四川动物  2016, Vol. 35 Issue (6): 884-888

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汪蕾, 张秀霞, 郑佩华, 鲁耀鹏, 冼健安
WANG Lei, ZHANG Xiuxia, ZHENG Peihua, LU Yaopeng, XIAN Jian'an
硫化物胁迫对凡纳滨对虾血细胞抗氧化酶基因表达的影响
Effects of Sulfide Stress on Expressions of Antioxidant Enzymes in Litopenaeus vannamei Haemocytes
四川动物, 2016, 35(6): 884-888
Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(6): 884-888
10.11984/j.issn.1000-7083.20160229

文章历史

收稿日期: 2016-08-25
接受日期: 2016-09-21
硫化物胁迫对凡纳滨对虾血细胞抗氧化酶基因表达的影响
汪蕾1, 张秀霞2, 郑佩华1, 鲁耀鹏1, 冼健安2*     
1. 华南师范大学药物研究院, 广州 510631
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101
摘要: 硫化物是水产养殖过程中常见的水体污染物之一,为探讨抗氧化酶在凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血细胞抗硫化物胁迫中的作用,以不同浓度(0 mg·L-1和2.0 mg·L-1)的硫化物对凡纳滨对虾进行胁迫,于胁迫后的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取血淋巴,测定血细胞中铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx)基因表达量的变化。结果显示,Cu,Zn-SOD和TRx的表达量在胁迫的6~24 h显著上升,在48 h时恢复至对照组水平;Mn-SOD和GPx的表达量在胁迫的6~48 h均显著上调;CAT表达水平在胁迫的12 h开始有显著提高。这些结果表明凡纳滨对虾血细胞抗氧化相关基因的表达均被诱导上调,以进行防御;Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和TRx均对硫化物胁迫敏感,在胁迫前期发挥作用,CAT主要在胁迫后期发挥作用。
关键词硫化物     凡纳滨对虾     血细胞     抗氧化酶     基因表达    
Effects of Sulfide Stress on Expressions of Antioxidant Enzymes in Litopenaeus vannamei Haemocytes
WANG Lei1, ZHANG Xiuxia2, ZHENG Peihua1, LU Yaopeng1, XIAN Jian'an2*     
1. Institute of Pharmaceutical Research, South China Normal University, Guangzhou 510631, China;
2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: Sulfide is one of the common water pollutants in aquaculture. To investigate the role of antioxidant enzymes in anti-sulfide defense of shrimp haemocytes, gene expression levels of copper, zinc-superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD), manganese-superoxide dismutase (Mn-SOD), catalase (CAT), glutathion peroxidase (GPx) and thioredoxin (TRx) were determined in haemocytes of the white shrimp (Litopenaeus vannamei) exposure to sulfide (0 mg·L-1 and 2.0 mg·L-1) for 0 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h. The results showed that expression levels of Cu, Zn-SOD and TRx significantly increased after 6~24 h exposure, and reduced to the control levels at 48 h. Mn-SOD and GPx mRNA expression levels were up-regulated after 6~48 h exposure. CAT expression level began to increase after 12 h exposure. These results indicated that the mRNA expressions of antioxidant enzymes were induced to protect the haemocytes against sulfide stress. Cu, Zn-SOD, Mn-SOD, GPx and TRx displayed high sensitivity to sulfide stress, and might play the dominant role at the initial stage of sulfide stress, whereas CAT mainly worked at the later period.
Key words: sulfide     Litopenaeus vannamei     haemocyte     antioxidant enzyme     gene expression    

硫化物是水产养殖中常见的水体有毒污染物之一,在养殖池塘中主要有2个来源:(1)硫酸盐在硫酸盐还原菌的作用下异化还原形成;(2)水产动物的代谢物、残饵等有机质中的含硫氨基酸被微生物分解利用而产生。硫化物对水产动物具有较强的毒性,但目前针对硫化物对虾类毒性影响的研究较少,主要集中在半致死浓度以及对酶活性影响的研究上(Cheng et al.,2007Hsu & Chen,2007李建等,2007管越强等,20092011於叶兵等,2011余静等,2011杨世平等,2014)。笔者前期应用流式细胞术分析了硫化物对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei细胞毒性的影响,结果显示硫化物胁迫刺激其血细胞产生大量活性氧(ROS),诱导血细胞凋亡,继而导致血细胞总数(THC)下降,这可能是硫化物对虾类产生细胞毒性的重要机制之一(汪蕾等,待发表)。抗氧化酶是机体内清除过量ROS,进行抗氧化防御的重要工具。根据前期研究结果,笔者推测抗氧化酶可能在抗硫化物胁迫过程中发挥重要作用。因此,本研究针对5种重要的抗氧化酶:铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx),分析硫化物胁迫对其在血细胞中表达水平的影响,探讨它们在抗硫化物胁迫中发挥的作用,为进一步研究如何提高虾类的抗硫化物胁迫能力提供理论基础。

1 材料和方法 1.1 材料与试剂

凡纳滨对虾购自广东省广州市番禺区某养殖场。对虾平均体质量为8.69 g±0.75 g,在实验室环境条件下驯养,养殖用水的条件为:盐度20‰,pH7.9~8.0,温度22~24 ℃,一直保持曝气,并进行循环过滤。驯养1周后,选取健康无病患、附肢完整、处于蜕皮间期的对虾进行实验。

DNA marker、PCR试剂盒(Taq Mix)购自东盛公司;Trizol RNA提取试剂、反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)、荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)均购自大连TaKaRa公司;焦炭酸二乙酯(DEPC)和琼脂粉均购自上海生工生物工程有限公司;其他试剂为国产分析纯。所有使用的器具和耗材经过RNase free处理。

1.2 硫化物胁迫

以硫化钠作为硫化物来源,配制硫浓度为1 g·L-1的硫化钠溶液,用于调节水体硫化物浓度。根据参考文献(Hsu & Chen,2007)及前期研究结果,设置硫化物胁迫浓度为2.0 mg·L-1,硫化物浓度采用亚甲基蓝分光光度法测定,实际测定浓度为1.92 mg·L-1±0.09 mg·L-1,对照组为不添加组。 每组设3个平行,每个养殖桶放盐度20‰的水180 L,放养对虾20尾。为保证硫化物浓度,每6 h换水1次,换水量约为50%。分别在胁迫的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取样。

1.3 血细胞总RNA提取

用2.5 mL一次性注射器吸取预冷的抗凝剂(葡萄糖20.5 g·L-1、柠檬酸钠8 g·L-1、氯化钠4.2 g·L-1,pH7.5),然后从对虾的围心腔抽取等量的血淋巴,3 000 r·min-1,4 ℃离心10 min,弃上清,沉淀为血细胞,用于提取总RNA。应用Trizol RNA提取试剂提取总RNA,具体方法参考说明书。得到的RNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性,取2 μL利用NanoDrop ND-100 Spectrophotometer测定RNA浓度和纯度,OD260/280在1.9~2.0的RNA作为反转录的模板。

1.4 cDNA第一链的合成

根据RNA浓度用DEPC水稀释,在10 μL的反转率体系中加入500 ng RNA作为反转录模板。实验使用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒,按照说明书步骤进行。

1.5 表达定量

从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查找所需基因的cDNA序列,根据查找到的序列利用Primer Premier 5进行引物的设计或者参考文献中的引物,各基因的GenBank序列号和引物序列见表 1,所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时荧光定量PCR实验使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,实验步骤按照说明书进行。所得数据以ABI 7500 SDS进行分析,以β-actin作为内参,根据目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。每个样品做3个重复。

表 1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR
基因GenBank序列号引物序列(5'-3')
β-actin F
β-actin R
AF300705GCCCATCTACGAGGGATA
GGTGGTCGTGAAGGTGTAG
Cu,Zn-SOD F
Cu,Zn-SOD R
HM371157TTGGCAACTCTGCTG