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文章信息
- 谭帅, 彭锐, 彭确昆, 邹方东
- TAN Shuai, PENG Rui, PENG Quekun, ZOU Fangdong
- 基于DNA条形码和微卫星标记分析矮岩羊的进化地位
- The Evolutionary Status Analysis of Dwarf Blue Sheep Based on DNA Barcording and Microsatellite Markers
- 四川动物, 2016, 35(5): 654-659
- Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(5): 654-659
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20160110
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-03
- 接受日期: 2016-07-20
岩羊Pseudois nayaur是目前岩羊属Pseudois公认的唯一物种,分类学上属于鲸偶蹄目Cetartiodactyla牛科Bovidae羊亚科Caprinae,国家Ⅱ级重点保护野生动物,主要分布在青藏高原及其周边山脉地区,是该地区代表性的大型有蹄类食草动物。岩羊最早被发现命名时,曾一度被归类在盘羊属Ovis内(Wang & Hoffman,1987),此后在生态习性和种群生理结构的研究中,发现岩羊与山羊和盘羊都有相似之处,认为岩羊是介于这两者间的一个物种,而不是最初被认为的属于盘羊属的物种,因此后来该物种被独立为岩羊属,其代表意思为“假羊(fake sheep)”,并建议其中存在2个亚种,分别为四川亚种P. nayaur szechuanensis(Rothschild,1922)和西藏亚种P. nayaur nayaur(Wang & Hoffman,1987),另外还有一个未定的矮岩羊P. nayaur schaeferi种群(Haltenhorth,1963)。
矮岩羊的最大特征是体型仅有普通岩羊的一半大小,目前确定的分布范围局限于四川省西部的巴塘县、白玉县和云南省的德钦县等地区(吴毅等,1990),而最近调查认定其数量已不足500只(Wang et al., 2000),被世界自然保护联盟(IUCN)列入濒危物种红色名录(Huffman & Harris, 2014),也是我国特有的珍稀保护动物。矮岩羊自1937年被发现以来,对于其物种分类地位和体型矮化原因展开了大量的研究,该物种属于一个单独物种或岩羊的亚种(Haltenhorth,1963;Wang & Hoffman,1987),或营养原因导致矮化等观点都曾被提出(Allen,1938),但至今仍没有达成共识。从早年传统的形态学方法产生巨大争议之后,近年来利用分子生物学的方法仍然没有解决矮岩羊的分类地位问题,其中有研究认为矮岩羊应该是岩羊的一个亚种(Feng et al., 2001;曹丽荣等,2003),也有研究发现矮岩羊不应该被作为任何独立的种或亚种(周材权等,2003;Zeng et al., 2008)。但是,这些研究或多或少存在一些缺陷,如研究中的样品全部来自四川西部地区(周材权等,2003),或仅仅使用单一的分子标记(曹丽荣等,2003;周材权等,2003),因此矮岩羊的分类地位仍然处于争议当中。这一现状也导致了矮岩羊目前在保护遗传学中的尴尬地位,即是应该被归为岩羊而作为国家Ⅱ级重点保护野生动物,还是作为稀有物种重点保护。
本次研究采集了来自岩羊不同地理种群的21个岩羊样品和5个矮岩羊样品,其中包括了来自青藏高原和宁夏贺兰山的样品。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)5’端一段648 bp被称为DNA条形码的序列,构建Neighbor-Joining(NJ)系统进化树,计算不同种群间的Kimura 2-parameters(K2P)遗传距离,阐述了这些种群相互间的系统进化关系和遗传分化情况,同时结合8个微卫星位点进一步探讨矮岩羊的进化地位,为其保护提出建议。
1 材料和方法 1.1 样品来源本次研究使用的岩羊样品共21个,分别是:来自西藏乃东县、昌都县和芒康县的样品各1个,来自宁夏贺兰山的6个样品和来自青海省都兰县、海北自治州和海南自治州的样品各1个,剩下的9个样品全部来自四川西部地区,其中包括理县的3个样品、康定县的2个样品和分别来自白玉县、丹巴县、雅江县和甘孜县的样品各1个。5个矮岩羊样品来自四川省巴塘县。由于采集到的肌肉较少,没有使用贺兰山种群的6个样品进行微卫星分析,剩下一共20个样品。具体采样地见图 1。
1.2 肌肉DNA的提取肌肉样本储存在95%乙醇中室温运输,之后在-80 ℃保存。实验时剪取20 mg左右的肌肉组织放入1.5 mL EP管内,加入试剂盒中的GA缓冲液200 μL和蛋白酶K 20 μL,在56 ℃恒温摇床中消化3 h,每隔30 min轻轻颠倒混匀内容物。待样本消化完全后,按照TIANamp Genimic DNA Kit说明书的步骤依次进行,最终提取的DNA在-20 ℃保存。
1.3 PCR扩增和测序扩增DNA条形码序列的引物参考Cai等(2011)。另外,由于目前还未见岩羊微卫星位点的报道,所以本研究从已有的文献中选取了一些扩增山羊效果很好的位点(表 1),用于扩增岩羊基因组微卫星(储明星等,2002;贾斌等,2003;刘全德等,2007;李利等,2009;郭丹等,2010;李国红等,2010;王杰等,2010;许丽梅等,2010)。DNA条形码序列和微卫星的PCR反应体系相同,16.3 μL超纯水,2.5 μL 10×PCR Buffer,2.0 μL dNTP混合液(2.5 mM),2.0 μL MgCl2(25 mM),上、下游引物(10 μM)各1.0 μL,1.0 μL模板DNA(约200 ng),0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1,TaKaRa),总体积25 μL。PCR反应程序如下:95 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s,55 ℃退火40 s,DNA条形码序列72 ℃延伸2 min(微卫星72 ℃延伸1 min),共35个循环;72 ℃最终延伸10 min,最后4 ℃保存。
微卫星位点 | 引物序列(F:正向引物, R:反向引物) (5’-3’) |
标记荧光 | 退火温度/℃ | 染色体位置 |
OarFCB304 | F:CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG* R:CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG |
TAMAR | 60 | 19 |
OarAE101 | F:TAAGAAATATATTTGAAAAAACTGTATCTCCC* R:TTCTTATAGATGCACTCAAGCATGG |
FAM | 63 | 1 |
OarFCB011 | F:GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC* R:GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC |
HEX | 63 | 2 |
SRCRSP09 | F:AGAGGATCTGGAAATGGAATC* R:GCACTCTTTTCAGCCCTAATG |
FAM | 58 | 12 |
SRCRSP010 | F:ACCAGTTTGAGTATCTTGCTTGGG* R:AGGAAGTTTATTGGACAGTGCTGG |
TAMAR | 59 | 8 |
OarJMP08 | F:CGGGATGATCTTCTGTCCAAATATGC* R:CATTTGCTTTGGCTTCAGAACCAGAG |
HEX | 63 | 1 |
OarFCB048 | F:GACTCTAGAGGATCGCAAAGAACCAG* R:GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC |
FAM | 63 | 17 |
OarFCB020 | F:AAATGTGTTTAAGATTCCATACAGTG* R:GGAAAACCCCCATATATACCTATAC |
TAMAR | 55 | 2 |
注:*荧光标记引物。 Note:* fluorescent-labeled primers. |
DNA条形码序列PCR扩增后的产物首先通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确定其片段大小,证明已获得正确的扩增条带后,将PCR产物全部加入到一块新的1.5%琼脂糖凝胶的胶孔中进行电泳,切取目的DNA片段的胶块,使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(OMEGA公司,美国)进行回收,纯化后送深圳华大基因科技服务有限公司测序。微卫星标记的PCR产物每3对为1组,共分成4组,每组里面的3对引物分别标记不同染料(TAMAR、HEX和FAM),标记情况如表 1所示。实时荧光定量PCR产物送北京鼎盛生物科技有限公司分型。
1.4 数据计算所有序列在MEGA v.6.06(Tamura et al., 2013)中运行,之后使用DnaSP v.5.10.01(Librado & Rozas,2009)检查并排除重复的单倍型序列。获得了9个DNA条形码单倍型(GenBank序列号:JX120615~JX120623),另外从GenBank上筛选并下载了1个DNA条形码单倍型BT4(GenBank序列号:HQ269424,来自四川省巴塘县),一共10个单倍型选择了K2P模型构建邻接(NJ)树,自展检验(Bootstrap)1 000次。而遗传距离的计算全部使用K2P距离,遗传代码选择为脊椎动物线粒体,分别设定为西藏岩羊、青海岩羊、四川岩羊、宁夏岩羊和矮岩羊这5个种群,加上外群山羊计算相互间的遗传距离。
微卫星荧光标记引物使用ABI PRISM 377 sequencer (Applied Biosystems,美国)进行基因分型,另外使用GeneMapper V3.2(SoftGenetics,美国)决定各样本等位基因数,而等位基因大小相对分子内标由人类基因组中ROX-50基因决定,从而获得等位基因长度。最后数据采用人工读取后并手动校正,使用Excel保存。Micro-Checker v.2.2.3(van Oosterhout et al., 2004)在微卫星分析中被用来检测无效等位基因频率和大片段等位基因丢失情况。每一个群体的Hardy-Weinberg平衡和等位基因连锁用GenePop v.4.0(Raymond & Rousset,1995)检测。等位基因数量(N)、观察杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、近交系数(FIS)和F-statistic值(FST)用FSTAT v.2.9.3.2(Goudet,1995)计算。同时用Structure v.2.3.1(Pritchard et al., 2000)评估15个岩羊和5个矮岩羊之间的遗传结构。在贝叶斯的遗传结构分析中,选择了等位基因混合模型。考虑到样品数量有限,聚类参数K值设为1~5。每个K值重复运算10次确保结果的稳定性。每次运算中300 000 MCMC被执行,其中25%作为burn-in被去除,最后通过DeltaK方法来确定最佳的K值。
2 结果 2.1 DNA条形码序列分析基于DNA条形码序列的10个单倍型,以山羊为外群(GenBank序列号:AB736134),NJ法构建系统进化树(图 2)。宁夏种群的单倍型和西藏种群的单倍型与四川、青海种群的岩羊和矮岩羊的单倍型在进化树中相互交错,而矮岩羊的单倍型在其中单独形成了一个进化单元,同时也表现为最晚分化的一个单元。在遗传距离的计算中,除了宁夏种群和矮岩羊之间的遗传距离为0.024外,其他种群相互间的遗传距离都在0.01~0.02,而与外群山羊的遗传距离都较远,数值为0.087~0.100(表 2)。
矮岩羊 | 西藏 岩羊 |
贺兰山 岩羊 |
青海 岩羊 |
四川 岩羊 |
山羊 (外群) |
|
矮岩羊 | ||||||
西藏岩羊 | 0.016 | |||||
贺兰山岩羊 | 0.024 | 0.015 | ||||
青海岩羊 | 0.015 | 0.012 | 0.019 | |||
四川岩羊 | 0.014 | 0.012 | 0.018 | 0.009 | ||
山羊(外群) | 0.100 | 0.093 | 0.093 | 0.096 | 0.087 |
15个岩羊和5个矮岩羊样品的8个微卫星位点都被成功扩增,无效等位基因、大片段丢失、等位基因连锁都没有在这8个位点中被发现。群体分析中涉及到的遗传参数值见表 3。在每个位点中,几乎所有的FIS值都是正值,这意味着纯合子过剩。而纯合子过剩也间接地导致了期望杂合度值远高于观察杂合度。群体结构分析结果并没有在这20个个体中显示出跨越亚种间的遗传差异,这也意味着20个个体来自同一个群体。最终计算所得矮岩羊和岩羊间的FST是0.051,而根据基因流(Nm)=0.25(1/FST-1)计算得到的岩羊和矮岩羊之间的基因流是4.65,该值远远大于1。
微卫星位点 | 等位基因 数量N |
期望杂 合度HE |
观察杂 合度Ho |
近交系 数FIS |
F-statistic 值FST |
OARFCB304 | 13 | 0.906 | 0.750 | 0.148 | 0.072 |
OARFCB011 | 14 | 0.908 | 0.600 | 0.134 | 0.061 |
SRCRSP09 | 4 | 0.614 | 0.400 | 0.343 | 0.039 |
OarAE101 | 7 | 0.709 | 0.550 | 0.157 | 0.017 |
SRCRSP10F | 8 | 0.855 | 0.550 | 0.383 | 0.113 |
OarJMP8F | 7 | 0.537 | 0.400 | 0.251 | 0.028 |
OarFCB048F | 11 | 0.883 | 0.750 | 0.181 | 0.071 |
OarFCB20F | 2 | 0.502 | 0.250 | 0.250 | 0.061 |
在DNA条形码序列构建的进化树中,宁夏种群和西藏种群的单倍型与四川、青海种群的单倍型相互交错,并没有像细胞色素b和线粒体控制区域构建的进化树中一样单独形成分支(Zeng et al., 2008)。而在遗传距离的计算结果中发现,矮岩羊与岩羊不同地理种群的单倍型并没有产生明显的遗传分化,结合这些岩羊种群与外群山羊较大的遗传距离数值,说明了DNA条形码序列在种内有较高的保守性。而岩羊各种群间的遗传距离都远远低于牛科中DNA条形码序列在种内的平均距离(0.063),说明了各种群间的遗传分化仍然属于种内水平。但是,矮岩羊的3个单倍型在系统进化树中单独形成了1个单元,同时与岩羊各不同地理种群间的遗传距离都大于0.01,特别是与四川亚种种群的遗传距离达到了0.014,说明矮岩羊存在单独进化趋势的可能性。
研究曾发现矮岩羊与四川西部地区的岩羊样品在细胞色素b和线粒体控制区域这2个分子标记所构建的系统进化树中相互交错,没有形成一个单独的进化单元(Zeng et al., 2008)。同时还发现矮岩羊与岩羊出现了共享同一个细胞色素b基因序列单倍型的情况,所以认为矮岩羊不应该被归为一个种或亚种(周材权等,2003)。而本次研究通过5个矮岩羊样品和15个岩羊样品的微卫星分子标记分析,最终计算所得矮岩羊和岩羊间的FST是0.051。而根据Wright(1978)的标准,当FST < 0.05时,说明群体间分化很小;当0.05≤FST≤0.15时,说明群体间的分化处于中等程度;而当FST > 0.15时,说明群体间产生了高度分化。本次微卫星标记结果所显示的岩羊与矮岩羊之间的遗传分化刚刚达到了中等程度,并没有产生高度的遗传分化。除此之外,利用微卫星计算所得的基因流(Nm=4.65)远大于1,这也表明岩羊和矮岩羊之间曾经存在频繁的基因交流,这也能从微卫星的共享等位基因和私有等位基因的比率得出该结论。
虽然目前认为岩羊和矮岩羊的分布范围重复,但是申定健等(2007)长期在四川竹巴笼自然保护区的生态观察发现矮岩羊和岩羊的微生境并不重叠。矮岩羊生活在金沙江河谷的灌木丛中,而岩羊主要生活在山脉的上部,基本没有发现在河谷地区活动。Wang和Hoffman(1987)也发现岩羊和矮岩羊栖息地之间存在1 000多米的海拔差异,同时被一条狭窄的林带隔离,并且肯定了矮岩羊种群仅包括矮岩羊个体。因此我们认为矮岩羊和巴塘县地区的岩羊很可能满足同域物种形成的概念,即在同一地理位置从1个祖先物种形成2个或更多后代物种的现象(Pennisi,2006)。可以假设矮岩羊的体型矮化是由基因突变造成,而这种突变可能以隐性等位基因的方式在个体中存在,当该等位基因的频率达到一定程度之后,群体中就会不断产生该等位基因纯合的突变个体,最终表现出体型矮小的表型并稳定遗传。可以推测这种纯合突变岩羊因为体型矮小,所以在与普通岩羊的生殖竞争中可能长期处于劣势,只能选择与类似个体进行交配,而逐渐聚集成一个新的群体。这一结果也会导致岩羊群体发生衰退的现象,隐性突变的个体也许会继续传播这一突变,进一步导致矮岩羊这一形态特异群体的产生。
我们推断基因交流或许只发生在矮岩羊与岩羊种群分化的早期阶段,但是近期二者之间因为栖息地的不同很可能已经存在生殖隔离,没有发生基因的交流。因此我们认为矮岩羊和岩羊间目前处于基因交流半隔离状态,遗传分化没有达到种或者亚种水平。本次研究结合线粒体基因和微卫星分子标记的数据,支持矮岩羊目前不应该被归为一个单独的种或者亚种,但可以作为一个形态变异的特殊种群来对待。对于这一结果,同时也需要更多的样品数量和分子标记来进一步支持。
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