长江是我国第一大河流, 跨越我国大陆地势的三大阶梯, 地貌类型多样, 气候差异显著, 形成了多样的生境, 呈现出丰富的鱼类多样性及较高程度的种群分化(Cheng et al., 2015a, 2015b)。如, 基于线粒体细胞色素b(Cyt b)基因的研究表明, 长江流域的宽鳍Zacco platypus包含4个独立进化的线粒体谱系, 且谱系间存在较大的遗传分化, 可能对应4个不同物种(Perdices et al., 2004)。类似的研究结果在铜鱼Coreius heterodon、圆口铜鱼C. guichenoti、长薄鳅Leptobotia elongata和中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis中也有报道(袁希平等, 2008;田辉伍等, 2013;任泷等, 2014)。这些研究充分体现了长江流域鱼类丰富的种群遗传多样性(Zhang et al., 2015)。
斑点蛇
线粒体DNA(mtDNA)具有分子结构简单、严格的母系遗传、不同区域进化速度存在差异等特点, 已被广泛应用于系统发育及种群遗传研究(Patwardhan et al., 2014;Lakshmanan et al., 2015)。其中, Cyt b基因由于进化速度适中, 且易扩增, 已被广泛用于种群遗传多样性的研究(Chiu et al., 2015)。本文拟通过对采自长江上游赤水河江段、长江上游干流江段(包括合江江段和宜宾江段)及长江中游江段(洞庭湖、赣江及鄱阳湖)的斑点蛇
本研究所用样本于2010—2015年采集于长江流域20个样点, 共计303尾。根据地理分布, 将其分为3个地理种群。来自长江上游赤水河江段10个样点的为赤水河种群, 四川省宜宾市和合江县2个样点属于长江上游干流种群, 其余8个样点分别来自湖南洞庭湖水系、江西赣江及鄱阳湖水系, 属于长江中游种群。标本均用95%乙醇固定保存于中国科学院水生生物研究所淡水鱼类博物馆(图 1, 表 1)。
采样地编号 Sampling ID |
样点 Sampling location |
样本数量 Sample size |
所属种群 Population |
单倍型分布 Haplotype |
单倍型数 Haplotypenumber |
样本总数 Total samplesize |
单倍型总数 Total haplotypenumber |
1 | 贵州省叙永县赤水镇 | 6 | 赤水河 | Hap3, 4 | 2 | 222 | 30 |
2 | 贵州省大方县田坎乡 | 2 | Hap3, 4 | 2 | |||
3 | 贵州省仁怀市茅台镇 | 1 | Hap4 | 1 | |||
4 | 贵州省赤水市葫市镇 | 3 | Hap3 | 1 | |||
5 | 贵州省赤水市复兴镇 | 2 | Hap3, 4 | 2 | |||
6 | 贵州省赤水市大同镇 | 69 | Hap3, 4, 5, 7, 15, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 | 13 | |||
7 | 贵州省赤水市 | 115 | Hap3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 | 17 | |||
8 | 四川省合江县先市镇 | 18 | Hap3, 4, 10, 12, 15, 40, 46, 47, 48, 49 | 10 | |||
9 | 四川省合江县密溪乡 | 2 | Hap11, 16 | 2 | |||
10 | 贵州省赤水市长沙镇 | 4 | Hap3, 8, 9, 14 | 4 | |||
11 | 四川省合江县 | 49 | 长江上游干流 | Hap3, 4, 5, 8, 11, 12, 14, 15, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 | 21 | 62 | 23 |
12 | 四川省宜宾市 | 13 | Hap3, 4, 5, 6, 10, 14 | 6 | |||
13 | 湖南省岳阳市 | 1 | 长江中游 | Hap1 | 1 | 19 | 8 |
14 | 江西省武宁县 | 1 | Hap45 | 1 | |||
15 | 江西省上饶市 | 1 | Hap30 | 1 | |||
16 | 江西省新余市 | 10 | Hap1, 2, 29, 30, 31, 32 | 6 | |||
17 | 江西省都昌县 | 1 | Hap20 | 1 | |||
18 | 江西省鄱阳县 | 1 | Hap1 | 1 | |||
19 | 江西省鹰潭市 | 2 | Hap1 | 1 | |||
20 | 江西省婺源县 | 2 | Hap1, 2 | 2 | |||
合计 | 303 | 49 |
基因组DNA的提取采用高盐抽提法。基因序列片段通过PCR扩增所得。扩增所用引物为L14724和H15915。PCR反应的总体积为60 μL, 约50 ng基因组DNA为模板, 反应体系包括:10×Buffer 6 μL, dNTPs 0.75 μL(10 mmol·L-1), 引物各1.5 μL(10 μmol·L-1), Taq DNA聚合酶1.5 U, 加灭菌双蒸水至60 μL。PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性45 s, 52~58 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环;最后72 ℃延伸8 min。将获得的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。
1.2.2 数据分析为确保序列准确性, 对获得的序列, 通过DNASTAR中的Seqman手动拼接。用Clustal X 2.1进行序列比对(Larkin et al., 2007)。为避免序列中存在测序误读等错误, 采用MEGA6.0将其翻译成相应的氨基酸序列进行校正(Tamura et al., 2013)。使用PAUP* 4.0b10(Swofford, 2002)和MEGA6.0对序列进行初步分析, 包括碱基组成及核苷酸同质性检验等。
采用DnaSP 5.10.1统计种群遗传多样性参数, 并获得单倍型序列数据组。基于单倍型序列数据, 采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建分子系统发育树。使用MrMTgui、Modeltest 3.7和PAUP* 4.0b10选择最适合的碱基替代模型, 对数据的拟合度通过AIC来检测。NJ分析在PAUP* 4.0b10中进行, 系统树的分支置信度采用自引导法进行1 000次重复检测。BI分析用MrBayes 3.2.5, 以后验概率来表示各分支的可信性(Ronquist & Huelsenbeck, 2003)。ML分析用PhyML 3.0, 通过1 000次自引导法检验各分支的置信度(Guindon & Gascuel, 2003)。利用Network 4.613中的中接法构建单倍型的网络关系图, 分析单倍型之间的进化关系。
使用Arlequin 3.5进行分子方差分析(AMOVA), 计算遗传分化指数(FST)、错配分布值及Tajima's D和Fu's Fs值(Excoffier & Lischer, 2010)。使用BEAST 1.8.2进行种群动态的Bayesian skyline plot(BSP)分析(Drummond et al., 2012)。
2 结果 2.1 Cyt b基因的序列变异分析对303尾斑点蛇
采用邻接法、最大似然法和贝叶斯法构建长江流域斑点蛇
单倍型进化网络关系图(图 3)显示:整体上, 单倍型间的网络进化关系呈星状分布, 单倍型间彼此相连、相差一步或多步的突变距离。单倍型Hap3(为长江上游干流种群和赤水河种群共享)为较原始的单倍型, 位于星状网络图最中心的位置。其他单倍型均由Hap3直接演化或逐步演化而来。其中, 经过Hap3多次演化后的Hap11(为长江上游干流种群和赤水河种群共享)又演化出更多的单倍型。
2.3 不同地理种群的遗传多样性、遗传分化及分子方差分析长江流域斑点蛇
种群 Population |
具有多态性的核苷酸位点数 Number of nudeotideswith polymorphism |
单倍型多样性 Haplotypediversity |
核苷酸多样性 Nucleotidediversity |
平均核苷酸变异数 Average number ofmutant nucleotides |
Tajima's D值 Tajima's D value |
Fu's Fs值 Fu's Fs value |
长江上游干流 | 39 | 0.843 | 0.003 98 | 4.368 | -1.556* | -8.921** |
赤水河 | 41 | 0.736 | 0.002 70 | 2.958 | -1.647* | -12.612** |
长江中游 | 22 | 0.752 | 0.002 82 | 3.098 | -2.027** | -1.034 |
整体结果 | 80 | 0.803 | 0.003 71 | 4.072 | -2.017** | -25.192** |
注Notes:* P < 0.05, ** P < 0.01;下同the same below |
长江流域斑点蛇
长江上游干流 Upper YangtzeRiver main stream |
赤水河 ChishuiRiver |
长江中游 Middle YangtzeRiver |
|
长江上游干流 | |||
赤水河 | 0.029 4 | ||
长江中游 | 0.614 0** | 0.706 0** |
对长江流域斑点蛇
变异来源 Source of variation |
自由度 df |
平方和 Sum of squares |
变异组分 Variance components |
变异百分数 Percentage of variation/% |
长江流域斑点蛇鮈3个种群 | ||||
种群间 | 2 | 126.20 | 0.97 | 37.43 |
种群内 | 300 | 488.64 | 1.63 | 62.57 |
总计 | 302 | 614.84 | 2.60 | |
长江中游与(长江上游干流+赤水河)组群 | ||||
组群间 | 1 | 119.70 | 3.45 | 67.25 |
种群间 | 1 | 6.50 | 0.05 | 0.97 |
种群内 | 300 | 48.64 | 1.63 | 31.79 |
总计 | 302 | 614.84 | 5.12 |
中性检验显示(表 2), 整体上长江流域斑点蛇
由于地理隔离, 同一物种的不同地理种群可能会产生遗传分化(Brown et al., 1979)。本研究结果显示, 长江上游干流和赤水河斑点蛇
作为生物多样性的重要组成部分, 遗传多样性是经历突变及长时间自然选择后产生的结果, 也是一个物种生存适应和发展进化的前提(Tao et al., 2013)。其中, Hd和Pi是衡量种群遗传变异程度的2个重要指标(Brooks et al., 2015)。Hd和Pi较高说明种群遗传多样性高, 遗传资源丰富(Chen & He, 2002)。在长江流域斑点蛇
在种群动态分析中, Tajima's D值和Fu's Fs值是2种通过中性检验研究种群在历史上是否发生过扩张的较常用参数。Tajima's D值和Fu's Fs值接近0时, 表明种群处于稳定状态, 两者为负且P值小于0.05被认为种群在历史上有扩张迹象。此外, 对于发生过扩张的种群, 错配分布图一般呈现单峰(Ramos-Onsins & Rozas, 2002)。本研究中, 中性检验及错配分布图均表明, 整体上, 长江流域斑点蛇
陈宜瑜. 1998. 中国动物志硬骨鱼纲鲤形目(中卷)[M]. 北京: 科学出版社: 379-389. |
丁淑荃, 万全, 李飞, 等. 2013. 斑点蛇鮈精子结构研究[J]. 安徽农业大学学报, 40(6): 959–963. |
范启, 何舜平. 2014. 长江流域种群遗传多样性和遗传结构分析[J]. 水生生物学报, 38(4): 627–635. DOI:10.7541/2014.89 |
任泷, 吴金明, 李雷, 等. 2014. 赤水河中华倒刺鲃的形态分化及Cyt b基因序列比较研究[J]. 淡水渔业, 44(6): 58–64. |
田辉伍, 段辛斌, 汪登强, 等. 2013. 长江上游长薄鳅Cyt b基因的序列变异与遗传结构分析[J]. 淡水渔业, 43(6): 12–18. |
袁希平, 严莉, 徐树英, 等. 2008. 长江流域铜鱼和圆口铜鱼的遗传多样性[J]. 中国水产科学, 15(3): 377–385. |
Arundell K, Dunn A, Alexander J, et al. 2015. Enemy release and genetic founder effects in invasive killer shrimp populations of Great Britain[J]. Biological Invasions, 17(5): 1439–1451. DOI:10.1007/s10530-014-0806-y |
Brooks TM, Cuttelod A, Faith DP, et al. 2015. Why and how might genetic and phylogenetic diversity be reflected in the identification of key biodiversity areas?[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 370: 20140019. DOI:10.1098/rstb.2014.0019 |
Brown WM, George M, Wilson AC. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 176(4): 1967–1971. |
Chen YF, He DK. 2002. Biodiversity in the Yangtze River basin fauna and distribution of fishes[J]. Journal of Ichthyology, 42: 161–171. |
Cheng F, Li W, Castello L, et al. 2015a. Potential effects of dam cascade on fish: lessons from the Yangtze River[J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 3: 569–585. |
Cheng F, Li W, Klopfer M, et al. 2015b. Population genetic structure and its implication for conservation of Coreius guichenoti in the upper Yangtze River[J]. Environmental Biology of Fishes, 98(9): 1999–2007. DOI:10.1007/s10641-015-0419-z |
Chiu TH, Kuo CW, Lin HC, et al. 2015. Genetic diversity of ivory shell (Babylonia areolata) in Taiwan and identification of species using DNA-based assays[J]. Food Control, 48: 108–116. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.05.032 |
Drummond AJ, Suchard MA, Xie D, et al. 2012. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7[J]. Molecular Biology and Evolution, 29: 1969–1973. DOI:10.1093/molbev/mss075 |
Excoffier L, Lischer HEL. 2010. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources, 10: 564–567. DOI:10.1111/men.2010.10.issue-3 |
Goodall-Copestake WP, Tarling GA, Murphy EJ. 2012. On the comparison of population-level estimates of haplotype and nucleotide diversity: a case study using the gene cox1 in animals[J]. Heredity, 109: 50–56. DOI:10.1038/hdy.2012.12 |
Guindon S, Gascuel O. 2003. A simple, fast and accurate method to estimate large phylogenies by maximum-likelihood[J]. Systematic Biology, 52: 696–704. DOI:10.1080/10635150390235520 |
Lakshmanan LK, Gruber J, Halliwell B, et al. 2015. Are mutagenic non D-loop direct repeat motifs in mitochondrial DNA under a negative selection pressure?[J]. Nucleic Acids Research, 43(8): 4098–4108. DOI:10.1093/nar/gkv299 |
Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, et al. 2007. Clustal W and clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 23: 2947–2948. DOI:10.1093/bioinformatics/btm404 |
Patwardhan A, Ray S, Roy A. 2014. Molecular markers in phylogenetic studies-a review[J]. Phylogenetic and Evolutionary Biology, 2: 131. |
Perdices A, Cunhaa C, Coelhoa MM. 2004. Phylogenetic structure of Zacco platypus (Teleostei, Cyprinidae) populations on the upper and middle Chang Jiang (=Yangtze) drainage inferred from cytochrome b sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 31(1): 192-203. |
Ramos-Onsins SE, Rozas J. 2002. Statistical properties of new neutrality tests against population growth[J]. Molecular Biology and Evolution, 19(12): 2092–2100. DOI:10.1093/oxfordjournals.molbev.a004034 |
Ronquist F, Huelsenbeck JP. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models[J]. Bioinformatics, 19: 1572–1574. DOI:10.1093/bioinformatics/btg180 |
Swofford DL. 2002. PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods), version 4[M]. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates. |
Tamura KG, Stecher D, Peterson AF, et al. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 30: 2725–2729. DOI:10.1093/molbev/mst197 |
Tang QY, Li XB, Yu D, et al. 2018. Saurogobio punctatus sp. nov., a new cyprinid gudgen (Teleostei: Cypriniformes) from the Yangtze River, based on both morphological and molecular data[J]. Journal of Fish Biology, 92(2): 347–364. DOI:10.1111/jfb.2018.92.issue-2 |
Tao W, Jin XX, Xu TJ. 2013. The first complete mitochondrial genome from Bostrychus genus (Bostrychus sinensis) and partitioned Bayesian analysis of Eleotridae fish phylogeny[J]. Journal of Genetics, 92(2): 247–257. DOI:10.1007/s12041-013-0259-6 |
Thiel C, Tsukamoto S, Tokuyasud K, et al. 2015. Testing the application of quartz and feldspar luminescence dating to MIS 5 Japanese marine deposits[J]. Quaternary Geochronology, 29: 16–29. DOI:10.1016/j.quageo.2015.05.008 |
Wright S. 1978. Evolution and the genetics of populations volume 4: variability within and among natural populations[M]. Chicago: University of Chicago Press. |
Yang M, Tian C, Liang XF, et al. 2014. Genetic structure and diversity in natural and stocked populations of the mandarin fish (Siniperca chuatsi) in China[J]. Genetics and Molecular Research, 14(2): 5153–5160. |
Zhang X, Gao X, Wang JW, et al. 2015. Extinction risk and conservation priority analyses for 64 endemic fishes in the upper Yangtze River, China[J]. Environmental Biology of Fishes, 98(1): 261–272. DOI:10.1007/s10641-014-0257-4 |