铲形杰氏涡虫(单肠目, 达氏科)新纪录的形态学描述及其分子系统学分析
  四川动物  2017, Vol. 36 Issue (1): 65-74

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张吕, 蔡慧, 鲍思全, 周靖, 汪安泰
ZHAGN Lü, CAI Hui, BAO Siquan, ZHOU Jing, WANG Antai
铲形杰氏涡虫(单肠目, 达氏科)新纪录的形态学描述及其分子系统学分析
Gieysztoria knipovici, A New Record of Turbellarian Species (Rhabdocoela, Dalyelliidae)
四川动物, 2017, 36(1): 65-74
Sichuan Journal of Zoology, 2017, 36(1): 65-74
10.11984/j.issn.1000-7083.20160280

文章历史

收稿日期: 2016-10-15
接受日期: 2016-11-18
铲形杰氏涡虫(单肠目, 达氏科)新纪录的形态学描述及其分子系统学分析
张吕, 蔡慧, 鲍思全, 周靖, 汪安泰*     
深圳大学生命与海洋科学学院, 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室, 广东深圳 518060
摘要: 本文对分布于广东省深圳市侨城湿地(113°58'E,22°31'N)咸淡水的一种单肠目Rhabdocoel涡虫进行了形态、发育及18S rDNA与28S rDNA分子系统学的分析与比较。结果表明,此涡虫为达氏科Dalyelliidae铲形杰氏涡虫Gieysztoria knipovici Beklemischev,1953,为中国新纪录种。该物种模式标本分布于欧洲黑海近岸。本研究详细描述了其外部形态与内部结构特征,首次发现该涡虫精巢超长,前端达咽部,后端至腹侧,呈长条形(该属涡虫2个精巢呈球形或椭圆形,位于肠后腹侧);除了骨质阴茎之外还具有可再生的骨质阴茎鞘。阴茎鞘位于骨质阴茎外侧,半包裹骨质阴茎,呈长条形骨质结构。交配后的个体常在交配囊内发现阴茎鞘1~5个。鉴于该物种特殊的形态学特征,其分类地位还有待进一步研究。
关键词被杆体纲     单肠目     铲形杰氏涡虫     形态学     分子系统发生     中国    
Gieysztoria knipovici, A New Record of Turbellarian Species (Rhabdocoela, Dalyelliidae)
ZHAGN Lü , CAI Hui , BAO Siquan , ZHOU Jing , WANG Antai *     
College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen Key Laboratory Bioresources and Ecology, Shenzhen, Guangdong Province 518060, China
Abstract: A species of the order Rhabdocoela (Dalyelliidae, Gieysztoria) was collected from a brackish-water wetland (113°58'E, 22°31'N) of the Overseas Chinese Town in Shenzhen city, Guangdong province. The morphology, individual development as well as 18S rDNA and 28S rDNA phylogenesis of the species were analyzed. The results suggested that the present species is Gieysztoria knipovici Beklemischev, 1953, belonging to the family Dalyelliidae, as a newly recorded species in China. The type specimen was collected from the coast of Black Sea with the only description of its stylet features by Beklemischev (1953). For the first time, the following features were reported in this study:1) extremely long testes were located in the ventral side of body, between the anterior vitellarium and the posterior intestine; 2) apart from the sclerotic stylet, a reproducible sclerotic structure and elongated penis sheath were found to be located in the outer edge of the stylet, covering half of the stylet; 3) 1 to 5 penis sheaths were found in bursa copulatrix of the individual after matinG. Given the special morphological characters of G. knipovici, its classification warrants further studies.
Keywords: Rhabditophora     Rhabdocoela     Gieysztoria knipovici     morphology     molecular phylogeny     China    

20世纪中期,涡虫类(turbellarians)在分类上隶属于扁形动物门Platyhelminthes涡虫纲Turbellaria。随着涡虫类系统进化研究的深入,原“涡虫纲”内各类群的分类地位出现了很大变化,2005年后停止使用“涡虫纲”名词。一些研究认为无肠类属于后口动物Deuterostomia,在进化上与棘皮类Echinodermata接近,建议设立“无肠纲”Acoelomorpha (Rhode,1986)。近些年研究发现异涡虫纲Xenoturbella与“无肠纲”属于系统进化上的姊妹群,提出设立“异无肠动物门”Xenacoelomorpha (Philippe et al., 2011Cinar,2014Perea-Atienza et al., 2015)。1985年后,扁形动物门内剩下的涡虫类被重新归类为2个纲:被杆体纲Rhabditophora和链虫纲Catenulida (Nakano,2015)。被杆体纲在淡水、咸淡水和海水中分布广泛,下属6个目,其中单肠目Rhabdocoela物种数量最多,已记录34科194属1 000余种。杰氏涡虫属Gieysztoria是记录物种最多的属,已记录96种(http://turbellaria.umaine.edu/容粗徨等,2016),隶属于达氏科Dalyelliidae (汪安泰,2004)。

中国的杰氏涡虫属已记录11种,分别是深圳杰氏涡虫G. shenzhensis(汪安泰,吴海龙,2005)、丽杰氏涡虫G. pulchra(汪安泰,邓利,2006)、大变杰氏涡虫九刺亚种G. macrovariata 9-spinosa(汪安泰,邓利,2006)、武夷山杰氏涡虫G. wuyishanensis(赖晓婷等,2013)、双斑杰氏涡虫G. bimaculatas(Lu et al., 2013)、广东杰氏涡虫G. guangdongensis(Lu et al., 2013)、石岩杰氏涡虫G. shiyanensis(Xia et al., 2014)、七星岩杰氏涡虫G. qixingyanensis(容粗徨等,2016)、大变杰氏涡虫G. macrovariata(Zhang et al., 2014)、汕头杰氏涡虫G. shantouensis(Zhang et al., 2014)、惠州杰氏涡虫G. huizhouensis(Zhang et al., 2014)。以上11种杰氏涡虫均生活在华南地区淡水环境,迄今尚无咸淡水或海栖物种的报道。

2014年10月,在广东省深圳市的滨海湿地首次开展咸淡水杰氏涡虫多样性研究,获得20只个体。通过活体、整装片、连续组织切片、骨质阴茎分离以及个体发育的形态学综合观测,结合18S rDNA系统进化分析,鉴定为杰氏涡虫属中国新纪录,即铲形杰氏涡虫G. knipovici Beklemischev,1953。本研究首次发现独特于杰氏涡虫属的数项形态学特征,并对其做了分析与讨论。

1 材料与方法 1.1 采集与培养

用200目自制水网捞取水草,于水桶内摆洗,水网过滤,网内物洗入塑料保鲜盒,室内体视显微镜下分离。分离的涡虫置于直径6 cm玻璃蒸发皿,近窗。每天喂食1次草履虫,补充失去水分。培养用水为静置的原生境水,pH6.8~7.0,室温培养,空调控温(25 ℃±1 ℃)。

1.2 个体发育观测

成熟的涡虫个体每天产下的卵移至专门的培养皿,注入原生境水,记录产卵日期与卵数,每日监测卵胚发育与孵化情况,统计每枚卵的孵化周期与孵出的幼虫数,共观察593枚卵。取刚孵出幼虫单独培养,每天补充草履虫,观察幼虫发育过程。对同个虫体的子一代、子二代老化个体的骨质阴茎进行分离与观测,重点计数每个个体骨质阴茎末端小刺的数目。

1.3 模式标本制作

清洗虫体,置于载玻片,吸出水分,5%乙醇麻醉,用盖玻片轻压虫体,Bouin氏固定液(成分)固定1 h,将虫体移至称量瓶,新鲜固定液固定12~24 h,高纯水和70%乙醇换洗,直至虫体无黄色,Mayer氏苏木精浸染2 h (40 ℃),2%HCl分色20~30 min,0.2%氨水还原10 s,常规梯度乙醇脱水,0.5%伊红复染5 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

1.4 组织切片

虫体经4%多聚甲醛溶液(4 ℃)处死,Bouin氏固定液(25 ℃)固定过夜,水洗后常规石蜡切片,使用Leica RM2235切片机分别进行定向纵切、横切及水平切,切片厚8 μm,苏木精-伊红染色,逐级乙醇脱水,二甲苯透明后,中性树胶封片。

1.5 骨质阴茎分离

虫体清洗干净,置于载玻片,吸出水分,滴加涡虫分离剂,用1号昆虫针在体视显微镜下分离骨质阴茎,加盖玻片,置于Olympus BX51微分干涉显微镜下观察,Olympus DP72数码相机拍照。

1.6 分子系统学

用于系统发育分析的标本在干净的原生境水中饥饿处理至少1 d。从饥饿处理的标本中随机挑选3个经液氮处理后用E.Z.N.A.TMMollusc DNA KIT (Omega,Norcross,GA,USA)提取DNA (标记为Gieysztoria knipovici 1~3)。在目标18S rDNA和28S rDNA基因通过PCR进行扩增的过程中,分别需要用到基于18S rDNA和28S rDNA基因序列设计的1对特异性引物(CY18SF:5'-GCGAATGGCTCATTAAATCAG-3',CY18SR:5'-CTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';28SF-LSU5:5'-TAGGTCGACCCGCTGAAYTTA-3',28SR-LSUD6-3:5'-GGAACCCTTCTCCACTTCAGTC-3')。加入Premix TaqTM(TaKaRa,大连,中国)进行PCR,得到的PCR产物连接、克隆到pMDTM19-T Vector Cloning Kit (TaKaRa,大连,中国),然后转化到制备成感受态的大肠杆菌Escherichia coliTop 10中。涂板、挑取单克隆和培养后形成的菌液由北京基因组研究所进行测序(华大基因测序,深圳,中国)。利用NCBI BLAST获得同源序列(表 1)。使用MEGA 6.0进行分子系统的进化分析,所有的序列均被修剪至最短序列。利用最大似然法(ML)和邻接法(NJ)分别使用Tamura-Nei和Kimura 2-parameter模型重建系统发育树,以推断这些物种之间的进化关系。

表 1 系统进化分析中选择的核苷酸序列 Table 1 Nucleotide sequences selected for phylogenetic analysis
物种 GenBank
序列号
(18S rRNA)
GenBank
序列号
(28S rRNA)
来源
Gieysztoria acariaia KC529470 KC529601 Van et al., 2013
G. ashokae KC529466 KC529597 Van et al., 2013
G. beltrani KC529475 KC529606 Van et al., 2013
G. complicata KC529473 KC529604 Van et al., 2013
G. cuspidata KC529458 KC529589 Van et al., 2013
G. garudae KC529467 KC529598 Van et al., 2013
G. iberica KC529461 KC529592 Van et al., 2013
G. knipovici KC529463 KC529594 Van et al., 2013
G. ornata KC529460 KC529591 Van et al., 2013
G. pavimentata KC529471 KC529602 Van et al., 2013
G. zuluensis KC529465 KC529596 Van et al., 2013
Dalyellia tatrica KC529443 KC529574 Van et al., 2013
D. viridis KC529444 KC529575 Van et al., 2013
Microdalyellia brevispina KC529450 KC529581 Van et al., 2013
M. picta KC529446 KC529577 Van et al., 2013
Halammovortex sp. KC529437 KC529567 Van et al., 2013
G. knipovici 1 KX776280 KX776283 本研究
G. knipovici 2 KX776281 KX776284 本研究
G. knipovici 3 KX776282 KX776285 本研究
1.7 数据收集与处理

整装片与切片标本在Olympus BX51微分干涉显微镜下观察,Olympus DP72数码相机拍照,DP 2-BSW测量。应用Photoshop 7.0编辑数码图片,参照数码图片绘制模式图,Excel处理数据。

1.8 缩写词

aG. 黏液腺体adhesive glands,b.脑brain,bc.交配囊bursa copulatrix,e.眼eye,ed.射精管ejaculatory duct,eG. 卵egg,en.消化道enteron,go.生殖孔gonopore,m.口mouth,o.卵巢ovary,ov.输卵管oviduct,p.咽pharynx,pe.阴茎penis,pG. 咽腺pharyngeal glands,pvG. 颗粒囊腺prostate vesicle glands,ps.阴茎鞘penis sheath,pv.颗粒囊prostate vesicle,rs.受精囊seminal receptacle,t.精巢testis,u.子宫uterus,v.卵黄腺vitellaria,vd.输精管vas deferens,vs.储精囊vesicula seminalis。

2 结果 2.1 铲形杰氏涡虫Gieysztoria knipovici Beklemischev, 1953, 中国新纪录(图 1~图 3)
图 1 铲形杰氏涡虫 FiG. 1 Gieysztoria knipovici Beklemischev, 1953 A.整体形态; B.生殖系统; C.自然状态的骨质阴茎; D.阴茎鞘; E.压片展开的骨质阴茎。 A. whole body; B. copulatory apparatus; C. penis stylet, without extension; D. penis stylet sheath; E. penis stylet, with extension.

图 2 铲形杰氏涡虫 FiG. 2 Gieysztoria knipovici Beklemischev, 1953 A.活体背面观; B~C.活体腹面观; D~E.自然形态的骨质阴茎; F.半展开的骨质阴茎; G. 完全展开的骨质阴茎; H.压片状态下的雄性生殖器官(示储精囊、颗粒囊、射精管、骨质阴茎、阴茎鞘); I.整装片中被伊红染成红色的阴茎鞘; J.单独剥离分出的阴茎鞘; K~O.个体发育(依次为产卵后第3天形态、孵化后第1天形态、孵化后第3天形态、孵化后第4天形态、孵化后第7天形态)。 A-B. whole-mounted specimen, Chinese type; C. caudal portion of the whole-mounted specimen (showing copulatory apparatus); D. longitudinal whole body section; E. longitudinal section (showing gonopore); F. longitudinal section (showing testes).

图 3 铲形杰氏涡虫整装片及切片 FiG. 3 Gieysztoria knipovici Beklemischev, 1953 A~B.整装片,中国标本; C.整装片示虫体尾部的生殖器官; D.整体纵向切片; E.局部纵向切片示生殖孔; F.纵向切片示一侧双精巢结构。 A-B. whole-mounted specimen, Chinese type; C. caudal portion of the whole-mounted specimen (showing copulatory apparatus); D. longitudinal whole body section; E. longitudinal section (showing gonopore); F. longitudinal section (showing testes).

中国标本:编号JX201409-1~JX201409-7,2014年采自广东省深圳市华侨湿地(113°58′E,22°31′N)的水生植物上。所有模式标本保存于中国科学院动物标本馆。

2.2 外部特征

成熟个体体长1 250 μm,体中部宽249 μm。头部呈半圆形,中部呈圆柱状,尾部呈圆锥形,具花簇状突起,具达氏科典型的体型特征。表皮密布纤毛,头部和尾部均具触毛。虫体背部分布有不规则的棕红色纵向细纹。眼1对,位于体前端,眼点由许多黑色素球形成,呈肾形。眼间距62 μm。脑神经节分布在眼下方。眼后有酒桶状的咽,230 μm×180 μm,占体长的1/5。咽后连接肠道,无肛门。咽与肠的交接处具有大而明显的咽腺(图 2:A~C)。

2.3 生殖系统

雌雄同体。雌性生殖器官由卵巢、输卵管、受精囊、卵黄腺、子宫、生殖腔、生殖孔和交配囊组成。卵巢1个,位于近尾部的体背侧,有1根短的输卵管,连接受精囊和子宫;受精囊是1个充满精子的椭圆形。卵黄腺2条,呈棒状,位于身体背部两侧,左右卵黄腺向后延伸,愈合为卵黄总管,通往子宫。子宫2~4个,具1~3个备用子宫和1个成熟子宫,成熟子宫常含1个椭圆形的卵。子宫的另一端与生殖腔相连。生殖孔1个,位于生殖腔的腹侧,开口于体外。交配囊1个,由肌肉环肌构成,呈管状,囊部长33 μm,宽44 μm,柄部长85 μm,宽16 μm,开口于生殖腔。

雄性生殖器官由精巢、输精管、储精囊、颗粒囊、射精管、阴茎刺和前列腺组织组成。精巢1对,位于卵黄腺腹侧,精巢前端达咽部,后端延伸至消化道后端的腹侧,呈长条形,各有1条输精管通往储精囊。输精管呈细管状。储精囊1个,呈近球形,内充满精子。储精囊后紧接颗粒囊,其外侧分布着颗粒囊腺,颗粒囊后连接射精管。射精管后连接骨质化的阴茎刺,被阴茎鞘包裹。阴茎鞘位于阴茎刺的外侧,半包裹阴茎刺,为不规则条状的骨质结构,位于消化道后端的腹侧。阴茎刺由环带和24~32根小刺组成,全长90~100 μm,呈环抱状。环带高55 μm,直径57 μm,由胶原纤维骨质后形成。每根小刺基部有“U”形的肌肉附着层,分两侧和底部2部分,附着层长度有明显差异;最外侧长10 μm,中部长26 μm。两侧的小刺排列呈羽状,底部的呈尖刀状。小刺长度有明显差异,底部的由两侧向中间依次增长,最外侧小刺长11 μm,中部小刺长21 μm (图 1图 2:D~J图 3)。

2.4 生殖与发育

涡虫从产卵到幼体孵出的时间(卵孵化期)平均为2.76 d±0.69 d (1~9 d,n=403),幼体孵出至性成熟并产下第一枚卵平均需要7.14 d±0.90 d (6~8 d,n=7),平均产卵周期18.63 d±9.50 d (10~38 d,n=7),个体平均产卵数84.71枚±28.53枚(74~134枚,n=7)。生活周期(幼体孵出至死亡)平均为29.57 d±15.78 d (16~65 d,n=7)。

涡虫单系培养观测发现,繁殖的子一代、子二代的阴茎刺小刺的数目仍有变化(小刺24~32根)。

2.5 生境与习性

本文涡虫生活于咸淡水环境,属于深圳湾填海造地预留的城市湖泊湿地,占地面积约6.85×105 m2,水温15~22 ℃,日照11~13 h,海水盐度0‰~8‰,水质较浑浊,水源来自深圳湾涨潮的海水。涡虫在自然环境中分布于水生植物根部,在实验室易于饲养和繁殖(15~25 ℃),以草履虫为食,用原生境水饲养1年,未见异常。

2.6 分子系统学分析

利用MEGA 6.0将测序所得的铲形杰氏涡虫的18S rDNA序列与11种杰氏涡虫属物种、5种达氏科涡虫,以及其他类群涡虫的18S rDNA序列(图 4图 5),其中涡虫(Halammovortexsp.,KC529437)为外群,进行基于统计学的最大似然法和基于距离的邻接法构建系统树进行系统发育关系分析(图 4图 5)。

图 4 以最大似然法构建的18S rDNA的进化树(bootstrap=1 000,Tamura-Nei模型) FiG. 4 Phylogenetic tree of 18S rDNA generated with the maximum likelihood method (bootstrap=1 000, Tamura-Nei model) 图中划线部分即为本文研究物种; 下同。 The species studied in this paper is underlined; the same below.

图 5 以邻接法构建的18S rDNA的进化树(bootstrap=1 000,Kimura 2-parameter模型) FiG. 5 Phylogenetic tree of 18S rDNA generated with the neighbor-joining method (bootstrap=1 000, Kimura 2-parameter model)

同样的,将测序所得的铲形杰氏涡虫的28S rDNA序列与上述16种涡虫的28S rDNA序列构建系统树,进行系统发育关系分析(图 6图 7)。

图 6 以最大似然法构建的28S rDNA的进化树(bootstrap=1 000,Tamura-Nei模型) FiG. 6 Phylogenetic tree of 28S rDNA generated with the Maximum Likelihood method (bootstrap=1 000, Tamura-Nei model)

图 7 以邻接法构建的28S rDNA的进化树(bootstrap=1 000,Kimura 2-parameter模型) FiG. 7 Phylogenetic tree of 28S rDNA generated with the neighbor-joining method (bootstrap=1 000, Kimura 2 parameter model)

ML法构建的进化树和NJ法构建的进化树结构一致。本研究的内群分为3支,分别为达氏涡虫属Dalyellia支系、小达氏涡虫属Microdalyellia支系和杰氏涡虫属支系。3只不同个体的铲形杰氏涡虫先汇聚成一支,可认为是同种涡虫。铲形杰氏涡虫汇入杰氏涡虫属支系中。

3 讨论

本研究首次在中国咸淡水水域中发现杰氏涡虫属物种,即铲形杰氏涡虫。杰氏涡虫属物种通常生活于淡水环境,体呈梭形,长1 mm左右,眼点2个,位于咽的前方,咽后有1个椭圆形的肠,口位于腹面。2条卵黄腺分布在体背两侧,后端在肠的后缘会合入输卵管。肠后缘背部有1个卵巢、消化道后端腹部有2个精巢,储精囊、颗粒囊和骨质阴茎依次相连。骨质阴茎基部的形状以及角质刺的数量、形状、大小是鉴别杰氏涡虫的关键特征(汪安泰,吴海龙,2005http://turbellaria.umaine.edu/孙婷等,2016)。小达氏涡虫属的涡虫具有1对精巢,位于卵黄腺前端的腹侧(容粗徨等,2016)。铲形杰氏涡虫模式标本产地位于里海的伊朗、土库曼斯坦、阿塞拜疆的海港。该物种早期归于小达氏涡虫属(Beklemischev,1953),后归于杰氏涡虫属(Luther,1955)。模式标本的骨质阴茎由1个柄部与24~32根小刺组成,小刺呈环形分布,其他形态学数据不详。本研究严格单系繁殖的子一代与子二代的骨质阴茎上的小刺数目为24~32根,证明该物种阴茎上的小刺数目有固定的变化范围。

本研究首次发现,本文标本与杰氏涡虫属具有明显不同的形态学结构:(1) 1对精巢向前延伸到卵黄腺前端的腹侧,后端延伸到消化道的后端;(2) 骨质结构除了骨质阴茎外还存在另一个可再生的骨质阴茎鞘,位于骨质阴茎的外侧,呈长条状,中央内凹,上端呈封闭半椭圆形或鹰爪状,下端呈锯齿状的半圆形,侧面呈开放竹筒状,半包裹骨质阴茎;(3) 在成虫受精囊内常有1~3个交配后遗留的骨质阴茎鞘;(4) 虫体的骨质阴茎微小,射精管长,阴茎鞘有助于受精过程,是雄性生殖器官的重要附件;(5) 阴茎鞘在交配丢失后,会重新再生一个;(6) 受精囊长度是骨质阴茎长度的2倍以上;(7) 骨质阴茎鞘长度是阴茎长度的2~4倍;(8) 在输卵管内与受精囊内均发现有骨质阴茎鞘。

上述中国标本独特的雄性生殖器官结构与交配特性,与杰氏涡虫属的特征差异显著。另一方面,本研究18S rDNA序列和28S rDNA序列与欧洲标本(Van et al., 2013)的亲缘关系显示,本文物种属于铲形杰氏涡虫,且属于杰氏涡虫属。即本文分子系统学数据不支持形态学数据,其最后的分类地位有待进一步研究。

致谢: 2013级方楚玉与赵佳琪同学,2011级陈钰辉同学协助修改本文,在此一并致谢!
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