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文章信息
- 汪蕾, 张秀霞, 郑佩华, 鲁耀鹏, 冼健安
- WANG Lei, ZHANG Xiuxia, ZHENG Peihua, LU Yaopeng, XIAN Jian'an
- 硫化物胁迫对凡纳滨对虾血细胞抗氧化酶基因表达的影响
- Effects of Sulfide Stress on Expressions of Antioxidant Enzymes in Litopenaeus vannamei Haemocytes
- 四川动物, 2016, 35(6): 884-888
- Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(6): 884-888
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20160229
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文章历史
- 收稿日期: 2016-08-25
- 接受日期: 2016-09-21
2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101
2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
硫化物是水产养殖中常见的水体有毒污染物之一,在养殖池塘中主要有2个来源:(1)硫酸盐在硫酸盐还原菌的作用下异化还原形成;(2)水产动物的代谢物、残饵等有机质中的含硫氨基酸被微生物分解利用而产生。硫化物对水产动物具有较强的毒性,但目前针对硫化物对虾类毒性影响的研究较少,主要集中在半致死浓度以及对酶活性影响的研究上(Cheng et al.,2007;Hsu & Chen,2007;李建等,2007;管越强等,2009,2011;於叶兵等,2011;余静等,2011;杨世平等,2014)。笔者前期应用流式细胞术分析了硫化物对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei细胞毒性的影响,结果显示硫化物胁迫刺激其血细胞产生大量活性氧(ROS),诱导血细胞凋亡,继而导致血细胞总数(THC)下降,这可能是硫化物对虾类产生细胞毒性的重要机制之一(汪蕾等,待发表)。抗氧化酶是机体内清除过量ROS,进行抗氧化防御的重要工具。根据前期研究结果,笔者推测抗氧化酶可能在抗硫化物胁迫过程中发挥重要作用。因此,本研究针对5种重要的抗氧化酶:铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx),分析硫化物胁迫对其在血细胞中表达水平的影响,探讨它们在抗硫化物胁迫中发挥的作用,为进一步研究如何提高虾类的抗硫化物胁迫能力提供理论基础。
1 材料和方法 1.1 材料与试剂凡纳滨对虾购自广东省广州市番禺区某养殖场。对虾平均体质量为8.69 g±0.75 g,在实验室环境条件下驯养,养殖用水的条件为:盐度20‰,pH7.9~8.0,温度22~24 ℃,一直保持曝气,并进行循环过滤。驯养1周后,选取健康无病患、附肢完整、处于蜕皮间期的对虾进行实验。
DNA marker、PCR试剂盒(Taq Mix)购自东盛公司;Trizol RNA提取试剂、反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)、荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)均购自大连TaKaRa公司;焦炭酸二乙酯(DEPC)和琼脂粉均购自上海生工生物工程有限公司;其他试剂为国产分析纯。所有使用的器具和耗材经过RNase free处理。
1.2 硫化物胁迫以硫化钠作为硫化物来源,配制硫浓度为1 g·L-1的硫化钠溶液,用于调节水体硫化物浓度。根据参考文献(Hsu & Chen,2007)及前期研究结果,设置硫化物胁迫浓度为2.0 mg·L-1,硫化物浓度采用亚甲基蓝分光光度法测定,实际测定浓度为1.92 mg·L-1±0.09 mg·L-1,对照组为不添加组。 每组设3个平行,每个养殖桶放盐度20‰的水180 L,放养对虾20尾。为保证硫化物浓度,每6 h换水1次,换水量约为50%。分别在胁迫的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取样。
1.3 血细胞总RNA提取用2.5 mL一次性注射器吸取预冷的抗凝剂(葡萄糖20.5 g·L-1、柠檬酸钠8 g·L-1、氯化钠4.2 g·L-1,pH7.5),然后从对虾的围心腔抽取等量的血淋巴,3 000 r·min-1,4 ℃离心10 min,弃上清,沉淀为血细胞,用于提取总RNA。应用Trizol RNA提取试剂提取总RNA,具体方法参考说明书。得到的RNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性,取2 μL利用NanoDrop ND-100 Spectrophotometer测定RNA浓度和纯度,OD260/280在1.9~2.0的RNA作为反转录的模板。
1.4 cDNA第一链的合成根据RNA浓度用DEPC水稀释,在10 μL的反转率体系中加入500 ng RNA作为反转录模板。实验使用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒,按照说明书步骤进行。
1.5 表达定量从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查找所需基因的cDNA序列,根据查找到的序列利用Primer Premier 5进行引物的设计或者参考文献中的引物,各基因的GenBank序列号和引物序列见表 1,所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时荧光定量PCR实验使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,实验步骤按照说明书进行。所得数据以ABI 7500 SDS进行分析,以β-actin作为内参,根据目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。每个样品做3个重复。
基因 | GenBank序列号 | 引物序列(5'-3') |
β-actin F
β-actin R | AF300705 | GCCCATCTACGAGGGATA GGTGGTCGTGAAGGTGTAG |
Cu,Zn-SOD F
Cu,Zn-SOD R | HM371157 | TTGGCAACTCTGCTG |