草地是我国重要的农牧业自然资源和重要的生态屏障，鼠害是草地开发利用过程中出现的严重生态学问题(李贺新，2011)。我国草地鼠害发生面积呈逐年扩增的趋势，鼠害造成的牧草损失超过60亿元(洪军等，2014)。鼠害的大规模发生会导致草场土壤肥力下降、水分流失、草地生产力降低、杂草滋生及草地沙漠化，严重影响草原畜牧业的发展，对农牧民的生存和发展构成威胁(张知彬，2003；苏军虎等，2013)。

有效控制鼠害是保障农、林、牧业可持续发展的关键环节。早在1959年科学家就首次提出了使用雄鼠不育的方法控制鼠害(Knipling，1959)，而后不育剂在昆虫种群数量控制中也取得巨大成功(王祖望，张知彬，1996)，鉴于传统灭鼠措施存在的不足，新的控制策略逐渐受到重视。目前，控制鼠害主要使用化学不育剂、激素类不育剂、免疫不育剂和植物源性不育剂等(陈雅娟等，2014)。化学不育剂虽然能有效地起到抗生育作用，但同时对人和环境具有毒副作用，而一些化学不育剂不仅不育作用选择性不强，对环境和非靶生物也有危害；激素类不育剂的效果较好，但因其是大分子物质，结构复杂、成本高、适口性较差，在大面积的鼠害控制上有一定的难度(张宏利等，2003)；免疫不育剂具有无致死、副作用小、不育可逆、抗生育效果好、易降解、无环境污染等特点，但其疫苗在生产技术上要求高，需要使用基因重组技术和分子生物学技术，价格昂贵，不能大面积使用(张小雪，2009)；植物源性不育剂来源于植物体，能有效降低鼠类生育能力，而植物源活性成分是自然存在的物质，不会污染环境，且害鼠不易产生抗药性，因此受到广泛关注(张宏利等，2005)。

我国学者在20世纪80年代开始将植物源性不育剂应用于鼠害控制的研究：陈鸿彬等(1990)应用醋酸棉酚控制鼠类取得了一定的短期效果；童建孙等(1991)、田健和佘振珏(1992)对卫茅科Celastraceae雷公藤多甙进行了大量的抗生育效果和机理的实验室研究；徐仁权等(2004)在对雷公藤抗生育组织学大量研究的基础上，首次提出将雷公藤多甙应用于鼠类防治，并成功研制出贝奥不育灭鼠剂。目前试验过的植物源性不育剂主要有雷公藤、棉酚、莪术醇和天花粉蛋白等(吴佩君，陈活彝，1994)。

薄荷油为唇形科Lamiaceae薄荷Mentha haplocalyx Briq.的新鲜茎和叶经水蒸气蒸馏、冷冻、部分脱脑加工提取的挥发油(刘红杰，金若敏，2006)。主要活性成分为左旋薄荷醇，含量达62%~87%。薄荷油对小鼠和家兔均有抗早孕、抗着床和抑制子宫收缩等作用(杨世杰，吕怡芳，1991)，也有研究者通过灌胃处理发现薄荷油可明显降低老龄鼠的受孕率(曹玫等，2013；易真珍等，2014)。作为一种潜在的新型植物源性不育剂，薄荷油具有产量高、来源广、价格低廉、毒副作用小等优点(陈光亮等，2000；刘红杰，金若敏，2006)。

布氏田鼠Lasiopodomys brandtii广泛分布于内蒙古呼伦贝尔草原和锡林郭勒草原(赵肯堂，凤凌飞，1981；武晓东，1990；张知彬，王祖望，1998)，为内蒙古典型草原区的主要害鼠。目前，关于薄荷油对布氏田鼠的抗生育效果研究尚未见相关报道，本研究采用不同浓度薄荷油对布氏田鼠进行抗生育作用试验进行探究，并对其不育效果、抗生育作用机理及应用前景进行分析，期望筛选出安全、无污染、对害鼠种群数量实现可持续控制作用的新型植物源性不育剂。

薄荷油，纯度100%，江西省吉安市鑫森天然植物油有限公司；羧甲基纤维素钠(AR500G)，天津市大茂化学试剂厂；4%多聚甲醛，生工生物工程(上海)股份有限公司；戊二醛，成都市科龙化工试剂公司；无水乙醇，成都金山化学试剂有限公司。

光学显微镜(BX53F，日本OLYMPUS)；扫描电子显微镜(SEM；JSM-5900LV，日本电子株式会社)。

试验用布氏田鼠捕自内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市东乌珠穆沁旗，皆为幼鼠，以鼠盒雌雄分开喂养于内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市毛登牧场中国科学院动物研究所草原动物生态研究站实验室内至性成熟，自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水，选择健康、达到性成熟的雄鼠及无怀孕迹象的雌鼠备用，正式试验前预饲养1周，观察布氏田鼠采食和饮水，如无异常进行正式试验。

参照《药效评价学》进行试验设计(刘昌孝，2006)。陈光亮等(2001)研究表明，小白鼠对薄荷油的最大耐受量可达4 000 mg·kg^-1以上，预试验测得 薄荷油对布氏田鼠的D_n(使试验动物都不死亡的最大剂量)和D_m(使试验动物全部死亡的最小剂量)。将布氏田鼠分为6组，每组6只，雌雄各半，分别为1个空白对照组和5个薄荷油处理组，薄荷油用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度，分别为2 000 mg·kg^-1、4 000 mg·kg^-1、6 000 mg·kg^-1、8 000 mg·kg^-1、10 000 mg·kg^-1，空白对照组以同体积的0.5%羧甲基纤维素钠代替。于09: 00对各组布氏田鼠分别以预先设定浓度的薄荷油进行灌胃，其后每4 h观察1次；给药后第2天起，每天上、下午各观察1次，观察各小鼠的中毒反应及死亡情况，连续7 d，自灌胃起的7 d内，观察试验用布氏田鼠的死亡情况，统计数据并分析结果。薄荷油对布氏田鼠的半数致死量(LD₅₀)及其95%可信限的测定按照改良寇氏法公式计算(石东霞等，2010)：

的95%可信限=lg^-1(X₅₀±1.96SX₅₀)；LD₅₀的平均可信限=LD₅₀±(LD₅₀高限-LD₅₀低限)/2；其中，X_m为最大浓度组浓度的对数值；I为相邻2组剂量对数值之差，或相邻2组高剂量与低剂量之比的对数；p为各组布氏田鼠的死亡率；∑p为各组布氏田鼠死亡率的总和；n为每组布氏田鼠数；SX₅₀为lgLD₅₀的标准误。

将达到性成熟的布氏田鼠雌:雄为2: 1合笼交配，次日早上进行妊娠检查(阴栓检查法)，根据检查结果确认已受孕为妊娠第1天(D1)，将妊娠鼠分为4组，每组12只，分别为3个薄荷油处理组(用0.5%羧甲基纤维素钠将薄荷油配置成预先设计的浓度，分别为750 mg·kg^-1、1 000 mg·kg^-1、1 500 mg·kg^-1)和1个空白对照组(给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠)。参照刘昌孝(2006)进行试验设计，自D1起每天09: 00分别对各组进行灌胃，剂量为0.2 mL/10 g，连续给药7 d，第10天解剖检验，统计各组胚胎数量，计算出各组胚胎平均数量，并用SPSS对各薄荷油处理组与空白对照组的胚胎着床数据进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

将试验解剖所得布氏田鼠子宫组织保存于4%多聚甲醛组织固定液带回实验室，再将其转移到冰箱中保存备用。

将保存于4%多聚甲醛的子宫组织取出，石蜡包埋，切片(厚度4 ~10 μm)，置于45 ℃恒温箱中烘干，用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇，最后入蒸馏水；将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5 min后，水冲洗干净；再用乙醇进行分色处理数秒，之后用水冲洗2 min；接着用伊红染色1 min，之后用95%的乙醇分色处理；用无水乙醇处理2次，每次约20 min；用二甲苯处理2次，每次约10 min；最后用中性树胶封片、烤干；使用Image-Pro Plus 6.0进行分析。

将保存于4%多聚甲醛的子宫组织取出，放入预冷的含有2%戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4 mm，高3 mm的小块；再拨入盛有0.1 mol·L^-1 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的青霉素小瓶中，反复漂洗并更换缓冲液，一般漂洗1 h，换液3~4次；然后吸出缓冲液，加入乙醇逐级梯度脱水(样品在30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇中分别保留15~30 min)；最后吸出乙醇，将处理后的样品进行CO₂临界点干燥1 h，之后利用SEM检视子宫内膜表面。

将保存于4%多聚甲醛的子宫组织取出，石蜡包埋，切片(厚度4~10 μm)；甲苯脱蜡10 min(2次)，分别用100%乙醇(2次)、80%乙醇(1次)、90%乙醇(1次)洗脱之后，用蒸馏水洗3次(2 min)；用3%过氧化氢避光处理15 min，蒸馏水洗3次；接下来进行抗原热修复处理：EDTA高压锅热修复5 min，自然冷却至室温；用PBS洗2次(4 min)；用正常血清封闭(1: 20)，37 ℃湿盒中温育20 min；将组织上多余血清用纸吸掉，滴加用PBS稀释的一抗ERα(1: 100)、PR(1: 100)、E-cadherin(1: 100)、BCL-2(1: 200) 与组织切片分别结合，37 ℃孵育1 h，4 ℃冰箱过夜；用PBS洗3次，每次4 min；滴加基因公司HRP标记兔和鼠混合二抗试剂盒，37 ℃孵育40 min；用PBS洗2次，每次4 min；用二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察显色，自来水冲洗终止显色；再用苏木素复染细胞核3 min，2%盐酸酒精分色15 s，自来水冲洗10 min；最后分别用80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇、100%乙醇脱水各5 min，中性树胶封片；最后使用Image-Pro Plus 6.0进行分析。

应用SPSS 20.0进行数据统计、分析与处理，各组数据以平均数±标准差表示，组间差异采用t检验。

2个高剂量组布氏田鼠灌胃染毒1 h后开始精神沉郁、行动迟缓、惊厥、逐渐瘫卧，6 h内有2只死亡，1 d之内最高剂量组的布氏田鼠全部死亡，其余剂量组的中毒表现同上，但中毒程度随剂量递减而减轻，较低剂量组刚开始出现中毒现象，到后面渐渐恢复正常。

LD₅₀=5 314 mg·kg^-1；LD₅₀的95%可信限=5 693~4 977 mg·kg^-1；LD₅₀的平均可信限=5 713 mg·kg^-1±358 mg·kg^-1；即薄荷油对布氏田鼠(雌雄兼有)的经口LD₅₀为5 314 mg·kg^-1。

与空白对照组相比，经不同浓度薄荷油处理的布氏田鼠子宫胚胎着床数呈不同程度减少(图 1:A~D)；经薄荷油处理的布氏田鼠子宫胚胎数随薄荷油浓度的增大而显著降低，且差异有高度统计学意义(P＜0.01；图 2)。

图 1 薄荷油对妊娠布氏田鼠胚胎着床数的影响 Fig. 1 The effect of peppermint oil on the number of the embryo implantation of pregnant Lasiopodomys brandtii A.空白对照组；B.经过浓度为750 mg·kg-1薄荷油处理的布氏田鼠胚胎着床数减半；C.经过浓度为1 000 mg·kg-1薄荷油处理的布氏田鼠胚胎着床数大量减少；D.经过浓度为1 500 mg·kg-1薄荷油处理的布氏田鼠无胚胎着床。 A. The embryo implantation of the control group; B. The number of embryo implantation reduced to half treated by peppermint oil of concentration750 mg·kg-1; C. The number of embryo implantation significantly reduced treated by peppermint oil of concentration 1 000 mg·kg-1; D. No embryo implantation was found treated by peppermint oil of concentration 1 500 mg·kg-1.

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图 2 不同浓度薄荷油对布氏田鼠胚胎着床平均数的影响 Fig. 2 The average number of embryo implantation under different concentrations of peppermint oil on Lasiopodomys brandtii

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空白对照组布氏田鼠的子宫内膜、肌层及外膜结构均清晰可见，子宫组织无病理学增生，而经过薄荷油处理的布氏田鼠子宫内膜腔上皮厚度明显增加，腺体增多，间质细胞明显减少，子宫腔上皮有损伤，有明显的组织病理学增生(图 3)。与空白对照组比较，经药物处理过的布氏田鼠子宫内膜表面胞饮突大量减少，部分子宫内膜表面已遭到破坏。子宫内膜容受性是指内膜对胚胎的接受能力，子宫内膜遭到损害，子宫内膜容受性也受到了相应影响(图 4)。

图 3 薄荷油对布氏田鼠子宫内膜结构的影响 Fig. 3 The uterine morphological changes of peppermint oil treated Lasiopodomys brandtii A.空白对照组布氏田鼠子宫内膜结构HE染色图(右图为方框部分放大图)；B.薄荷油处理组布氏田鼠子宫内膜结构HE染色图(右图为方框部分放大图，薄荷油浓度为1 500 mg·kg-1)；Ge.腺体细胞，Le.腔上皮细胞，S.间质细胞；比例尺=10 μm。 A. The representative image of uterus morphology by HE staining in untreated control Lasiopodomys brandtii; B. The representative image of uteri morphology by HE staining in peppermint oil treated Lasiopodomys brandtii (the concentration is 1 500 mg·kg-1); Ge. glandular epithelium, Le. uterus lumen epithelium, S. stromal cell; scale bars=10 μm.

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图 4 薄荷油对布氏田鼠子宫内膜表面的影响 Fig. 4 The adverse effect of uterus endometrial surface of Lasiopodomys brandtii treated by peppermint oil C.空白对照组布氏田鼠子宫内膜表面电镜图；D.薄荷油处理组布氏田鼠子宫内膜表面电镜图(薄荷油浓度为1 500 mg·kg-1)。 C. The representative SEM image of uterus endometrial surface in control Lasiopodomys brandtii; D. The representative SEM image of uterus endometrial surface in peppermint oil treated Lasiopodomys brandtii (the concentration is 1 500 mg·kg-1).

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子宫内的雌激素受体(ERα)主要在腔上皮、腺体细胞和基质细胞中广泛表达，相较于空白对照组，薄荷油处理组的布氏田鼠子宫内ERα的表达水平显著降低；子宫内的孕激素受体(PR)也广泛分布在腔上皮细胞、腺体细胞和间质细胞中，在腺体细胞中的表达相对较少，在子宫腔上皮细胞中的表达相较于间质细胞和腺体细胞更有优势，与空白对照组相比，薄荷油处理组的布氏田鼠子宫内PR的表达水平也呈现显著下降的趋势；基质金属蛋白酶2(MMP2) 在子宫内的腔上皮、腺体细胞和间质细胞中都广泛表达，相较于空白对照组，MMP2在经薄荷油处理过的布氏田鼠子宫内的表达水平明显下调；E-钙粘附蛋白(E-cadherin)同一时期在子宫内的表达相对较弱，且主要分布在腔上皮和腺体细胞中，间质细胞中基本不表达，相较于空白对照组，薄荷油处理组的布氏田鼠子宫内的E-cadherin表达水平明显上调(图 5，图 6)。

图 5 经1 500 mg·kg-1薄荷油处理的布氏田鼠子宫内相关蛋白表达水平 Fig. 5 Protein expression changes in pregnant Lasiopodomys brandtii uterus treated by 1 500 mg·kg-1 peppermint oil as determined by IHC assay

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图 6 1 500 mg·kg-1薄荷油对布氏田鼠子宫内相关蛋白表达水平的分析统计 Fig. 6 Densitometric quantification of protein expression changes in pregnant Lasiopodomys brandtii uterus treated by 1 500 mg·kg-1 peppermint oil ERα.雌激素受体，PR.孕激素受体，MMP2.基质金属蛋白酶2，E-cadherin. E-钙粘附蛋白；** P＜0.01。 ERα. estrogen receptor α, PR. progesterone reecptor, MMP2. matrix metallo proteinase-2, E-cadherin. E-cadherin; ** P < 0.01.

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本研究证实了薄荷油对布氏田鼠具有明显的抗生育效果，薄荷油通过影响布氏田鼠子宫胚胎着床的关键阶段，从而影响其正常妊娠。薄荷油对妊娠布氏田鼠的抗生育实验结果表明，薄荷油能够导致布氏田鼠的胚胎着床数呈明显降低的趋势，这与文献(Raja，2012；易真珍等，2014)所报道的结果类似。与此同时，HE染色结果表明，薄荷油还能导致布氏田鼠子宫内膜腔上皮的厚度明显增加，腺体数目增多，间质细胞明显减少，子宫腔上皮受损，明显的子宫组织病理学增生。子宫胚胎着床是一个复杂的程序化过程(Chen et al., 2009)，其中胚胎质量和子宫内膜容受性是影响胚胎着床的2个最重要因素，且有研究表明子宫内膜容受性对于胚胎着床成功起关键作用(Achache & Revel，2006；徐少元等，2013)，子宫内膜胞饮突被认为是子宫内膜容受性的特异形态标志(Quinn & Casper，2008)。经薄荷油处理的布氏田鼠子宫内膜表面胞饮突大量减少、子宫内膜表面部分遭到破坏，说明薄荷油影响了布氏田鼠子宫内膜上胞饮突的形成，破坏了其在子宫内膜上的正常状态。进而可以初步断定，薄荷油可通过影响布氏田鼠子宫内膜形态结构及子宫内膜容受性来影响其胚胎着床，导致其妊娠失败。

在免疫组化研究结果中，发现经薄荷油处理布氏田鼠的子宫内ERα和PR都出现明显下调，类固醇激素不但能通过影响子宫内膜厚度导致内膜组织结构发生改变，而且胞饮突的形成与发展也依赖于雌、孕激素及其下游分子的调控。而雌、孕激素通过相应的ERα、PR实现对子宫内膜的调控(Kurihara et al., 2007)，ERα和PR的明显下调严重影响了子宫内膜胞饮突的形成，而雌、孕激素通过相应的受体发挥作用，受体的异常表达也影响了类固醇激素功能的发挥，进而也就可能导致子宫内膜厚度、形态发生相关病变(Stavreus-Evers et al., 2001)，这与本研究中经药物处理的布氏田鼠子宫的HE染色结果相吻合。E-cadherin是细胞表面的糖蛋白，为细胞之间粘附连接的重要分子，在Ca²⁺存在下，可以通过细胞外区结构域之间的相互作用介导细胞间的功能性粘附，在上皮细胞间联系和器官发生、分化等起重要作用，在胚胎着床过程中具有重要的调节作用(Getsios et al., 1998；刘芸等，2001；陈永杰等，2010；朱瑾等，2010)。MMP2是基质金属蛋白酶家族重要的成员之一，是一种重要的锌钙依赖的蛋白水解酶，是参与细胞外基质降解的关键酶(王海燕，归绥琪，2003；陈丽丽，2013)。经薄荷油处理的妊娠布氏田鼠子宫内E-cadherin、MMP2的表达水平均发生显著变化，表明薄荷油能够通过影响介导布氏田鼠子宫胚胎着床过程中粘附分子、细胞因子等的表达影响其子宫胚胎着床过程。子宫胚胎着床这一过程十分复杂，雌激素和孕酮主要通过间接调节多种因子如粘附分子、细胞因子等的表达来达到对胚胎着床的调节，胚胎着床过程中相关因子的异常表达也成为胚胎着床失败的一个重要原因。

害鼠的不育控制，即采取某种方法使雄性或雌性个体绝育，阻碍胚胎着床，或使幼体的生长发育受限，从而降低害鼠的出生率来抑制种群密度和种群数量。增加死亡率的策略优化了幸存鼠的生存环境，能刺激它们繁殖，与之相比，若能使种群中全部或部分个体发生不育，而不育个体继续占有原生态位，维持原有社群压力，就能长期抑制种群的恢复和发展；同时不育个体对种群内正常个体的“竞争性繁殖干扰”使不育控制的效果明显优于灭杀法，使用不育剂抑制鼠类的繁殖力以维持鼠类种群结构和空间格局的状态为前提，能够促进生态系统良性循环(张知彬，1995)。植物源性不育剂在这方面显示出了明显的优势，降低种群数量的同时也不会对其造成毁灭性杀害，具备高效、无污染、无公害的特点(周建宏等，2013)。本研究首次就薄荷油对布氏田鼠的抗生育效果进行了探究，结果表明薄荷油能显著降低布氏田鼠子宫胚胎着床数目，从而达到控制布氏田鼠种群繁殖率及数量的效果，因此薄荷油可作为一种潜在的植物源性不育剂应用于鼠类不育控制，而薄荷油是否也对其他鼠类具有同样的效果及其在野外的效果有待进一步研究。