四川动物  2018, Vol. 37 Issue (4): 373-380

扩展功能

文章信息

艾永斌, 杨旭升, 彭卫华, 陈云梅, 徐凉燕, 罗剑, 夏云, 曾晓茂
AI Yongbin, YANG Xusheng, PENG Weihua, CHEN Yunmei, XU Liangyan, LUO Jian, XIA Yun, ZENG Xiaomao
体表擦拭取样在两栖动物保护遗传学研究中的应用
The Application of Extracting DNA from Skin Swabbing in Amphibians
四川动物, 2018, 37(4): 373-380
Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(4): 373-380
10.11984/j.issn.1000-7083.20170293

文章历史

收稿日期: 2017-09-23
接受日期: 2018-04-23
体表擦拭取样在两栖动物保护遗传学研究中的应用
艾永斌1 , 杨旭升2,3 , 彭卫华1 , 陈云梅1 , 徐凉燕1 , 罗剑1 , 夏云2 , 曾晓茂2*     
1. 四川申果庄省级大熊猫自然保护区管理处, 四川越西 616650
2. 中国科学院成都生物研究所, 成都 610041
3. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要:相比于其他取样方法,非损伤性取样对动物的伤害可以降到最低,因而在动物保护研究中有着重要的价值。在两栖类中通过体表擦拭进行非损伤性取样的方法已有报道,但是相关研究仅局限于零星物种,且均是在实验室环境下完成取样,并不适用于野外就地取样。本研究对四川申果庄省级大熊猫自然保护区内有尾两栖类及无尾两栖类6科10属11种进行了就地擦拭取样。线粒体基因序列分析表明,体表擦拭取样法获得的DNA能满足常规的分子生物学实验要求,可用于水生、陆栖等各种两栖动物类群,可在两栖类保护遗传学研究中广泛应用。
关键词体表擦拭取样     两栖类     保护遗传学    
The Application of Extracting DNA from Skin Swabbing in Amphibians
AI Yongbin1 , YANG Xusheng2,3 , PENG Weihua1 , CHEN Yunmei1 , XU Liangyan1 , LUO Jian1 , XIA Yun2 , ZENG Xiaomao2*     
1. Administrative Office of Shenguozhuang Provincial Giant Panda Nature Reserve, Yuexi, Sichuan Province 616650, China;
2. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Compared to other sampling methods, non-invasive sampling can minimize the damage to animals, so it has important value for animal protection. There is only a few reports on skin swabbing in a limited number of amphibian species, and the sampling methods are all performed in laboratory environment and are not suitable for application in the wild fields. In this study, Shenguozhuang Provincial Giant Panda Nature Reserve in Sichuan was selected as the research area. The skin swabbing method was used on wild populations of 11 amphibian species to test DNA yields and quality. Finally, the DNA was successfully obtained and multiple of genetic markers were amplified. Based on PCR performance, DNA yields and sampling considerations, the method of skin swab sampling was confirmed to work well to obtain DNA without harming the amphibian. Therefore, skin swabbing is a reliable method for obtaining genetic data from endangered amphibian without jeopardizing their survival.
Keywords: skin swab sampling     amphibian     conservation genetics    

在两栖动物遗传学和分子生物学的相关研究中,为了获取DNA,常常需要获得动物的组织样品。早期研究往往采取损伤性取样,即处死动物后获取样品。随着人们保护意识的提高,非损伤性取样即非损伤性基因取样得到广泛应用,包括剪趾法、活体组织检查和针刺取血等方法(Maddock et al., 2014)。相比之下,非损伤性取样既可以满足生物学研究的要求,也在一定程度上保护了物种的生存和繁殖。

在非损伤性取样方法中,剪趾法对两栖动物伤害最大,主要是因为两栖动物适应水陆两栖的生活,栖息环境中存在大量病菌,皮肤作为免疫防御机制对于两栖动物抵御病菌至关重要,因此,剪趾或者剪尾易导致两栖动物死亡。Parris等(2010)在3种无尾类中比较了口腔取样、剪趾取样、蝌蚪剪尾取样对动物的伤害程度,发现剪趾法对动物伤害最大,在实验室饲养,同时用消炎药处理伤口的前提下,非损伤性取样后西方蟾蜍Bufo boreas的死亡率为0.35%。此外,在野外两栖动物的监测项目中,通常会采用剪趾法作标志重捕,而剪趾会影响动物的存活率和重捕率,进而影响对整个种群数量的评估(McCarthy et al., 2009吴军等,2013)。

目前报道的用于两栖动物的非损伤性取样方法有口腔擦拭取样和体表皮肤擦拭取样:Poschadel和Möller(2004)描述了在陆龟科Testudinidae、蛙科Ranidae、蝾螈科Salamandridae、蟾蜍科Bufonidae动物中通用的口腔取样方法,即用1个小勺子轻轻打开动物口腔,然后用棉签沾取口腔内的黏液;Broquet等(2007)在高山欧螈Triturus alpestris和无斑雨蛙Hyla arborea中验证了口腔擦拭得到的DNA样品可以用于微卫星分型研究;Mendoza等(2012)在卵齿蟾Eleutherodactylus johnstonei中用棉签擦拭表皮来获取DNA样品,并用16S rRNA做了分析;Guo等(2013)通过电极刺激中国大鲵Andrias davidianus的体表,收集皮肤黏液和皮肤脱落物作为组织样品;Maddock等(2014)在蚓螈目Gymnophiona 5个物种中尝试了口腔擦拭、皮肤擦拭取样,均成功获取DNA。

迄今,采用口腔擦拭取样在两栖动物中应用较多,但此法受动物个体限制,小型个体或幼体不易操作。相对而言,体表皮肤擦拭取样应用更广泛,不受发育期的限制,适用于成体、幼体或蝌蚪期任一发育阶段。但已知的皮肤擦拭取样的研究局限于个别物种,能否普及到各类群尚不得知;另一方面,已知的取样方法多为在实验室对活体的操作,不适用于野外就地取样。基于此,本研究通过比较分析,尝试野外就地体表擦拭取样、野外就地干燥保存、DNA高效提取等方法,对四川申果庄省级大熊猫自然保护区内的有尾两栖类及无尾两栖类6科10属11种进行研究,以期验证体表擦拭取样在野外工作中的可行性。

1 材料和方法 1.1 实验材料

2017年4月和6月对四川申果庄省级大熊猫自然保护区(102°42′00″~102°54′17″E,28°28′13″~28°41′54″N)内的有尾类及无尾类就地随机取样,共计6科10属11种,采样信息见表 1

表 1 四川申果庄省级大熊猫自然保护区物种采样信息 Table 1 Information of samples collected from Shenguozhuang Provincial Giant Panda Nature Reserve, Sichuan
物种
Species
采集时间
Collecting date
数量
Number/只
Ⅰ无尾目Anura
一角蟾科Megophryidae
(一)齿蟾属Oreolalax
1.无蹼齿蟾Oreolalax schmidti 2017年4、6月 9
2.疣刺齿蟾Oreolalax rugosus 2017年4月 5
(二)齿突蟾属Scutiger
3.圆疣猫眼蟾Scutiger tuberculatus 2017年6月 1
(三)角蟾属Megophrys
4.沙坪角蟾Megophrys shapingensis 2017年6月 3
二蛙科Ranidae
(四)湍蛙属Amolops
5.棕点湍蛙Amolops loloensis 2017年6月 3
(五)林蛙属Rana
6.昭觉林蛙Rana chiaoensis 2017年6月 2
三树蛙科Rhacophoridae
(六)树蛙属Rhacophorus
7.宝兴树蛙Rhacophorus dugritei 2017年6月 2
四铃蟾科Bombinatoridae
(七)铃蟾属Bombina
8.大蹼铃蟾Bombina maxima 2017年6月 3
五蟾蜍科Bufonidae
(八)蟾蜍属Bufo
9.中华蟾蜍华西亚种
Bufo gargarizans andrewsi
2017年4月 2
Ⅱ有尾目Urodela
六小鲵科Hynobiidae
(九)拟小鲵属Pseudohynobius
10.普雄原鲵
Pseudohynobius puxiongensis
2017年4月 1
(十)山溪鲵属Batrachuperus
11.山溪鲵Batrachuperus pinchonii 2017年4月 3
注:物种分类系统按费梁等(2009)Frost(2017)
Note:The classification follows Fei et al., 2009 and Frost,2017
1.2 取样方法

体表擦拭、口腔擦拭、剪趾3种取样方式获取动物DNA样本。同一动物个体除剪趾取1个样本外,体表及口腔擦拭样本取1~5个。

1.2.1 体表擦拭取样

轻轻捉住动物,就地用流溪清水冲洗干净,取无菌棉签在体表(背部或腹部)擦拭至棉签湿润,然后将棉签置入EP管。

1.2.2 口腔擦拭取样

轻轻捉住动物,就地用流溪清水冲洗干净,用边角圆润的勺子轻轻打开口腔,将棉签伸入口中,擦拭至棉签湿润,然后将棉签置入EP管。

1.2.3 剪趾取样

体表擦拭和口腔擦拭取样结束后,剪取动物第二节关节处的脚趾,保存在装有95%乙醇的EP管中,取样完成后将动物就地释放。

1.3 样品的保存

棉签擦试样品(体表、口腔)置于密封袋中,EP管盖敞开,袋中放硅胶,封住密封袋,待棉签完全干燥(大约24 h)后合上EP管盖。在野外可将样品放置在常温环境下(20~25 ℃),待回到实验室将其保存在-20 ℃。剪趾样本回到实验室后更换1次95%乙醇,-20 ℃保存。

1.4 DNA的提取

每个物种随机抽取2~15个样本,分2组提取DNA,其中一组用常规高盐法提取,另一组用试剂盒提取。使用TIANGEN公司的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(TIANamp Swab DNA Kit,DP322),根据说明书操作获得DNA样品,并于-20 ℃保存。

1.5 PCR扩增

PCR扩增分别选取了16S rRNA通用引物1对、CO Ⅰ专一引物1对以及CO Ⅰ通用引物4对(表 2),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR扩增反应体系:12.5 μL Taq MIX(EasyTaqTM DNA Polymerase、dNTPs和优化的反应缓冲液反应终浓度为2×,2×EasyTaq PCR SuperMix;全式金AS111-01,北京);上、下游引物各1 μL;1 μL DNA模板;添加ddH2O至25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,53 ℃(CO Ⅰ)或者55 ℃(16S rRNA)退火40 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸5 min。

表 2 引物信息 Table 2 Primers used in PCR
基因
Gene
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
参考文献
Reference
16S rRNA P7 F:5’-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’ Simon et al., 1994
P8 R:5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’
CO Ⅰ VR1d F:5’-TAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA-3’ Ivanova et al., 2006
VF1d R:5’-TTCTCAACCAACCACAARGAYATYGG-3’
Chmf4 F:5’-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATCGG-3’ Che et al., 2012
Chmr4 R:5’-ACYTCRGGRTGRCCRAARAATCA-3’
COⅠ-CO2 F:5’-AYTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
COⅠ-CO4 R:5’-ACYTCRGGRTGACCAAAAAATCA-3’
COⅠ-CO1 F:5’-TYTCWACWAAYCAYAAAGAYATTGG-3’
COⅠ-CO3 R:5’-ACYTCYGGRTGACCAAARAAYCA-3’
COⅠ-1 F:5’-CAAATCACAAAGACATTGGCACCCT-3’ Zheng et al., 2009
COⅠ-2 R:5’-GATACGACATAGTGGAAGTGGGCTAC-3’
注:COⅠ-1/COⅠ-2为铃蟾属Bombina专一引物,其余CO Ⅰ引物为通用引物
Notes:COⅠ-1/COⅠ-2 is a specific primer of Bombina,and the rest are universal primers
1.6 序列的测定与分析

PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司成都测序部进行ABI3730XL单向测序,使用PCR检测时相对应的上游引物进行测序,将测序结果在NCBI中使用Nucleotide collection(nr/nt)数据库进行BLAST物种比对分析,以相似性程度判断相应物种DNA非损伤性取样是否成功。

2 结果 2.1 BLAST比对分析

共获得11个物种34只个体的46个剪趾、体表、口腔样本共计46条线粒体基因序列,同一个体不同来源样本的相同基因序列一致。BLAST比对结果表明,受检样本物种基因序列匹配度除疣刺齿蟾Oreolalat rugosus的1个样本为97%,其余各样本均在99%以上,部分样本达100%。每只个体上传1条基因序列到GenBank,共计上传34只个体34条基因序列(附录Ⅰ)。

2.2 DNA提取方法比较

采用不同的DNA提取方法,剪趾样本获得的DNA质量没有明显差异,均能获得目标物种的线粒体DNA序列,扩增测序成功率100%;而擦拭样本所获得的DNA质量表现出一定程度的差异,进而影响测序的成功率。

表 3 线粒体序列BLAST比对结果 Table 3 BLAST results of the mitochondrial sequence
物种
Species
样本
Sample
COⅠ/16S rRNA 体表/口腔/剪趾
Skin/mouth/toe
匹配物种
Matching species in GenBank
相似性
Identity/%
无蹼齿蟾
Oreolalax schmidti
YXS84 16S rRNA √/—/— O.schmidti 99
YXS4-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS9-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS9-3 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS72-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS72-2 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS73-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS73-2 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS74-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS74-2 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS75-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS76-1 16S rRNA √/—/— O. schmidti 99
YXS88 16S rRNA —/—/√ O. schmidti 99
疣刺齿蟾
Oreolalax rugosus
YXS41-3 16S rRNA √/—/— O. rugosus 97
YXS43-2 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS43-3 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS44-2 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS44-3 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS45-3 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS35-2 16S rRNA √/—/— O. rugosus 99
YXS35-4 16S rRNA —/—/√ O. rugosus 99
大蹼铃蟾
Bombina maxima
YXS61-2 CO Ⅰ √/—/— Bo. maxima 99
YXS67-1 CO Ⅰ √/—/— Bo. maxima 99
YXS47-4 CO Ⅰ —/—/√ Bo. maxima 99
中华蟾蜍华西亚种
Bufo gargarizans andrewsi
YXS85 CO Ⅰ √/—/— Bu. gargarizans 99
YXS90 CO Ⅰ —/—/√ Bu. gargarizans 99
圆疣猫眼蟾
Scutiger tuberculatus
YXS57-1 16S rRNA √/—/— S. tuberculatus 99
YXS57-2 16S rRNA √/—/— S. tuberculatus 99
YXS57-3 16S rRNA √/—/— S. tuberculatus 99
YXS57-4 16S rRNA √/—/— S. tuberculatus 99
YXS57-5 16S rRNA √/—/— S. tuberculatus 99
YXS57-6 16S rRNA —/—/√ S. tuberculatus 99
沙坪角蟾
Atympanophrys shapingensis
YXS11-3 16S rRNA √/—/— At. shapingensis 100
YXS71-1 16S rRNA √/—/— At. shapingensis 100
YXS77-1 16S rRNA —/√/— At. shapingensis 100
棕点湍蛙
Amolops loloensis
YXS79-1 CO Ⅰ √/—/— Am. loloensis 100
YXS83-1 CO Ⅰ √/—/— Am. loloensis 100
YXS53-4 CO Ⅰ —/—/√ Am. loloensis 100
昭觉林蛙
Rana chiaoensis
YXS60-1 CO Ⅰ √/—/— Ra. chaochiaoensis 100
YXS89 CO Ⅰ —/—/√ Ra. chaochiaoensis 100
宝兴树蛙
Rhacophorus dugritei
YXS65-1 16S rRNA √/—/— Rh. dugritei 99
YXS82-1 16S rRNA √/—/— Rh. dugritei 99
普雄原鲵
Pseudohynobius puxiongensis
YXS12-1 CO Ⅰ √/—/— P. puxiongensis 100
山溪鲵
Batrachuperus pinchonii
YXS86 CO Ⅰ √/—/— Ba. pinchonii 99
YXS87 CO Ⅰ √/—/— Ba. pinchonii 99
YXS91 CO Ⅰ —/—/√ Ba. pinchonii 99
注:YXS65-1中,YXS65为野外采集标本号,-1为该标本所取的剪趾,或体表擦拭,或口腔擦拭样本号;下同
Note:YXS65 is number of the field collected specimen,-1 is the ID of the specimen from the toe,skin,or mouth;the same below

在对所有样本使用相同引物(16S rRNA通用引物)的前提下,通过高盐法提取擦拭样本(口腔、体表)的DNA质量相对较弱,部分样本不能获得物种基因序列,共提取DNA样本27个,测序成功21个,成功率为78%。而通过试剂盒提取擦拭样本的DNA质量良好,共提取DNA样本12个,测序成功率达100%(表 4)。

表 4 不同方法提取不同物种样本的结果比较 Table 4 Comparison of extracted DNA in different sample of species by different methods
物种
Species
样本
Sample
高盐法
Salting-out
试剂盒
Tiangen kit
体表/口腔/剪趾
Skin/mouth/toe
无蹼齿蟾
Oreolalax
schmidti
YXS84 √/—/—
YXS4-1 √/—/—
YXS9-1 √/—/—
YXS9-3 √/—/—
YXS72-1 √/—/—
YXS72-2 √/—/—
YXS73-1 √/—/—
YXS73-2 √/—/—
YXS74-1 √/—/—
YXS74-2 √/—/—
YXS75-1 √/—/—
YXS76-1 √/—/—
YXS88 —/—/√
疣刺齿蟾
Oreolalax
rugosus
YXS35-1 ×/—/—
YXS35-2 ×/—/—
YXS35-3 ×/—/—
YXS42-2 ×/—/—
YXS41-3 √/—/—
YXS43-2 √/—/—
YXS43-3 √/—/—
YXS44-2 √/—/—
YXS44-3 √/—/—
YXS45-3 √/—/—
YXS57-2 √/—/—
YXS35-4 —/—/√
圆疣猫眼蟾
Scutiger
tuberculatus
YXS57-1 √/—/—
YXS57-2 √/—/—
YXS57-3 √/—/—
YXS57-4 √/—/—
YXS57-5 √/—/—
YXS57-6 —/—/√
沙坪角蟾
Atympanophrys
shapingensis
YXS11-3 √/—/—
YXS71-1 √/—/—
YXS77-1 —/√/—
YXS3-6 √/—/—
YXS3-1 √/—/—
YXS3-7 —/—/√
宝兴树蛙
Rhacophorus
dugritei
YXS65-1 √/—/—
YXS82-1 √/—/—
注Note:×/—/—测序失败的体表样本the skin sample of failing to sequence
2.3 不同引物比较

实验结果表明,剪趾样本使用4种通用CO Ⅰ引物均可扩增并成功测序。而擦拭样本在模板全部使用试剂盒提取DNA的前提下,运用6对不同线粒体基因引物进行DNA扩增,不同类群物种明显受引物特异性的局限,扩增成功率受到明显影响。CO Ⅰ通用引物VR1d/VF1d仅中华蟾蜍华西亚种Bufo gargarizans andrewsi扩增并测序成功;通用引物F/R也仅在棕点湍蛙Amolops loloensis和昭觉林蛙Rana cliaoensis 2个物种中扩增成功。4对CO Ⅰ通用引物均不能在大蹼铃蟾Bombina maxima中扩增成功,只有使用铃蟾属Bombina专一引物才成功获得该物种序列。16S rRNA通用引物虽然在角蟾科Megophryidae物种以及树蛙科Rhacophoridae物种中可以成功扩增,但却不能扩增铃蟾科Bombinatoridae物种大蹼铃蟾(表 5)。

表 5 不同引物扩增获得的测序成功率 Table 5 The sequencing success rate of PCR amplification using 6 primers
物种
Species
样本
Sample
VR1d
VF1d
F/R COI-1
COI-2
P7/P8
无蹼齿蟾
Oreolalax
schmidti
YXS72-1 × ×
YXS72-2 × ×
YXS73-1 × ×
YXS73-2 × ×
YXS74-1 × ×
YXS74-2 × ×
YXS75-1 × ×
YXS76-1 × ×
沙坪角蟾
Atympanophrys
shapingensis
YXS71-1 × ×
YXS77-1 × ×
棕点湍蛙
Amolops
loloensis
YXS79-1 ×
YXS83-1 ×
YXS78-1 × ×
昭觉林蛙
Rana chiaoensis
YXS60-1 ×
YXS60-2 × ×
YXS62-1 × ×
YXS63-1 × ×
宝兴树蛙
Rhacophorus
dugritei
YXS65-1 × ×
YXS82-1 × ×
大蹼铃蟾
Bombina
maxima
YXS61-1 × × × ×
YXS66-1 × × × ×
YXS66-2 × × × ×
YXS67-2 × × × ×
YXS68-2 × × × ×
YXS61-2 × × ×
YXS67-1 × × ×
中华蟾蜍
华西亚种
Bufo gargarizans
andrewsi
YXS85
注:引物Chmf4/Chmr4、COⅠ-CO2/COⅠ-CO4和COⅠ-CO1/COⅠ-CO3混合使用,即上游引物Chmf4、COⅠ-CO2、COⅠ-CO1混合记作F,下游引物Chmr4、COⅠ-CO4、COⅠ-CO3混合记作R;√该号样本扩增并测序成功,×未成功,—未进行该引物检测
Notes:Primers Chmf4/Chmr4,COⅠ-CO2/COⅠ-CO4 and COⅠ-CO1/COⅠ-CO3 were mixed and used in PCR,the upstream primers Chmf4,COⅠ-CO2 and COⅠ-CO1 are denoted as F,and the downstream primers Chmr4,COⅠ-CO4,COⅠ-CO3 mixture are denoted as R;√ indicates successful PCR amplification and DNA sequencing,× indicates failed PCR amplification and DNA sequencing,— indicates the detection was not carried out
3 讨论 3.1 DNA体表擦拭取样的应用

已有的两栖类体表擦拭取样的研究比较局限,只在零星的几个物种中有报道。Mendoza等(2012)从离趾蟾Eleutherodactylus johnstonei的68只个体中获取体表涂抹样本,使用DNeasy提取试剂盒、盐析、酚-氯仿抽提等方法提取DNA,并通过扩增16S rRNA的线粒体基因比较了提取DNA的质量,证明在该物种中获取上皮脱落组织是可用的。Pichlmüller等(2013)利用皮肤擦拭取样在火蝾螈Salamandra salamandra的幼体中获得DNA并完成了微卫星分型。

本研究对四川申果庄省级大熊猫保护区内的6科10属11种两栖动物随机就地体表擦拭取样,这些动物涵盖有尾及无尾两栖类多个类群的多个物种,并涉及多种生境类群。通过对PCR产物的测序分析,在所有受检物种中,研究获得的CO Ⅰ序列和16S rRNA序列与GenBank中相应物种的序列相似性均在97%以上,绝大部分样本匹配度达到99%和100%,表明擦拭获得的DNA均可以扩增获得目标物种序列。

由此说明,体表擦拭获取DNA的方法在两栖动物各类群中可以广泛应用。

3.2 DNA提取方法的影响

与剪趾样本相比,体表擦拭获得的DNA质量较差。同时,擦拭样本DNA提取难度更大,不同的DNA提取方法获得的DNA质量存在一定差异。其中,高盐法可获取数量较多的DNA,但所获DNA纯度较低,混有较多脂类、蛋白质等有机物,这些杂质可能影响PCR扩增成功率;而试剂盒提取虽然会造成DNA量的损失,但可获得纯度更高的DNA,PCR扩增成功率更高(邵劲松等,2013李霞等,2015)。

实验结果表明,在使用同一对引物P7/P8的前提下,随机抽取的5个物种以试剂盒提取的DNA扩增测序成功率为100%,高于高盐法的78%。Mendoza等(2012)的研究中,使用试剂盒和盐析法提取的DNA均成功地扩增到了16S DNA片段,其中,试剂盒提取的DNA扩增成功率(90%)比高盐法(80%)的高。

因此,针对体表擦拭样本,建议使用试剂盒提取DNA。

3.3 引物特异性的影响

与剪趾样本相比,体表擦拭获得的DNA量较少,含有较多环境细菌等非目标物种的DNA。因通用性较强的引物对非目标物种DNA也同样扩增,甚至会产生优势扩增情况,导致目标物种扩增失败,因此,体表擦拭样本在提取DNA时对引物专一性的要求有所增加。

实际上,同类非损伤性取样研究中,研究者多针对其研究类群,设计专一引物获得目标物种基因序列。Prunier等(2012)在2种两栖类物种中用非损伤性取样的DNA样本完成了14个微卫星位点的基因分型研究,对每个微卫星位点专门设计了特异性引物。针对离趾蟾完成的非损伤性取样测序检测,设计了特异性的16S rRNA引物(Mendoza et al., 2012)。Simon等(1994)在蚓螈目5个种的研究中也使用了特异性的16S rRNA和POMC引物。

体表擦拭取样获得的DNA量小且成分相对复杂,因此,建议针对各类群设计特异性强的引物进行扩增测序,以达到良好的目标物种扩增成功率。

附录Ⅰ 受检标本信息(括号中为各标本上传GenBank的COⅠ16S rRNA序列号,其中COⅠ序列用下划线标出) Appendix1 Specimens examined for COⅠ and 16S rRNA genes (GenBank accession numbers are in parentheses, and COⅠ sequences are underlined)
Oreolalax schmidtin=9
YXS84(MF805595),YXS4-1(MF805602),YXS9-1(MF805601),YXS72-1(MF805600),YXS73-1(MF805599),YXS74-1(MF805598),YXS75-1(MF805597),YXS76-1(MF805596),YXS88(MF805594)
Oreolalax rugosusn=5
YXS41-3(MF805606),YXS43-3(MF805592),YXS44-3(MF805591),YXS45-3(MF805590),YXS35(MF805593)
Scutiger tuberculatusn=1
YXS57-1(MF805589)
Atympanophrys shapingensisn=3
YXS11-3(MF805604),YXS71-1(MF805608),YXS77-1(MF805607)
Amolops loloensisn=3
YXS79-1(MF805613),YXS83-1(MF805609),YXS53(MF805612)
Rana chiaoensisn=2
YXS60(MF805615),YXS89(MF805614)
Rhacophorus dugritein=2
YXS65-1(MF805605),YXS82-1(MF805603)
Bombina maximan=3
YXS61-2(MF805621),YXS67-1(MF805620),YXS47(MF805622)
Bufo gargarizans andrewsin=2
YXS85(MF805610),YXS90(MF805611)
Pseudohynobius puxiongensisn=1
YXS12-1(MF805619)
Batrachuperus pinchoniin=3
YXS86(MF805618),YXS87(MF805617),YXS91(MF805616)
致谢: 野外数据采集得到四川省申果庄大熊猫自然保护区拉吉保护站、石门保护站和四川省林业厅野生动植物与自然保护区管理处和管理站工作人员的大力支持,谨此深表谢意!
参考文献
费梁, 胡淑琴, 叶娼媛, 等. 2009. 中国动物志两栖纲[M]. 北京: 科学出版社.
李霞, 陈新诺, 王蕾, 等. 2015. 山羊粪便总DNA提取方法的比较[J]. 四川畜牧兽医, 42(1): 38–40.
邵劲松, 浦牧野, 顾祝军. 2013. 3种土壤微生物基因组DNA提取方法的比较[J]. 南京晓庄学院学报, 29(3): 64–67.
吴军, 高逖, 徐海根, 等. 2013. 两栖动物监测方法和国外监测计划研究[J]. 生态与农村环境学报, 29(6): 784–788.
Broquet T, Berset-Braendli L, Emaresi G, et al. 2007. Buccal swabs allow efficient and reliable microsatellite genotyping in amphibians[J]. Conservation Genetics, 8(2): 509–511. DOI:10.1007/s10592-006-9180-3
Che J, Chen HM, Yang JX, et al. 2012. Universal COⅠ primers for DNA barcoding amphibians[J]. Molecular Ecology Resources, 12(2): 247–258. DOI:10.1111/men.2012.12.issue-2
Frost DR. 2017. Amphibian species of the world: an online reference version 5. 6[EB/OL]. (2013/01/09). http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html.
Guo W, Ao M, Li W, et al. 2013. Skin secretion and shedding is a good source for non-destructive genetic sampling in the Chinese giant salamander (Andrias davidianus)[J]. Zeitschrift für Naturforschung C, Journal of Biosciences, 68(3-4): 164–108.
Ivanova NV, Dewaard JR, Hebert PDN. 2006. An inexpensive, automation-friendly protocol for recovering high-quality DNA[J]. Molecular Ecology Resources, 6(4): 998–1002.
Maddock ST, Lewis CJ, Wilkinson M, et al. 2014. Non-lethal DNA sampling for caecilian amphibians[J]. The Herpetological Journal, 24(4): 255–260.
McCarthy MA, Weller WF, Parris KM. 2009. Effects of toe clipping on survival, recapture, and return rates of Jefferson salamanders (Ambystoma jeffersonianum) in Ontario, Canada[J]. Journal of Herpetology, 43(3): 394–401. DOI:10.1670/08-096R2.1
Mendoza ÁM, García-Ramirez JC, Cárdenas-Henao H. 2012. Epithelial mucosa as an alternative tissue for DNA extraction in amphibians[J]. Conservation Genetics Resources, 4(4): 1097–1099. DOI:10.1007/s12686-012-9714-6
Parris KM, McCall SC, McCarthy MA, et al. 2010. Assessing ethical trade-offs in ecological field studies[J]. Journal of Applied Ecology, 47(1): 227–234. DOI:10.1111/jpe.2010.47.issue-1
Pichlmüller F, Straub C, Helfer V. 2013. Skin swabbing of amphibian larvae yields sufficient DNA for efficient sequencing and reliable microsatellite genotyping[J]. Amphibia-Reptilia, 34(4): 517–523. DOI:10.1163/15685381-00002909
Poschadel JR, Möller D. 2004. A versatile field method for tissue sampling on small reptiles and amphibians, applied to pond turtles, newts, frogs and toads[J]. Conservation Genetics, 5(6): 865–867. DOI:10.1007/s10592-004-1974-6
Prunier J, Kaufmann B, Grolet O, et al. 2012. Skin swabbing as a new efficient DNA sampling technique in amphibians, and 14 new microsatellite markers in the alpine newt (Ichthyosaura alpestris)[J]. Molecular Ecology Resources, 12(3): 524–531. DOI:10.1111/men.2012.12.issue-3
Simon C, Frati F, Beckenbach A, et al. 1994. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J]. Annals of the Entomological Society of America, 87(6): 651–701. DOI:10.1093/aesa/87.6.651
Zheng YC, Fu JZ, Li SQ. 2009. Toward understanding the distribution of Laurasian frogs:a test of Savage's biogeographical hypothesis using the genus Bombina[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 52: 70–83. DOI:10.1016/j.ympev.2009.03.026