) 0.002 6
绒蚧花翅跳小蜂
Microterys spE
0.001 5(0~0.003 3) 0.001 1
细柄阔柄跳小蜂
Metaphycus cylindricus
0.014 7(0~0.016 7) 0.003 5
绒蚧阔柄跳小蜂
Metaphycus eriococci
0.026 5(0~0.054 9) 0.004 9
水木坚蚧阔柄跳小蜂
Metaphycus corniae
0.004 6(0~0.022 1) 0.001 8
黄色阔柄跳小蜂
Metaphycus flavus
加蒙阔柄跳小蜂
Metaphycus garmon
0.009 0(0~0.013 4) 0.002 8
杰氏阔柄跳小蜂
Metaphycus gerardi
亮光阔柄跳小蜂
Metaphycus nitens

表 3 9种跳小蜂的种间平均遗传距离(左下三角)与标准误(右上三角) Table 3 Inter-species genetic distance of the encyrtid parasitoids (lower-left) and standard error (upper-right)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 0.011 8 0.016 7 0.016 8 0.013 3 0.011 4 0.012 8 0.014 7 0.012 5
2 0.086 3 0.017 1 0.016 9 0.014 1 0.011 6 0.012 4 0.014 2 0.012 6
3 0.157 9 0.162 8 0.019 3 0.019 6 0.015 9 0.017 7 0.017 2 0.017 3
4 0.157 9 0.167 7 0.186 4 0.017 3 0.016 0 0.017 1 0.018 4 0.017 4
5 0.106 5 0.118 6 0.183 0 0.156 9 0.013 7 0.015 9 0.015 6 0.015 9
6 0.073 2 0.082 9 0.141 4 0.139 7 0.102 1 0.013 5 0.013 4 0.012 2
7 0.094 4 0.090 9 0.168 5 0.168 4 0.124 4 0.094 6 0.015 5 0.012 0
8 0.124 3 0.111 5 0.155 3 0.170 3 0.128 3 0.096 5 0.125 2 0.015 6
9 0.094 1 0.091 7 0.162 4 0.163 6 0.130 8 0.077 4 0.078 4 0.118 3
注Notes:1.细柄阔柄跳小蜂Metaphycus cylindricus,2.绒蚧阔柄跳小蜂Metaphycus eriococci,3.绒蚧花翅跳小蜂Microterys spE,4.绒蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci,5.水木坚蚧阔柄跳小蜂Metaphycus corniae,6.黄色阔柄跳小蜂Metaphycus flavus,7.加蒙阔柄跳小蜂Metaphycus garmon,8.杰氏阔柄跳小蜂Metaphycus gerardi,9.亮光阔柄跳小蜂Metaphycus nitens

图 2 9种跳小蜂COⅠ基因序列的种内与种间遗传距离的分布频率(K2P模型) Fig. 2 Frequency distribution of the intra- and inter-species genetic distances of 9 encyrtid species based on COⅠ sequences (K2P model)
3 讨论

本研究利用DNA条形码技术鉴别了我国9种跳小蜂,其种间遗传距离远大于种内遗传距离,且两者没有重叠,表明DNA条形码技术能区别我国寄生紫薇绒蚧的跳小蜂种类。研究结果显示,属间的遗传距离大于属内不同种间,并且NJ树显示寄生紫薇绒蚧的几种跳小蜂各聚类成单系群,表明DNA条形码能够区分这9种跳小蜂。这与之前关于利用DNA条形码鉴别跳小蜂种类的研究结论(Zhang et al., 2011Chesters et al., 2012)一致。

本研究中,阔柄跳小蜂属的种类属于同一个种团,亲缘关系相近,形态差别很小(Wang et al., 2014)。但是DNA条形码分析结果显示,它们之间的遗传距离远大于目前DNA条形码研究中通用的分种标准(遗传距离>4%)。这表明DNA条形码技术对同属的跳小蜂近缘种具有很好的识别效果。另外,DNA条形码技术也有助于了解物种内的分子变异程度。研究结果显示,绒蚧阔柄跳小蜂的COⅠ基因序列聚成2个分支,并且2个分支间的平均遗传距离较大。但是观察这2个分支上的样本,其外部形态几乎没有差别或差别极小,在地理分布上,这2个分支上的样本明显重叠,这种遗传结构形成的机制或是否存在隐存种需要进一步研究。

跳小蜂种类较多,寄生关系比较复杂,且对于我国跳小蜂种类和寄生关系也缺乏系统深入的调查。本研究使用的跳小蜂种类有限,特别是同属种类较少,因此,基于COⅠ基因计算跳小蜂的种内和种间遗传距离是否存在间隔还有待进一步研究。本研究中9种跳小蜂的种内和种间遗传距离不存在重叠,且进化树上各形态种形成单系,表明了DNA条形码技术可以快速、准确地鉴别这几种寄生紫薇绒蚧跳小蜂。随着未来其他寄生蜂种类COⅠ基因序列信息的不断补充与完善,DNA条形码技术必将对研究我国蚧虫寄生蜂的物种识别、阐明寄生蜂对寄主的专化性规律和利用寄生蜂开展有效的生物防治产生积极的推动作用。

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