四川动物  2018, Vol. 37 Issue (2): 185-190

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郭昕, 巩荣艳, 朱娟娟, 曾成娟, 沈咏梅, 岳碧松, 李静
GUO Xin, GONG Rongyan, ZHU Juanjuan, ZENG Chengjuan, SHEN Yongmei, YUE Bisong, LI Jing
美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸超高效液相色谱定量分析方法的建立
An Ultra Performance Liquid Chromatography Based Method to Quantity Determine Protocatechuic Acid in Ethanol Extract of Periplaneta americana
四川动物, 2018, 37(2): 185-190
Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(2): 185-190
10.11984/j.issn.1000-7083.20170216

文章历史

收稿日期: 2017-07-07
接受日期: 2017-09-20
美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸超高效液相色谱定量分析方法的建立
郭昕1 , 巩荣艳1 , 朱娟娟1 , 曾成娟2 , 沈咏梅2 , 岳碧松1 , 李静1*     
1. 四川大学生命科学学院, 生物资源与生态环境教育部重点实验室, 成都 610065
2. 四川省药用动物工程技术研究中心, 四川好医生攀西药业有限责任公司, 成都 610031
摘要:美洲大蠊 Periplaneta americana 是重要的药用昆虫,具有抗菌消炎、活血化瘀等多种药用价值。本实验通过外标法鉴定了美洲大蠊乙醇提取物中的原儿茶酸,并建立原儿茶酸定量测定的超高效液相色谱方法。色谱柱选用 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),缓冲盐溶液(含0.1%甲酸,25 mmol甲酸铵)为流动相A,100%乙腈为流动相B,流速0.5 mL·min-1,样品温度25℃,柱温40℃。结果显示,美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸可达到基线分离,峰型良好;原儿茶酸在10~160 μg内呈良好的线性关系(R2=0.999 9),平均回收率为98.30%~99.57%,相对标准偏差 < 1%;定量测定美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸的含量为51.38 μg·mL-1。结果显示,超高效液相色谱方法重复性好、稳定性高、分析快速,可以用于美洲大蠊乙醇提取物中原儿茶酸含量的定量测定。
关键词美洲大蠊     原儿茶酸     超高效液相色谱    
An Ultra Performance Liquid Chromatography Based Method to Quantity Determine Protocatechuic Acid in Ethanol Extract of Periplaneta americana
GUO Xin1 , GONG Rongyan1 , ZHU Juanjuan1 , ZENG Chengjuan2 , SHEN Yongmei2 , YUE Bisong1 , LI Jing1*     
1. Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China;
2. Sichuan Medicinal Animals Engineering Research Center, Sichuan Good Doctor Panxi Pharmaceutical Co. Ltd., Chengdu 610031, China
Abstract: The present study reported an ultra performance liquid chromatography (UPLC) based method to quantity determine the protocatechuic acid in the ethanol extract of Periplaneta americana. The column was washed with Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm). The salt solution (containing 0.1% formic acid, 25 mmol ammonium formate) was used as the mobile phase A, and 100% acetonitrile at a flow rate of 0.5 mL·min-1 was used as the mobile phase B. The specimen temperature was 25℃, and column temperature was 40℃. Three detection wavelengths were set at 190-450 nm, 254 nm and 360 nm, respectively. The protocatechuic acid peak at a retention time of 3.3 min with a base line separation was detected. The protocatechuic acid showed a linear relationship (R2=0.999 9) in the linear range, and the average recovery ranged from 98.30% to 99.57% with the relative standard deviation < 1%. The content of protocatechuic acid in the ethanol extract from P. americana was quantity determined to be 51.38 μg·mL-1. The establishment of UPLC method to determine the content of protocatechuic acid will facilitate the quality control of P. americana basic productions in future.
Keywords: Periplaneta americana     protocatechuic acid     ultra performance liquid chromatography    

美洲大蠊 Periplaneta americana 隶属于昆虫纲Insecta蜚蠊目Blattaria大蠊属 Periplaneta ,是重要的药用昆虫,临床上对创面的修复及愈合具有明显的促进作用,同时还具有消炎抗菌、保肝抗肿瘤、增强机体免疫力等功能(胡艳芬等,2008史未名,2012吴红梅等,2013汤雁利等,2014陈启亮等,2015张汉超等,2017)。原儿茶酸(protocatechuic acid,PCA)化学名称为3,4-二羟基苯甲酸,是一种天然的酚酸类物质。研究显示,这种广泛存在的化合物在抗癌、抗氧化、神经保护、修复缺血损伤,以及治疗阿尔兹海默病、过敏性哮喘、帕金森症、乙型肝炎等方面都发挥了重要作用。PCA具有多样的生物活性,如提高心肌耐氧能力、减慢心率、抗高血糖以及抗肿瘤,此外,还具有抗菌、抗炎、镇痛、抑制细胞凋亡、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、祛痰等功能,临床上常用于治疗慢性气管炎,同时PCA能够抑制体外的化学致癌物质,达到促凋亡和抗增殖的效果,具有潜在的化学防护及抗乙肝病毒价值(An et al ., 2006魏苗苗,2013黄非,2017张晓燕等,2017)。研究表明,美洲大蠊除了含有大量的脂肪酸、多糖、氨基酸、多元醇(杨勇勋,2013满红霞等,2014周芹芹等,2015),还含有水杨酸、PCA及核苷酸类成分。学者们已通过高效液相色谱法建立了定量分析美洲大蠊提取物中尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷含量的方法(杨勇勋,2013周苏,2013黄博等,2014蒋文贤等,2015李旸等,2015温慧敏等,2015)。但迄今为止,关于美洲大蠊中其他药理活性成分的定量分析仍缺乏相关报道。

美洲大蠊乙醇提取物是康复新液上市药品的基础成分,吕娜等(2017)通过萃取、制备型液相和波谱法发现美洲大蠊乙醇提取物含有PCA,但其在美洲大蠊乙醇提取物中的含量分析尚未见报道。

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)与传统的高效液相色谱相比,具有分离度更高、分析速度更快、检测器灵敏度更高的特点。UPLC色谱柱采用粒径小于2 μm的填料,显著增加了柱的效能。与传统的C18色谱柱相比,T3色谱柱能保证与100%水相流动相兼容,对不同极性的化合物均有良好的保留,在分析过程中适用范围更广。本文拟通过外标法在UPLC上运用T3色谱柱建立定量分析美洲大蠊乙醇提取物中PCA的方法,同时测定PCA的含量。

1 材料与方法 1.1 仪器材料

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪,配备ACQUITY Arc系统及PDA检测器;ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美国Waters公司。

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液(批号:B170205)由四川好医生攀西药业有限责任公司提供;PCA(批号:223812,J & K Chemical公司),质量分数≥98%。

1.2 样品制备

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液经13 000 r·min-1高速离心1 min,取上清液过膜后,每个样品瓶分装1.5 mL,分装6个样品瓶备用,作为供试品。

称取0.016 g PCA溶于100 mL甲醇配成浓度为160 μg·mL-1的PCA对照品溶液,再加甲醇等比例依次稀释到80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1,每个浓度保留10 mL,置于4 ℃冰箱备用。

1.3 系统适应性实验

美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液、浓度为160 μg·mL-1的PCA对照品溶液各1 mL,13 000 r·min-1高速离心1 min,取上清液过膜后备用。精确称取1 mg PCA加入到3 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中,充分溶解后离心过膜,作为加样对照组。上述样品均按照本实验建立的色谱条件进样分析。

1.4 方法学实验 1.4.1 线性关系考察

在本实验建立的色谱条件下,按照浓度由低到高的顺序对5个浓度PCA对照品溶液依次进样分析。分别记录各个浓度PCA对照品溶液的相对峰面积。然后以浓度为横坐标、相对峰面积为纵坐标绘制标准曲线,进行线性分析(姚静倩等,2009周苏,2013李宇驰等,2016)。

1.4.2 精密度实验

取1 mL 160 μg·mL-1的PCA,离心过膜后在本实验建立的色谱条件下连续进样6次,以PCA对照品溶液的峰面积计算相对标准偏差(RSD)(姚静倩等,2009周苏,2013李宇驰等,2016)。

1.4.3 稳定性实验

取1份供试品在本实验建立的色谱条件下每隔2 h进样1次,共进样6次。取6组中PCA所对应的峰面积计算RSD,评估样品的稳定性(姚静倩等,2009周苏,2013李宇驰等,2016)。

1.4.4 重复性实验

取6份供试品在本实验建立的色谱条件下每份样品进1针,不间断分析。取6组中PCA所对应的峰面积计算RSD(姚静倩等,2009周苏,2013李宇驰等,2016)。

1.4.5 加样回收实验

取3份10 mL已知含量的美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液按照1: 2、1: 1、2: 1(已知量:添加量)比例向其中分别添加1.00 mg、0.50 mg、0.30 mg PCA,每种添加浓度进行3次平行实验,实验数据取平均值;根据加样回收率=(测得量-固有含量)/加入量×100%计算(姚静倩等,2009周苏,2013李宇驰等,2016)。

2 结果 2.1 UPLC洗脱条件建立

色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm;1.8 μm),样品温度25 ℃,进样量1 μL,柱温40 ℃,流速0.5 mL·min-1,检测波长设置3个,分别是190~450 nm、254 nm、360 nm。流动相选择缓冲盐(0.1%甲酸,25 mmol甲酸铵)(流动相A)和100%乙腈(流动相B),洗脱时间为11 min(刘璇等,2013冯光维等,2016)。洗脱梯度见表 1

表 1 UPLC洗脱梯度程序 Table 1 Elution gradient program of UPLC
时间/min 流速/(mL·min-1) 流动相A:缓冲盐(0.1%甲酸,25 mmol甲酸铵)/% 流动相B:100%乙腈/%
0 0.5 99 1
1.00 0.5 99 1
2.00 0.5 90 10
6.00 0.5 60 40
7.00 0.5 20 80
8.00 0.5 20 80
8.01 0.5 99 1
11.00 0.5 99 1

实验初期,选择流动相A(0.1%乙酸)、流动相B(100%乙腈)时,出峰效果不理想,分离度差,有拖尾现象;后加入缓冲盐,改用流动相A(0.1%甲酸和25 mmol甲酸铵)后,峰型明显改善,达到了预期的分离效果。

在选择检测波长时,190~450 nm为全波长;280 nm是PCA的最大吸收波长;360 nm处的特征吸收峰可以帮助鉴定特征物质,因此,选择在190~450 nm、254 nm、360 nm下同时检测。为了满足美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中高极性成分的分析要求,选用T3色谱柱代替常用的C18色谱柱。结果显示,T3色谱柱能准确分析原液中的目标成分,适用于本实验建立的洗脱方法。

为了能够快速出峰,首先建立9 min的洗脱程序,并未出现PCA的特征峰;当优化条件至11 min,在3.3 min处洗脱出分离度较好的单峰,经外标法鉴定为PCA,且原液以及PCA对照品的目标峰分离度良好。

2.2 美洲大蠊乙醇提取物的UPLC分析

美洲大蠊乙醇提取物在3.3 min处所出峰与PCA的保留时间一致,且两者在3.3 min提取的光谱图均相同(图 1:A,B);向3 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中加入1 mg PCA对照品后,进样1 μL分析(图 1:C),与美洲大蠊乙醇提取物1号峰的出峰时间完全吻合,且峰高及峰面积明显升高,表明1号峰就是目标成分—PCA。

图 1 美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液(A)、原儿茶酸(B)和加样对照组(C)的超高效液相色谱 Fig. 1 Ultra performance liquid chromatography of ethanol extract of Periplaneta americana (A), protocatechuic acid (B) and control group (C) a. 1号峰的光谱图,b.原儿茶酸的光谱图 a. spectrum of No.1 peak, b. spectrum of protocatechuic acid
2.3 方法学实验结果

以PCA浓度为横坐标、峰面积为纵坐标,取5个系列浓度依次进样分析,绘制标准曲线。结果表明,在10~160 μg·mL-1内,PCA浓度与峰面积呈线性关系,方程为 y =7 188.6 x +5 371.7,R2=0.999 9(图 2)。

图 2 原儿茶酸标准曲线 Fig. 2 The standard curve of protocatechuic acid

精密度实验测得RSD为0.59%,稳定性实验与重复性实验的RSD分别为0.80%和0.73%,均小于1%,表明仪器的精密度、样品的稳定性以及方法的重复性良好。

加样回收实验结果表明,PCA的平均回收率为98.30%~99.57%,RSD分别为0.40%、0.64%、0.30%,3组回收率均大于98%,RSD均小于1%,符合统计学分析标准,证明样品及实验仪器稳定,本方法具有良好的回收率(表 2)。

表 2 原儿茶酸回收率实验结果 Table 2 The recovery rate of protocatechuic acid
样品量/mg 已知量:添加量 添加量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% 相对标准偏差/%
0.52 2:1 0.30 0.806 98.29 98.57 0.40
0.807 98.41
0.812 99.02
1:1 0.50 0.998 97.84 98.30 0.64
1.000 98.04
1.010 99.02
1:2 1.00 1.509 99.23 99.57 0.30
1.515 99.67
1.517 99.80
2.4 样品中PCA的定量分析

根据标准曲线,求得1 mL美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中含有51.38 μg PCA,即美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中PCA的浓度为51.38 μg·mL-1

3 讨论

周燕园(2014)基于高效液相色谱法比较了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-水溶液等流动相系统,最终确定以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相时,醋五味子配方颗粒中PCA的分离度最好。但传统的高效液相色谱法分析耗时长、消耗人力物力大。与之相比,UPLC法分析快速、稳定性和重复性高,可大大提高分析效率。刘冰等(2015)使用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱建立益智仁的UPLC指纹图谱,并标定出PCA特征峰。也有研究采用 Waters H-Class UPLC 系统以及 ACQUITY UPLC BEH C18 柱,以甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水体系建立的测定大血藤及潜阳育阴方中PCA含量的方法也相对成熟(刘晓涵,祁龙凯,2016孟龑等,2017)。本研究首次采用外标法,通过UPLC分析鉴定了美洲大蠊乙醇提取物中的PCA色谱峰,并针对美洲大蠊乙醇提取物的极性及物质组成,在分离度最高、出峰数量最多的前提下采用T3色谱柱建立了定量分析PCA含量的UPLC法。结果表明,PCA在UPLC图谱中的保留时间约3.3 min,本方法重复性好、稳定性高,在分析美洲大蠊乙醇提取物脱脂原液中的PCA时针对性强。本研究建立的PCA定量分析方法为今后定量检测美洲大蠊相关制剂中该成分提供了重要方法,也为美洲大蠊中药制剂的质量控制研究奠定了基础。

近年来,随着对美洲大蠊药用价值研究的不断深入,美洲大蠊中多种药理活性成分不断被发现和报道。PCA已被证实具有抗癌、抗氧化、保护神经、修复缺血损伤等广泛的生物活性。本研究基于UPLC法定量检测了美洲大蠊乙醇提取物中PCA的含量为51.38 μg·mL-1。在UPLC色谱图上,PCA的色谱峰峰面积比其他色谱峰高,表明该成分可能是美洲大蠊乙醇提取物中重要的活性成分之一,从而为阐明美洲大蠊中的药用活性成分提供了重要参考。

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