四川动物  2016, Vol. 35 Issue (4): 511-516

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汪佰莉, 吴焕童, 曹畅, 张淑萍, 覃筱燕
WANG Baili, WU Huantong, CAO Chang, ZHANG Shuping, QIN Xiaoyan
白桦脂酸对免疫性肝损伤小鼠细胞因子及Bcl-2、activated-Caspase-3表达的影响
The Effects of Betulinic Acid on the Expression of Cytokines and Apoptosis-related Proteins in Immune Liver Injury Induced by Concanavalin A
四川动物, 2016, 35(4): 511-516
Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(4): 511-516
10.11984/j.issn.1000-7083.20160091

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收稿日期: 2016-04-18
接受日期: 2016-06-14
白桦脂酸对免疫性肝损伤小鼠细胞因子及Bcl-2、activated-Caspase-3表达的影响
汪佰莉1,3#, 吴焕童1,2#, 曹畅1,2#, 张淑萍1,2*, 覃筱燕1,2*     
1. 中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081
2. 中央民族大学北京市食品环境与健康工程技术研究中心, 北京 100081
3. 中央民族大学医院检验科, 北京 100081
摘要目的 研究白桦脂酸(BA)对刀豆蛋白(Con A)诱导的急性免疫性肝损伤小鼠细胞因子及凋亡相关蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表达量的影响。 方法 将60只雄性KM小鼠随机分为6组,包括正常对照组,肝损伤模型组,联苯双酯(BIF)阳性对照组,BA高、中、低剂量组(H-BA、M-BA、L-BA组剂量分别为30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。BIF阳性对照组和BA高、中、低剂量组预防性给药15 d后,尾静脉注射20 mg·kg-1 Con A构建小鼠急性免疫性肝损伤模型。采用自动生化分析仪测定血清肝功能指标:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量;ELISA法测定血清炎性细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平;Western blot法检测肝组织凋亡相关蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表达量的变化。 结果 与正常对照组比较,肝损伤模型组血清ALT和AST含量明显降低,IL-2、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)水平明显升高,Bcl-2表达量下降而activated-Caspase-3表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与肝损伤模型组比较,BA不同剂量组可显著降低Con A所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST含量,使小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平显著降低,而IL-10水平显著升高,尤其是H-BA组、M-BA组,同时使Bcl-2表达量升高、activated-Caspase-3表达量下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。 结论 BA对由Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤具有拮抗作用。其机制可能与抗凋亡及降低炎性细胞因子水平和提高抗炎细胞因子水平、减轻T淋巴细胞毒性作用有关。
关键词白桦脂酸     刀豆蛋白     急性免疫性肝损伤     细胞因子     Bcl-2     activated-Caspase-3    
The Effects of Betulinic Acid on the Expression of Cytokines and Apoptosis-related Proteins in Immune Liver Injury Induced by Concanavalin A
WANG Baili1,3#, WU Huantong1,2#, CAO Chang1,2#, ZHANG Shuping1,2*, QIN Xiaoyan1,2*     
1. College of Life & Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 100081, China;
2. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Health, Minzu University of China, Beijing 100081, China;
3. The School Hospital Clinical Laboratory, Minzu University of China, Beijing 100081, China
Abstract: Objective To study the effects of betulinic acid (BA) on the expression of cytokines and apoptosis-related proteins in acute immune liver injury induced by concanavalin A (Con A). Methods A total of 60 male KM mice were divided into six groups randomly, including control group, Con A model group, bifendate (BIF) group and three BA groups with gradient concentrations. Saline diluted BA (30 mg·kg-1, 15 mg·kg-1, 7.5 mg·kg-1) was given orally to mice. After 15 days' BA pretreatment, mice were then injected with Con A (20 mg·kg-1) to establish the mouse model with acute immune liver injury. Automatic biochemical analyzer was conducted to determine serum liver function indices such as plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST);ELISA was used to determine the levels of serum inflammatory cytokines (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ); Western blot was used to detect the expression of liver tissue apoptosis related proteins (Bcl-2 and activated-Caspase-3). Results Compared with the control group, Con A treated mice showed significantly lower serum ALT and AST levels, while the levels of inflammatory cytokines (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ) increased significantly. The expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.05), whereas the expression of activated-Caspase-3 was significantly increased (P<0.01). Compared with the Con A model group, the mice that treated with different doses of BA, especially the middle and high dose groups, showed significantly reduced serum ALT and AST levels, as well as significantly decreased serum IL-2, IL-4, TNF-α and IFN-γ levels but increased IL-10. The apoptosis related proteins Bcl-2 and activated-Caspase-3 also showed contrary expression changes: the former increased while the latter decreased. Conclusion These findings suggested that BA had antagonistic action on the mouse with acute immune liver injury induced by Con A to some extent, and the mechanism of this process may be related with the anti-apoptosis and anti-inflammatory functions of BA to reduce the toxic effects of T lymphocytes.
Key words: betulinic acid     concanavalin A     acute immune liver injury     cytokines     Bcl-2     activated-Caspase-3    

刀豆蛋白(concanavalin A,Con A)诱导的小鼠急性免疫性肝损伤是近年来新建立的且为通过T细胞毒性介导的肝损伤动物模型(Qin et al.,2010Zhou et al.,2013杨逸等,2015郑晨宏,谢晓华,2016)。该模型适合用于人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选(Wahl et al.,2009Wang et al.,2012)。Con A与肝细胞浆膜有极强的亲和性,注入体内后大量聚集于肝脏,诱导大量免疫细胞向肝组织聚集并激活,通过其释放多种炎性细胞因子引起炎症反应,介导肝损伤过程,并进一步激活肿瘤坏死因子(TNF-a),继而通过细胞凋亡机制损害肝实质细胞(Qin et al.,2010Zhou et al.,2013郑晨宏,谢晓华,2016)。

近年来,已有不少关于植物活性成分防治肝损伤的研究开展,并取得了很好的研究进展。白桦脂酸(betulinic acid,BA)属羽扇烷型三萜类化合物,在自然界中广泛存在,众多文献阐述了BA在不同属植物中的存在,但最丰富的自然资源是白桦树,干燥的白桦树外皮中含有约30%的白桦三萜类化合物(Schühly et al.,1999)。BA具有广泛的生物学及药理学活性,如抗氧化、抗炎性和抗肿瘤活性(Cichewicz & Kouzi,2004张琛琛等,2014孙嘉等,2015)。本实验研究采用Con A建立急性免疫性肝损伤动物模型,在前期的研究基础(Qin et al.,2010杨逸等,2015)上探讨BA在急性免疫性肝损伤中的作用及对细胞因子和凋亡相关蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表达的影响。

1 实验材料 1.1 实验动物

60只雄性健康KM小鼠,体质量18~22 g,清洁级,由中国军事医学科学院动物研究所繁育场提供,合 格证号:SCXK-(军)2007-004。于清洁级动物室饲养,自由饮食,室内温度20 ℃~25 ℃,相对湿度60%~ 80%,保持通风,定时换气,每日光照/黑暗更替周期为12 h。

1.2 实验药物

BA购于上海融禾医药科技发展有限公司,货号:120327,纯度>98%。

1.3 实验试剂

谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品,货号:C010-1、C009-1;联苯双酯(bifendate,BIF)为北京协和药厂 产品,批号:11090201;Con A为Sigma公司产品,货号:C2272;肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、 IL-2、IL-4、IL-10试剂盒(北京达科为生物技术有限公司产品,货号:DKW12-2720、DKW12-2000、DKW12-2020、DKW12-2027、DKW12-2055)。activated-Caspase-3抗体(rabbit,产品编号:C2312)、Bcl-2(N-19)抗体(rabbit,产品编号:L1311),均为Santa Cruz Biotechnology产品;Actin抗体(mouse,货号:A5316),为Sigma产品;goat-anti-mouse IgG(产品编号:MD161)、goat-anti-rabbit IgG(产品编号:MD162)、goat-anti-rabbit IgG-HRP(产品编号:H1211),均为Santa Cruz Biotechnology产品;组织裂解液、Tween-20等为上海碧云天生物技术有限公司产品。无水乙醇:分析纯,天津市大茂化学试剂厂,货号:20120728;冰醋酸:分析纯,北京化学试剂公司,货号:10000292。

1.4 实验仪器

7020型全自动生化分析仪(日本HITACHI公司);冷冻高速离心机(德国Heraeus公司);sunrise酶标仪(瑞士Tecan公司);恒温水浴锅(北京长风仪器仪表厂);DYY-TC型电泳仪(北京六一厂);化学发光成像仪Tanon 4200(上海天能公司)。

2 方法 2.1 动物分组及处理

60只KM小鼠随机分为6组,每组10只:正常对照组、肝损伤模型组、BIF阳性对照组(150 mg·kg-1)、BA高、中、低剂量组(H-BA、M-BA、L-BA组剂量分别为30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。正常对照组和肝损伤模型组给予药品溶剂(0.1 mL·10 g-1),每日1次。BIF阳性对照组给予BIF(0.15 mL·10 g-1),每日1次。BA高、中、低剂量组分别给予相应剂量的药物(0.1 mL·10 g-1)。15 d后,除正常对照组外,其余各组均尾静脉注射20 mg·kg-1Con A,建立肝损伤模型,禁食不禁水12 h后,对全部小鼠进行摘眼球取全血处理,所取血液经3 000 r·min-1离心 10 min后,取血清用于实验。外周血采集完毕后,暴露肝脏,快速取肝组织,分别保存于3 mL EP管中,用无菌生理盐水反复洗涤,尽量将血细胞去除,-20 ℃ 暂存。实验时取适当大小肝组织于1.5 mL EP管中,用电动组织研磨器在冰上用细胞裂解液(1∶ 9)分别将小鼠肝组织研磨,冰上裂解30 min后4 ℃,13 000 r·min-1离心25 min,取上清即为所需蛋白,可暂存于-20 ℃,用于Western blot实验。

2.2 小鼠血清ALT、AST活性检测

血清ALT、AST检测采用国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)推荐法,按照试剂盒说明操作,使用酶标仪于波长505 nm处测定吸光度(A)值,根据制作的标准曲线计算出ALT及AST的含量。

2.3 小鼠血清TNF-α、IFN-γ含量测定

采用ELISA方法,测定时向TNF-α、IFN-γ单抗包被的96孔板中每孔加入标准品稀释液或待检样本100 μL,并设空白对照和标准曲线孔。各试剂稀释浓度和步骤按试剂盒操作说明进行。终止反应后,用酶标仪于450 nm处测定相应吸光度(A)值。绘制标准曲线,根据标准曲线方程换算成TNF-α、IFN-γ含量。

2.4 Western blot法检测肝组织Bcl-2、activated-Caspase-3表达量变化

Western blot法如前期工作文献描述(Yang et al.,2014)。用BCA法测定蛋白浓度,对提取的肝组织总蛋白进行蛋白定量。将每个样品的蛋白浓度调成一致,用10%SDS-PAGE分离蛋白质,转膜(PVDF膜),5%的脱脂奶粉封闭30 min,一抗(1∶ 1 000)孵育过夜(4 ℃),TBST洗3~5次,室温下二抗(1∶ 1 000)孵育1 h,TBST洗3~5次,加化学发光液(A液与B液等体积混合)在化学发光成像仪Tanon 4200下检测蛋白质的表达量,拍照。结果以实验组目的蛋白灰度值与对照组β-Actin灰度值的比值进行统计分析。

2.5 统计学处理

实验数据采用GraphPad Prism 5.0进行方差分析及t检验,数据结果均以x±S表示,P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 BA对Con A所致免疫性肝损伤小鼠ALT、AST的影响

肝损伤模型组小鼠血清中ALT、AST活性较正常对照组明显升高,差异有高度统计学意义(P<0.01),说明造模成功。给予药物防治后,与肝损伤模型组比较,2种转氨酶均有不同程度的降低,H-BA组、M-BA组和BIF阳性对照组的ALT、AST降低最为明显(P<0.01);L-BA组ALT、AST降低的差异有统计学意义(P<0.05)。提示BA能显著降低Con A所致肝损伤小鼠ALT和AST活性(表 1)。

表 1 白桦脂酸对刀豆蛋白所致急性免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(n=10) Table 1 The impacts of betulinic acid on ALT and AST of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice(n=10)
组别Group 剂量Does/mg·kg-1 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1)
正常对照组3.00±0.899.66±0.95
肝损伤模型组200.96±45.49▲▲228.69±19.44▲▲
联苯双酯阳性对照组1503.78±1.66**31.49±7.16**
白桦脂酸高剂量组306.10±6.21**38.86±7.31**
白桦脂酸中剂量组1517.94±7.24**51.46±8.71**
白桦脂酸低剂量组7.5104.85±72.44*140.89±67.83*
 注: 与对照组相比,▲▲ P<0.01; 与模型组相比,* P<0.05,** P<0.01; 下表同。
 Notes: compared with the normal group,▲▲ P<0.01; compared with the model group,* P<0.05,** P<0.01; the same below.
3.2 BA对免疫性肝损伤小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影响

肝损伤模型组小鼠血清中IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α、IL-10含量较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与肝损伤模型组比较,H-BA组和BIF阳性对照组IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量明显降低(P<0.01),M-BA组IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01),L-BA组只有IL-2、TNF-α、IFN-r含量明显降低(P<0.05),而IL-4含量降低无统计学意义;与肝损伤模型组比较,各BA剂量组IL-10含量明显升高(P<0.05或P< 0.01),而BIF阳性对照组IL-10含量 的差异无统计 学意义(表 2)。提示BA通过降低免疫细胞产生的炎性细胞因子和提高抗炎性细胞因子的作用,能减轻T淋巴细胞毒性对肝细胞的损伤。

表 2 白桦脂酸对刀豆蛋白所致急性免疫性肝损伤小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影响(n=10) Table 2 The effects of betulinic acid on cytokines(IL-2,IL-4,IL-10,TNF-α,IFN-γ)of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice(n=10)
组别Group剂量Does/mg·kg-1IL-10/pg·mL-1IL-2/pg·mL-1IL-4/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-1IFN-γ/pg·mL-1
正常对照组24.32±1.704.53±0.3032.15±1.2012.60±2.5018.65±7.70
肝损伤模型组29.81±1.90▲▲5.98±1.20▲▲46.72±9.50▲▲48.20±12.80▲▲173.30±56.30▲▲
联苯双酯阳性对照组15030.02±2.204.55±0.60*34.59±2.20**14.80±5.20**65.20±28.70**
白桦脂酸高剂量组3036.31±6.70**4.34±0.10**33.41±1.60**17.00±4.50**78.01±29.40**
白桦脂酸中剂量组1534.84±4.80*4.61±0.20*37.76±3.80*22.00±6.80**85.26±31.90**
白桦脂酸低剂量组7.533.73±4.50*4.75±0.40*43.06±5.7033.40±18.90*91.58±33.50*
3.3 BA对免疫性肝损伤小鼠肝组织中凋亡相关蛋白Bcl-2表达量的影响

造模后,同正常对照组相比,肝损伤模型组小鼠肝组织中Bcl-2的表达量明显下降(P<0.001),而给药后,H-BA组、M-BA组、L-BA组与BIF阳性对照组较肝损伤模型组Bcl-2的表达量明显上升,差异有统计学意义或有高度统计学意义(P<0.01或P< 0.001)(图 1)。说明免疫性肝损伤小鼠肝组织Bcl-2表达量明显下降,而BA能上调Bcl-2的表达,促进肝细胞的存活。

图 1 Western blot检测各组小鼠肝组织中Bcl-2的表达量 Fig. 1 The expression of Bcl-2 in mice liver tissue as determined by Western blot 与正常对照组比较, ***P<0.001; 与肝损伤模型组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,n=3; 下图同。 Compared with the normal group,***P<0.001; compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,n=3; the same below.
3.4 BA对免疫性肝损伤小鼠肝组织中凋亡相关蛋白activated-Caspase-3表达量的影响。

造模后,与正常对照组相比,肝损伤模型组小鼠肝组织中activated-Caspase-3的表达量明显上升(P<0.001),而给药后,H-BA组、M-BA组、L-BA组与BIF阳性对照组较肝损伤模型组activated-Caspase-3的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)(图 2)。说明免疫性肝损伤小鼠肝组织activated-Caspase-3的表达量明显上升,引起肝细胞凋亡,加速肝组织损伤,而BA能下调activated-Caspase-3的表达量,减少了肝细胞凋亡,促进肝组织的修复。

图 2 Western blot检测各组小鼠肝组织中activated-Caspase-3的表达量 Fig. 2 The expression of activated-Caspase-3 in mice liver tissue as determined by western blot
4 讨论

许多研究表明,肝内免疫反应是引起肝损伤的重要机制之一,在乙肝发病过程中引起肝细胞损伤和破坏的直接因素是T淋巴细胞介导的细胞毒性免疫反应(Qin et al.,2010杨逸等,2015)。T淋巴细胞作为免疫效应细胞和免疫调节细胞,在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用。

Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤是通过T淋巴细胞介导的免疫性肝损伤动物模型(Wahl et al.,2009Qin et al.,2010Zhou et al.,2013杨逸等,2015)。Con A与肝细胞浆膜有极强的亲和性,注入体内后大量聚集在肝脏,小鼠体内ALT和AST迅速升高,同时大量免疫细胞向肝脏聚集,激活T淋巴细胞及kupffer细胞等,通过释放多种细胞因子引起炎症反应参与肝损伤过程,并进一步激活释放TNF-α,通过细胞凋亡机制加速肝细胞损害(Gong et al.,2010Chen et al.,2012Fullerton et al.,2013Tsutsui & Nishiguchi,2014)。ALT和AST是肝细胞损伤的敏感指标(Qin et al.,2010杨逸等,2015)。本研究结果显示,小鼠经尾静脉注射Con A 12 h后,血清中ALT、AST水平均明显升高,而且TNF-α等细胞因子的血清含量亦明显升高,与文献报道一致(Qin et al.,2010杨逸等,2015),提示Con A诱导的免疫性肝损伤模型成功建立。本研究结果还显示,与肝损伤模型组比较,H-BA、M-BA、L-BA组小鼠血清中ALT、AST明显降低,提示BA对免疫性肝损伤具有明显的保护作用。

研究表明,Con A造成的免疫性肝损伤小鼠模型中IFN-γ、TNF-α是引起急性肝损伤的重要炎症细胞因子(Guilho et al.,1996Qin et al.,2010)。T淋巴细胞的激活在整个肝损伤发生过程中起了核心的调节作用。T淋巴细胞激活,可导致Th1细胞分泌的细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ及Th2细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-10水平均显著升高。IL-2、IL-4和IFN-γ等炎性细胞因子可以激活kupffer细胞诱导TNF-α等其他炎症因子的产生,扩大炎症反应,引起持续的肝细胞损伤(Tiegs et al.,1992Guilho et al.,1996Kakumu et al.,1997Qin et al.,2010)。IL-10为巨噬细胞和T淋巴细胞在肝内产生的强有力的抗炎性细胞因子,可以抑制Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ等)的细胞免疫功能,对急性肝损伤具有保护作用(Mizuhara et al.,1996Zhang et al.,2001)。本实验结果看到,肝损伤时小鼠血清中炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、 TNF-α的含量显著升高,而抗炎性因子IL-10的含量也有明显升高,可能与肝脏损伤后机体自身可释放一定量的抗炎性因子有关。而给予BA干预后,发现BA各剂量组可显著下调肝损伤小鼠血清中已经升高的IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α因子含量,同时升高抗炎性因子IL-10的含量,提示BA可以进一步促进抗炎性因子的释放以对抗炎症反应。

Con A造成的免疫性肝损伤中,肝细胞的死亡有肝细胞的凋亡和坏死,炎症细胞因子可以通过死亡配体和受体的相互作用诱导肝细胞的凋亡(Gantner et al.,1995)。细胞凋亡的发生与抗凋亡蛋白因子如Bcl-2和蛋白激酶B等以及促凋亡蛋白因子如Caspase-3、细胞色素c和Bax等有密切的关系(Muñoz-Pinedo,2012Yang et al.,2014)。Caspase-3通过选择性地切割某些物质,从而造成细胞凋亡。activated-Caspase-3是几乎所有细胞凋亡的最后执行者(Muñoz-Pinedo,2012Yang et al.,2014)。本实验结果显示,Con A造模后,小鼠肝组织中Bcl-2表达下降,activated-Caspase-3表达量明显升高,说明肝细胞启动了凋亡机制,引起肝损伤,药物干预后,Bcl-2表达量上升,activated-Caspase-3表达量明显下调,说明BA通过上调抗凋亡蛋白的表达抑制肝细胞凋亡,进而促进肝组织的修复,减少肝损伤。

综上所述,BA对Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤具有拮抗作用。BA通过减少免疫细胞炎性细胞因子同时提高抗炎性细胞因子的释放,以及上调Bcl-2和下调activated-Caspase-3的抗凋亡机制而发挥拮抗肝损伤的作用。

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