硫化物是水产养殖中常见的水体有毒污染物之一，在养殖池塘中主要有2个来源：(1)硫酸盐在硫酸盐还原菌的作用下异化还原形成；(2)水产动物的代谢物、残饵等有机质中的含硫氨基酸被微生物分解利用而产生。硫化物对水产动物具有较强的毒性，但目前针对硫化物对虾类毒性影响的研究较少，主要集中在半致死浓度以及对酶活性影响的研究上(Cheng et al.，2007；Hsu & Chen，2007；李建等，2007；管越强等，2009，2011；於叶兵等，2011；余静等，2011；杨世平等，2014)。笔者前期应用流式细胞术分析了硫化物对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei细胞毒性的影响，结果显示硫化物胁迫刺激其血细胞产生大量活性氧(ROS)，诱导血细胞凋亡，继而导致血细胞总数(THC)下降，这可能是硫化物对虾类产生细胞毒性的重要机制之一(汪蕾等，待发表)。抗氧化酶是机体内清除过量ROS，进行抗氧化防御的重要工具。根据前期研究结果，笔者推测抗氧化酶可能在抗硫化物胁迫过程中发挥重要作用。因此，本研究针对5种重要的抗氧化酶：铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx)，分析硫化物胁迫对其在血细胞中表达水平的影响，探讨它们在抗硫化物胁迫中发挥的作用，为进一步研究如何提高虾类的抗硫化物胁迫能力提供理论基础。

凡纳滨对虾购自广东省广州市番禺区某养殖场。对虾平均体质量为8.69 g±0.75 g，在实验室环境条件下驯养，养殖用水的条件为：盐度20‰，pH7.9~8.0，温度22~24 ℃，一直保持曝气，并进行循环过滤。驯养1周后，选取健康无病患、附肢完整、处于蜕皮间期的对虾进行实验。

DNA marker、PCR试剂盒(Taq Mix)购自东盛公司；Trizol RNA提取试剂、反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)、荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq^TM)均购自大连TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)和琼脂粉均购自上海生工生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯。所有使用的器具和耗材经过RNase free处理。

以硫化钠作为硫化物来源，配制硫浓度为1 g·L^-1的硫化钠溶液，用于调节水体硫化物浓度。根据参考文献(Hsu & Chen，2007)及前期研究结果，设置硫化物胁迫浓度为2.0 mg·L^-1，硫化物浓度采用亚甲基蓝分光光度法测定，实际测定浓度为1.92 mg·L^-1±0.09 mg·L^-1，对照组为不添加组。 每组设3个平行，每个养殖桶放盐度20‰的水180 L，放养对虾20尾。为保证硫化物浓度，每6 h换水1次，换水量约为50%。分别在胁迫的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取样。

用2.5 mL一次性注射器吸取预冷的抗凝剂(葡萄糖20.5 g·L^-1、柠檬酸钠8 g·L^-1、氯化钠4.2 g·L^-1，pH7.5)，然后从对虾的围心腔抽取等量的血淋巴，3 000 r·min^-1，4 ℃离心10 min，弃上清，沉淀为血细胞，用于提取总RNA。应用Trizol RNA提取试剂提取总RNA，具体方法参考说明书。得到的RNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，取2 μL利用NanoDrop ND-100 Spectrophotometer测定RNA浓度和纯度，OD_260/280在1.9~2.0的RNA作为反转录的模板。

根据RNA浓度用DEPC水稀释，在10 μL的反转率体系中加入500 ng RNA作为反转录模板。实验使用TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，按照说明书步骤进行。

从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库查找所需基因的cDNA序列，根据查找到的序列利用Primer Premier 5进行引物的设计或者参考文献中的引物，各基因的GenBank序列号和引物序列见表 1，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时荧光定量PCR实验使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒，实验步骤按照说明书进行。所得数据以ABI 7500 SDS进行分析，以β-actin作为内参，根据目的基因和β-actin的Ct值用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。每个样品做3个重复。