慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是在现代节奏紧张的生活方式下出现的以食欲不振、体质量下降、免疫功能受损及精神症状不佳等慢性疲劳为突出表现的全身性症候群(Katafuchi et al.，2003；任秋兰，翟伟，2011)。调查显示我国城市人口发病率在10%~25%，世界卫生组织估计此病危及世界人口的20%~25%，CFS对患者的记忆力、注意力、工作、教育和个人活动带来严重的影响，现已成为2l世纪影响人类身心健康的重要因素之一，目前越来越多的人正受到CFS的困扰，而且发病人数呈逐年上升趋势(Jiang et al.，2004；吴芳鹏等，2008)。

有研究表明CFS患者的认知能力、神经系统、内分泌系统、细胞免疫功能及下丘脑-垂体-肾上腺轴功能等发生了不同程度的紊乱(李莉，卢洪洲，2009；王小峰，2012；张颖，黄希庭，2012；Tomas et al.，2013； 翟亚南等，2013； Craddock et al.，2014；Kempke et al.，2015)，同时患者的5-羟色胺转运体启动子区基因多型分布与正常健康人群相比差异显著(施璐霞，毛广平，2006)，CFS患者的很多细胞、组织器官、系统等都受到了不同程度的影响。本课题组前期实验研究发现患CFS的SD大鼠血清中雌、孕激素水平显著降低，下丘脑-垂体-性腺轴功能出现紊乱，同时其F₁代的学习记忆能力低下、学习兴趣降低，定位航行时间延长，空间搜索次数减少，患有先天性甲状腺功能减退病症(congenital hypothyroidism)(刘蕾，钱宁，2011)。

小鼠是生命科学研究和医学研究中重要的模式生物之一，目前将小鼠用于海马、记忆功能等方面的研究已经取得了显著成就。本实验拟采用复合刺激造模法复制CFS雌性KM小鼠(余曦明等，2014)，采用Morris水迷宫对CFS小鼠与正常小鼠进行记忆功能的行为学检测，对比分析二者空间学习记忆功能的差异，进一步探讨分析复合刺激构建CFS的方法对小鼠记忆功能的影响。

清洁级健康KM雌性小鼠44只，体质量20 g±2 g，由重庆腾鑫公司提供 。购入后放入动物代养室适应性饲养3 d，实验经贵阳中医学院实验动物研究所批准后进行相应的实验。

50 mL离心管和计时器等实验器材(上海乐培实验器材有限公司)；Morris水迷宫(中国科学院药物研究所生产)。

将小鼠随机分为2组：正常组(对照组，n=22)、模型组(给予复合刺激处理组，n=22)。每天对模型组小鼠实施下列3组复合刺激处理，连续5周。束缚刺激：前3天对小鼠用50 mL塑料离心管进行适应性束缚10 min，以后每天束缚的时间为30 min；力竭刺激：将小鼠放入水温为28 ℃±2 ℃，水深25 cm左右的水池中，前3天进行适应性游泳15 min，以后每天游泳30 min或直至力竭；夹尾刺激：用卵圆钳夹住小鼠尾根部1 cm处，时间为15 s左右，钳夹力度以雌鼠不适、挣扎、发出哀叫声为度。在此基础上每周随机对模型组小鼠进行低温、饥饿、饥渴及明暗颠倒刺激。正常组小鼠不给予任何刺激，实验期间严格控制小鼠的进食量(每只每天5 g)，自由饮水。

经过连续5周复合刺激处理后，随机选取模型组和正常组小鼠各10只，随后进行Morris水迷宫实验。实验的起止时间应保持一致，并保证环境因素的一致性。实验室必须保持安静，池壁上标记物和池中隐避平台的位置保持固定，实验人员将小鼠放入水池后，立即离开所站立的位置，避免小鼠将实验人员误认为是标记物。

空间记忆采集实验(acquisition trial)：实验历时6 d，每只小鼠每天训练4次，每天以半随机的方式选择入水点(表 1)，将小鼠面向池壁，轻放入水中，小鼠在60 s内找到平台，记其登上平台所需的时间，即为潜伏期；若60 s未能找到平台，记潜伏期为60 s，并引导小鼠到平台上并停留30 s，每次实验结束后，必须将小鼠擦干，并用加热器烘干其毛发，每天记录小鼠的潜伏期、游泳路程、速度和游泳轨迹等情况。

空间探索实验(probe/retention trial)：在游泳训练6 d结束后，第7天时撤除平台，分析各组小鼠在水迷宫里搜索原隐藏平台的行为，收集相应的实验数据进行分析。

所有实验重复3次，采用SPSS 12.0对各组的潜伏期、游泳路程、速度等实验结果进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，实验数据以平均数±标准差(x±s)表示，当P＜0.05时认为差异有统计学意义，P＜0.01时认为差异有高度统计学意义。

经过6 d的游泳训练，随着时间的推移，正常组与模型组小鼠的潜伏期缩短，从训练的第3天起，正常组小鼠的潜伏期极显著低于模型组(图 1：A，P＜0.01)。2组小鼠在目标象限滞留时间占总时间的百分比随实验时间的增长而增加，正常组小鼠增长的速度明显快于模型组，且从第4天起，目标象限滞留时间占总时间的百分比极显著高于模型组(图 1：B，P＜0.01)。模型组小鼠游泳前3天的总路程显著低于正常组，但是从第4天起，其总路程显著高于正常组(图 1：C，P＜0.05)，模型组平均游泳速度从第1天起显著低于正常组(图 1：D，P＜0.05)。

图 1 正常组与模型组小鼠空间记忆采集实验结果(平均数±标准差) Fig. 1 The acquisition trial results of normal mice and chronic fatigue syndrome mice(x±s) A. 潜伏期，B. 目标象限滞留时间的百分比，C. 总路程，D. 平均游泳速度; 与正常组比较，* P＜0.05，** P＜0.01; 下同。 A. time of latency，B. time percentage in target quadrant，C. path length，D. average swim speed; compared with the normal group，* P＜0.05，** P＜0.01; the same below.

图选项

Morris水迷宫第7天的空间探索实验结果显示，模型组小鼠平台穿越次数和游泳总路程极显著低于正常组(图 2：A，C，P＜0.01)。模型组小鼠的 平均游泳速 度和在目标象限滞留时间的百分比与 正常组的差异具有统计学意义(图 2：B，D，P＜0.05)。

图 2 正常组与模型组小鼠第7天空间探索实验结果(平均数±标准差) Fig. 2 The results of retention trail on the seventh day of normal mice and chronic fatigue syndrome mice(x±s) A. 平台穿越次数，B. 目标象限滞留时间的百分比，C. 总路程，D. 平均游泳速度。 A. passing times across platform，B. time percentage in target quadrant，C. path length，D.average swim speed.

图选项

通过软件对2组小鼠7 d游泳实验搜索策略进行 分析，结果显示正常组小鼠主要是采用在游泳池内直接向平台游去，或是最多用1圈的路程便游向目标象限的模式进行寻找隐藏平台，以空间搜索策略为主(图 3：A)；模型组小鼠主要采用在游泳水池的四周环绕游泳的模式进行寻找隐藏平台，以重复环 绕搜索策略为主(图 3：B)；对2组小鼠的搜索策略 进行统计分析，结果显示第7天，2组小鼠空间搜索策略百分比之间的差异有高度统计学意义(P＜0.01)，重复环绕搜索策略百分比之间的差异有统计学意义(图 4，P＜0.05)。2组小鼠典型搜索轨迹分别见图 3：C，D。

图 3 正常组与模型组小鼠实验期间搜索策略分布 Fig. 3 Searching strategies of normal mice and chronic fatigue syndrome mice A. 正常组小鼠搜索策略，B. 模型组小鼠搜素策略，C. 正常组小鼠典型游泳轨迹，D. 模型组小鼠典型游泳轨迹。 A. searching strategies employed by normal mice，B. searching strategies employed by chronic fatigue syndrome mice，C. typical swim-tracking path employed by normal mice，D. typical swim-tracking path employed by chronic fatigue syndrome mice.

图选项

图 4 正常组与模型组小鼠第7天搜索策略百分比(平均数±标准差) Fig. 4 Searching strategies on the seventh day of normal mice and chronic fatigue syndrome mice(x±s)

图选项

目前CFS已成为21世纪影响人类身心健康的新杀手，发病率逐年上升，越来越多的人患有CFS(姜淑云等，2004)。CFS患者体力、脑力活动长期过度紧张，导致各系统调节失常，严重威胁人类身心健康，使生活质量明显下降，青少年患者以工作记忆功能受损为最突出表现(Sulheim et al.，2015)。研究发现CFS患者神经解剖学发生了改变，对内源性疼痛的认知功能受损(Ickmans et al.，2015；van Der Schaaf et al.，2015)，患者的脑内侧前额叶皮层、岛叶、躯体感觉皮质、前扣带回皮层之间的脑区功能连接出现了异常(孟凡星等，2014；Boissoneault et al.，2016)，左顶叶小叶额上回连接区域变大(Hampson et al.，2015)。本实验通过采用经典的复合刺激造模法复制CFS雌性KM小鼠，Morris水迷宫检测CFS小鼠与正常小鼠学习记忆功能的变化，意在对比分析二者空间学习记忆功能存在的差异性。

Morris水迷宫空间记忆采集实验结果显示经过6 d的游泳训练，随着时间的推移，正常组与模型组雌性小鼠寻找平台的潜伏期逐渐缩短，但正常组小鼠潜伏期缩短的速度更快，从训练第3天起正常组的潜伏期极显著低于模型组(P＜0.01)。2组小鼠在目标象限滞留时间占总时间的百分比随着实验时间的增加而增长，正常组小鼠增长的速度明显快于模型组，且从第4天起目标象限滞留时间占总时间的百分比极显著高于模型组(P＜0.01)。模型组小鼠游泳的总路程和平均游泳速度均显著低于正常组(P＜0.05)，由此可见CFS雌性小鼠的空间记忆能力受到了影响；随后于游泳训练后的第7天撤除隐藏平台，检测分析2组小鼠在搜索原隐藏平台的行为变化，结果显示模型组小鼠平台穿越次数、游泳总路程、平均游泳速度及目标象限滞留时间的百分比均显著低于正常组(P＜0.05)；最后对小鼠Morris水迷宫期间进行游泳实验搜索策略分析，结果发现正常组雌性小鼠以空间搜索策略为主寻找隐藏平台，CFS雌性小鼠以重复环绕搜索策略为主寻找隐藏平台。

综上实验结果可见，复合刺激构建CFS模型的方法不仅对小鼠的生长发育、下丘脑-垂体-性腺轴等产生影响，对其学习记忆功能也产生了严重影响，CFS雌性小鼠的空间学习和记忆功能降低。CFS小鼠的大脑功能、海马结构是否发生变化，CFS小鼠F₁代出现学习记忆能力低下与其母鼠孕前患有CFS之间是否存在必然的联系，这种内在的联系具体机制如何，有待在今后科研工作中进一步研究和探讨。