四川动物  2016, Vol. 35 Issue (5): 697-702

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张贝贝, 王颖, 张冀, 张富春
ZHANG Beibei, WANG Ying, ZHANG Ji, ZHANG Fuchun
犬卵透明带3蛋白原核表达和抗血清的制备
The Prokaryotic Expression of Canine Zona Pellucida 3 Protein and Preparation of its Antiserum
四川动物, 2016, 35(5): 697-702
Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(5): 697-702
10.11984/j.issn.1000-7083.20160145

文章历史

收稿日期: 2016-05-31
接受日期: 2016-08-19
犬卵透明带3蛋白原核表达和抗血清的制备
张贝贝, 王颖, 张冀, 张富春*     
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 830046
摘要: 在研发控制流浪犬卵透明带3(CZP3)免疫不育疫苗的过程中,需要制备特异性的CZP3抗血清进行免疫检测。本研究克隆获得CZP3的cDNA(全长1 281 bp)和除去跨膜区和信号肽的核心片段(CZP3C,984 bp),通过构建原核表达载体pET28a-CZP3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)。在28℃下以0.6 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导表达4 h,获得CZP3C融合蛋白。利用CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备特异性的抗血清,并对抗血清的特异性和效价进行评价。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白以包涵体形式存在。经过镍柱亲和纯化及8 mmol·L-1尿素复性后,获得了高纯度的CZP3C融合蛋白。用0.8 μg/μL-1的CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,免疫后的兔抗血清用Western blot及间接免疫荧光实验检测,结果证明CZP3C兔抗血清具有较高的特异性,ELISA检测效价为1:409 600。本研究所制备的抗血清能够为流浪犬免疫不育疫苗的研制提供检测材料。
关键词     卵透明带3     原核表达     融合蛋白     抗血清    
The Prokaryotic Expression of Canine Zona Pellucida 3 Protein and Preparation of its Antiserum
ZHANG Beibei, WANG Ying, ZHANG Ji, ZHANG Fuchun*     
College of Life Sciences and Technology, Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046, China
Abstract: To develop the canine zona pellucida 3 (CZP3) contraceptive vaccine that could be used to control the birth rate of stray dogs, antiserum is required to carry out immune detection. In this study, the full length cDNA of CZP3 (1 281 bp) and the core fragment of CZP3 (CZP3C, 984 bp) without the transmembrane domain and the signal peptide were cloned, respectively. CZP3C was ligated to pET28a vector to generate the recombinant plasmid pET28a-CZP3C, and then the plasmid was transferred into Escherichia coli BL21(DE3). The expression of CZP3C fusion protein was induced with 0.6 mmol·L-1 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at 28℃ for 4 h. The specific antiserum of CZP3C fusion protein was obtained from the rabbit after immunization, and the specificity and titer of the prepared antiserum were evaluated. The results of SDS-PAGE showed that CZP3C mainly existed in the form of inclusion bodies. High purity of the fusion protein was obtained after nickel column affinity purification and 8 mmol·L-1 urea renaturation. Two Newzealand rabbits were immunized with CZP3C of 0.8 μg·μ L-1, respectively, the generated polyclonal antiserum was detected with Western blot and indirect immunofluorescence. The results showed that the anti-CZP3C rabbit serum had high specificity, and the titer was 1:409 600 as determined by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The prepared antiserum can provide testing materials for the development of stray dog contraceptive vaccines.
Key words: dog     zona pellucida 3     prokaryotic expression     fusion protein     antiserum    

目前,城市流浪狗数量激增已成为一个全球性的问题(öÖzen et al., 2016Rinzin et al., 2016),随之而来的扰民伤人、制造交通事故、污染环境和传播疾病等问题,极大地激起了与人类的矛盾并亟待解决(Hou et al., 2012Cima,2013Ortiz-Prado et al., 2015)。现已知约100多种人畜共患病是由狗和猫所携带并传播的(Karesh et al., 2012Zangenah et al., 2016)。因此,有效控制流浪动物的数量成为了一个迫切的社会问题(Totton et al., 2010;öÖzen et al., 2016Rinzin et al., 2016)。

哺乳动物从受精到新个体产生是一个精密且复杂的过程,为使卵细胞受精,精子必须结合并穿透卵透明带(zona pellucida)和卵细胞膜融合(Egge et al., 2015)。卵透明带是围绕在哺乳动物卵细胞和早期胚胎表面的一层细胞膜外结构,通常情况下由3~4种糖蛋白组成(包括ZP1、ZP2、ZP3和ZP4)(Stetson et al., 2014),ZP3是卵透明带的重要组成部分,作为精子的初级受体,在受精过程中发挥重要的作用。精子只有和ZP3相互作用后,才能穿过卵透明带与卵细胞膜融合,形成受精卵(Miwa,2015),并引起卵透明带三维结构发生变化,阻止其他精子进入,避免多精子受精现象的出现(Shresthaa et al., 2015)。核酸疫苗和蛋白类疫苗通过激发机体产生抗ZP3抗体,同卵细胞表面的ZP3结合,占据精子的结合位点,使精子无法识别和结合卵透明带,最终导致受精失败(Wassarman & Litscher,2010),因此,ZP3被认为是不孕疫苗的理想靶抗原。以卵透明带为基础的不孕疫苗已经在控制美国的野马Equus caballus(Turner & Kirkpatrick,2002)和白尾鹿Odocoileus virginianus(Miller et al., 2000)的种群数量上产生了明显效果,且未对免疫动物的健康产生较大的影响。澳大利亚和新西兰也已经广泛展开以卵透明带为潜在疫苗控制灰袋鼠Macropus giganteus和刷尾负鼠Trichosurus vulpecula种群的研究工作(Curtis et al., 2007Kitchener et al., 2009)。因此,以卵透明带为基础的不孕疫苗很可能为缓解人类与野生动物生存环境的冲突,控制野生动物的种群数量,并防止人畜共患病等诸多问题提供一个很好的解决思路(Han et al., 2010)。

本研究通过原核表达系统表达犬卵透明带3核心片段(core fragment of canine zona pellucida 3,CZP3C)融合蛋白,在纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并在体外情况下初步验证了抗血清与小鼠卵细胞表面精子抗原表位结合的能力,为犬不育疫苗的深入研究奠定了理论基础,也为进一步研究有效的CZP3疫苗提供检测材料。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

体质量为2 kg的雌性新西兰大白兔和8周龄雌性KM小鼠均购自新疆医科大学动物中心。[实验动物生产许可证号:SCXK(新)2011-0003,实验动物使用许可证号:SYXK(新)2011-0001]。

1.1.2 仪器和试剂

Trizol试剂为Invitrogen公司产品,RT-PCR试剂盒、EcoR I、Xho I和Solution I快速连接酶均为TaKaRa公司产品,质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒为OMEGA公司产品,弗氏完全佐剂和不完全佐剂为Sigma公司产品,HRP标记的羊抗兔IgG和FITC标记的抗小鼠IgG二抗为北京全式金生物技术有限公司产品,蛋白marker和BCA蛋白定量试剂盒为Thermo Fisher公司产品,注射用孕马血清促性腺激素(pregnant mare's serum gonadotropin,PMSG)和注射用人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)为浙江宁波市三生药业有限公司产品,BMOC培养基为Gibco公司产品,链霉素和青霉素为上海复申生物科技有限公司产品,透明质酸酶为上海源叶生物科技有限公司产品,感受态细胞Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)为北京全式金生物技术有限公司产品,超声破碎仪为宁波新之生物科技有限公司生产。原核表达载体pET28a及pMD18-T由本实验室保存。

1.2 方法 1.2.1 CZP3C基因的克隆及重组表达载体的构建

取新鲜的比格犬卵巢组织,以Trizol法提取总RNA并反转录cDNA,以cDNA为模板,再以上游引物(P1)5'-CGGAATTCCAGACCATTTGGCCGACCGAAAC-3'和下游引物(P2)5'-CCGCTCGAGATTGCGGGTATGTGACACGCTA-3'进行PCR扩增,PCR反应程序为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,31个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。获得除去跨膜区和信号肽的984 bp核心片段,与pMD18-T连接后通过蓝白斑筛确定正确连接的重组克隆载体后进行酶切、测序及胶回收,将pET28a和回收产物同时用EcoRⅠ和XhoⅠ 37 ℃过夜双酶切,用PCR产物回收试剂盒回收,用Solution Ⅰ快速连接酶连接4 h,将重组质粒转化至DH5α,经鉴定正确之后,转入表达菌株BL21(DE3)中后再次提取质粒双酶切鉴定。

1.2.2 CZP3C融合蛋白诱导表达的优化

将-80 ℃保存的阳性菌落按1/100接入5 mL含1/1 000卡那霉素的LB培养液中,第二次活化后,同样再按1/100接入36管含5 mL 1/1 000卡那霉素的LB培养液中,于37 ℃,220 r·min-1条件下培养4 h至OD600为0.6~0.8后,取诱导前LB培养液1 mL作对照,分别进行3个温度:20 ℃、28 ℃和37 ℃;6个IPTG浓度:0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1进行表达条件优化,220 r·min-1诱导4 h后,收集菌体,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤沉淀3次后,用500 μL PBS悬浮菌体沉淀,超声破碎收集上清,沉淀用500 μL PBS悬浮,SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达情况,筛选出最佳的蛋白表达条件。

1.2.3 CZP3C融合蛋白包涵体的纯化

将4 ℃保存活化后的菌株按1/100接入1 L含1/1 000卡那霉素的LB培养液中,于37 ℃,220 r·min-1条件下振荡培养4 h至OD600为0.6~0.8,离心收集菌体沉淀,用20 mL PBS悬浮后,超声破碎,弃上清,收集沉淀,用含8 M尿素的结合缓冲液充分溶解包涵体沉淀,离心后上清用0.45 mm滤器过滤上镍柱结合2 h后,用40 mmol·L-1、100 mmol·L-1、200 mmol·L-1、 300 mmol·L-1和500 mmol·L-1的咪唑洗涤柱子各3次,收集包括穿流在内的所有洗涤液,SDS-PAGE检测各组分内蛋白成分,确定目的蛋白的洗脱条件后,将洗脱液装入选取合适孔径的透析袋内,分别用8 mol·L-1、6 mol·L-1、4 mol·L-1和2 mol·L-1浓度尿素逐步梯度降低的方法进行尿素梯度透析除盐和复性各12 h,48 h后将透析袋内的蛋白进行定量,置于-80 ℃保存。

1.2.4 CZP3C融合蛋白Western blot特异性分析

将抗原蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后,然后电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉4 ℃封闭2 h,TBS-T漂洗3遍,每次10 min,然后将PVDF膜转入含抗His标签抗体(1: 2 000)3%脱脂奶粉的一抗中,低速摇床上结合2 h,TBS-T洗膜3次,每次10 min,接着与HRP标记羊抗兔二抗在低速摇床上结合1 h,TBS-T洗膜3次,每次10 min,最后用DAB显色至目的条带清晰。

1.2.5 抗血清的制备

将弗氏完全佐剂500 μL与抗原蛋白500 μL(蛋白浓度为800 μg·mL-1)共1 mL,1: 1完全乳化后,采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等淋巴结富集处皮内或皮下多点注射免疫新西兰大白兔,注射抗原蛋白量为每只兔子400 μg。2周后,第一次加强免疫,抗原蛋白含量减半为每只兔子200 μg,总注射量不变,4周后,第二次加强免疫,方法同上。整个过程共免疫3次,每次免疫前从耳缘静脉采血,收集血清并于-20 ℃保存。第二次加强免疫后第10天,耳缘静脉采血检测抗体水平,当抗体水平符合阳性血清的要求时,于第14天采用耳缘动脉和颈动脉法放血,收集血清,检测抗血清效价后置于-80 ℃保存。

1.2.6 抗血清效价检测

将纯化的蛋白作为抗原过夜包被酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)板,将分离的抗血清按照1: 100、1: 200、1: 400、1: 800、1: 1 600和1: 3 200等比例稀释后作为一抗,羊抗兔IgG(1: 3 000)作为二抗,最后用TMB显色15~30 min,ELISA终止液终止反应后用酶标仪在OD450下检测其光密度(optical density,OD)值,免疫前血清作为阴性对照。

1.2.7 抗血清特异性检测

将抗原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后直接电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉4 ℃封闭2 h,TBS-T漂洗3遍,每次10 min,然后将PVDF膜转入含CZP3C抗血清的(1: 500)3%脱脂奶粉的一抗中,低速摇床上结合2 h,TBS-T洗膜3次,每次10 min,之后与HRP标记羊抗兔二抗在低速摇床上结合1 h,TBS-T洗膜3次,每次10 min,最后用DAB显色至目的条带清晰。

将10只KM小鼠随机分为2组,每组5只。每只小鼠腹腔注射15 U PMSG,48 h后再次腹腔注射15 U HCG,14 h后用针头挑破壶腹部,收集卵细胞团,1%的透明质酸酶处理10 min,用加热拉伸过的巴斯德管将分散开的单独卵细胞转移至新的BMOC培养基中,接着用PBS冲洗3遍,转移至用多聚赖氨酸处理过的防脱片上,用无水乙醇进行固定,之后用5%BSA 37 ℃CO2培养箱中封闭1 h,PBS冲洗3遍后转入含有抗血清(1: 50,对照为免疫前血清)的3%BSA中,37 ℃,CO2培养箱中封闭2 h,PBS冲洗3遍,转入含有FITC标记的抗小鼠IgG二抗(1: 50)的2%BSA中37 ℃,CO2培养箱中孵育1 h,PBS冲洗5遍,甘油封片后在荧光显微镜下观察。

2 结果 2.1 CZP3C基因的克隆

以P1和P2为引物,以反转录获得的cDNA为模板,经逆转录PCR扩增出约984 bp大小的特异性基因片段,大小与预计结果相符(图 1)。

图 1 逆转录PCR扩增CZP3C基因的琼脂糖凝胶电泳分析 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of CZP3C gene by reverse transcription PCR amplification 1. CZP3C基因,2. DL5000 DNA marker,3.阴性对照。 1. CZP3C gene, 2. DL5000 DNA marker, 3. Negative control.
2.2 重组表达质粒pET28a-CZP3C的构建

重组表达载体pET28a-CZP 3 C经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,出现2条条带,1条为载体,1条为984 bp的目的片段(图 2),测序结果与GenBank中的已知序列一致。

图 2 重组表达质粒pET28a-CZP3C的双酶切分析 Fig. 2 Analysis of recombinant expression plasmid pET28a-CZP3C by EcoRⅠand XhoⅠdigestion 1. DL5000 DNA marker,2. pET28a经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,3. pET28a-CZP3CEcoRⅠ和XhoⅠ双酶切。 1. DL5000 DNA marker, 2. pET28a plasmid digested by EcoRⅠ and XhoⅠ, 3. pET28a-CZP3C recombinant plasmid digested by EcoRⅠ and XhoⅠ.
2.3 CZP3C融合蛋白的诱导表达

菌株经小量诱导优化后表明,蛋白表达量在28 ℃、0.6 mmoL·L-1IPTG条件下达到最优,且主要以包涵体的形式存在(图 3)。SDS-PAGE结果显示诱导后菌体相对于诱导前,40 kDa处出现1条明显的表达条带。

图 3 CZP3C融合蛋白的诱导表达 Fig. 3 Induction and expression of CZP3C fusion protein 1. 170.0 kDa蛋白marker,2.诱导前的CZP3C融合蛋白,3.诱导后的CZP3C融合蛋白,4.诱导后CZP3C融合蛋白上清,5.诱导后CZP3C融合蛋白沉淀溶于PBS,6.诱导后CZP3C融合蛋白沉淀溶于尿素。 1. 170.0 kDa protein marker, 2. CZP3C before induction, 3. CZP3C after induction, 4. Supernatant of CZP3C, 5. CZP3C precipitation dissolved in PBS, 5. CZP3C precipitation dissolved in urea.
2.4 CZP3C融合蛋白的纯化

大量诱导超声破碎后获得包涵体沉淀,上镍柱,经咪唑梯度洗脱,洗脱液样品SDS-PAGE证明200 mmol·L-1咪唑将目的蛋白洗脱下来(图 4:A),因此,将200 mmol·L-1洗脱收集液用透析袋尿素梯度复性,收集复性后的蛋白,定量后-80 ℃保存,SDS-PAGE凝胶电泳显示其大小约为40 kDa,纯度达到90%以上(图 4:B)。

图 4 CZP3C融合蛋白的SDS-PAGE检测 Fig. 4 SDS-PAGE analysis of CZP3C fusion protein A:1.穿流,2. 170.0 kDa蛋白marker,3. 40 mmol·L-1咪唑洗脱液,4. 80 mmol·L-1咪唑洗脱液,5. 100 mmol·L-1咪唑洗脱液,6. 200 mmol·L-1咪唑洗脱液,7. 300 mmol·L-1咪唑洗脱液,8. 500 mmol·L-1咪唑洗脱液; B:1. 180.0 kDa蛋白marker,2.纯化后的CZP3C融合蛋白。 A:1. Protein in cross flow, 2. 170 kDa protein marker, 3. Protein in 40 mmol·L-1 elution solution, 4. Protein in 80 mmol·L-1 elution solution, 5. Protein in 100 mmol·L-1 elution solution, 6. Protein in 200 mmol·L-1 elution solution, 7. Protein in 300 mmol·L-1 elution solution, 8. Protein in 500 mmol·L-1 elution solution; B:1. 180 kDa protein marker, 2. CZP3C fusion protein after purification.
2.5 CZP3C融合蛋白特异性检测

将抗原蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后,直接转膜进行Western blot,以检测已获得蛋白的特异性,结果表明:在40 kDa处,抗体与CZP3C融合蛋白发生特异性结合,其大小与预期值相符(图 5)。

图 5 CZP3C融合蛋白Western blot检测 Fig. 5 Western blot detection of CZP3C fusion protein 1. 180.0 kDa蛋白marker,2. CZP3C融合蛋白5 000),二抗(1: 3 000)]。 1. 180.0 kDa protein marker, 2. His-CZP3C fusion protein after purification (dilution ratio of primary and secondary antibodies are 1: 5 000 & 1: 3 000, respectively).
2.6 抗血清效价及特异性检测

第三次免疫后第14天,采用耳缘动脉与颈动脉放血法放血,分离血清,再通过ELISA法确定抗血清效价,以免疫前血清为阴性对照,抗体效价可达到1: 409 600(图 6)。

图 6 ELISA法检测CZP3C兔抗血清效价 Fig. 6 The detection of rabbit CZP3C antiserum titer with ELISA

以抗血清作为一抗(1: 500),羊抗兔IgG作为二抗(1: 3 000),Western blot检测抗血清的特异性,结果表明,抗体能够特异性地与CZP3C融合蛋白结合,为了进一步证明该抗血清对内源性ZP3蛋白的识别能力,采用间接免疫荧光的方法验证了抗犬ZP3抗体与小鼠卵细胞结合的能力。结果表明,在荧光显微镜下,小鼠卵细胞表面的卵透明带显现出了强烈的绿色荧光(图 7)。

图 7 Western blot和间接免疫荧光检测CZP3抗血清的特异性 Fig. 7 The specificity detection of rabbit antiserum against CZP3 with Western blot and indirect immunofluorescence 1. 180.0 kDa蛋白marker,2.纯化后CZP3C融合蛋白(一抗1: 500,二抗:1: 3 000);A,C. 0.9%生理盐水,B,D. CZP3C融合蛋白。 1. 180.0 kDa protein marker, 2. CZP3Cfusion protein after purification (dilution ratio of primary and secondary antibodies is 1: 500 and 1: 3 000, respectively); A, C. 0.9%NaCl, B, D. CZP3C fusion protein.
3 讨论

基因工程重组蛋白能够在不同的表达系统中获得,常见的有原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统(范翠英等,2016)。以大肠杆菌为代表的原核表达系统以其遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点成为了最常用、最经济实惠的蛋白表达系统(杨川,胡敏,2016)。本研究选取大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),在参考文献关于6个组氨酸(6-His)融合蛋白的纯化方法后(Liu & Naismith,2008王毅飞等,2009Wu et al., 2016),结合CZP3蛋白质的理化性质,摸索并诱导纯化获得了纯度达到90%以上、产量为12 mg·L-1的CZP3C融合蛋白,经过SDS-PAGE及Western blot检测证明获得的融合蛋白与预期一致。

抗血清是一种含有多克隆抗体的血清,通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。目前唯一能够治疗埃博拉病毒患者的方法就是通过注射前一个患者的抗血清到患者体内用以中和体内的病毒抗原,从而达到治疗的目的。抗血清不仅在临床中发挥了重要作用,而且在预防及治疗性疫苗的研发阶段同样不可或缺(Chen et al., 2015Shimada et al., 2015Ratanabanangkoon et al., 2016)。以卵透明带为基础的不孕疫苗,需要验证抗ZP3抗体对犬类受精的抑制效果,由于犬ZP3与小鼠ZP3存在免疫交叉,在模式动物小鼠上验证抗原抗体的结合以及对受精效果的影响,才有可能保证后期犬类免疫不孕疫苗试验的成功。研究证明CZP3免疫兔的抗血清能够与小鼠ZP3有效结合,间接证明其对受精抑制的可能性,为后期开展犬类体内及体外实验提供理论支持。

在动物免疫的过程中,抗原蛋白同弗氏佐剂必须完全乳化后,通过背部、足掌、淋巴结周围、耳后等淋巴结富集处皮内或皮下多点注射,才能够激起免疫动物的抗体水平,这种油包水的形式在进入机体体内后会增强抗原的免疫原性,并且富集抗原递呈细胞对抗原的递呈作用,使机体免疫系统产生有效且有针对性的免疫防御(Gutiérrez-Sanchezet al., 2015)。

研究发现:以CZP3全长基因表达融合蛋白时,改变诱导条件并不会对诱导的含量产生大的影响,而在去除了跨膜区和信号肽只保留核心片段之后,诱导后蛋白含量大幅度增加,完全满足了后期的动物免疫和免疫学检测。通过构建高效表达抗原蛋白的原核表达载体,获得了纯度高的抗原蛋白,免疫新西兰大白兔,获得了特异性和效价均较高的CZP3C兔抗血清。ELISA结果表明,在免疫了抗原蛋白后,免疫动物的抗体水平极大地提高。Western blot和间接免疫荧光进一步证明了所获得抗血清是有效且特异的。

流浪犬作为一个特殊的群体,由于生活环境的不稳定,捕获成为免疫研究工作中一个很大的挑战。相对于宠物犬,流浪犬拥有更完善的适应性和免疫防御能力,需要有效的送药系统和多次免疫相结合才能达到令人满意的效果,仅通过一次免疫获得长期不孕还面临很多难题。目前,国内外免疫不孕研究工作主要关注三个方面,通过中和由下丘脑分泌的促性腺激素释放激素来抑制配子(精子和卵细胞)产生,从而从根本上阻止受精过程;以参与受精的相关蛋白为DNA或蛋白疫苗免疫动物,使被免疫动物产生相关的抗体,从而阻断受精过程;通过免疫介导能够中和HCG,而HCG是一种由胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白,对维持人类胚胎的发育所需要的环境和胚胎的生长和发育有重要作用。免疫介导的中和作用会使被免疫动物血液中的HCG大量减少,导致流产和畸形胚的产生,从而降低生育率,达到控制种群数量的目的。总之,对待流浪犬这个特殊的群体,需要探索发现简便、作用时间长且副作用小的免疫不孕疫苗。

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