四川动物  2016, Vol. 35 Issue (3): 409-413

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索丽娟, 罗磊, 高学斌, 赵洪峰
SUO Lijuan, LUO Lei, GAO Xuebin, ZHAO Hongfeng
Cd2+处理后麻雀脑组织中糖皮质激素受体和盐皮质激素受体表达变化
Expression of Glucocorticoid Receptors and Mineralocorticoid Receptors in the Brain of Passer montanus after Cadmium Treatment
四川动物, 2016, 35(3): 409-413
Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(3): 409-413
10.11984/j.issn.1000-7083.20150346

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收稿日期: 2015-11-05
接受日期: 2016-03-02
Cd2+处理后麻雀脑组织中糖皮质激素受体和盐皮质激素受体表达变化
索丽娟1, 罗磊1, 高学斌1, 赵洪峰2*     
1. 陕西省动物研究所, 西安 710032
2. 陕西师范大学生命科学学院, 西安 710119
摘要目的 检测在Cd2+处理后糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)在麻雀Passer montanus脑组织中的表达变化。 方法 6只麻雀随机分成2组,每组3只。处理组饮水中添加500μg·L-1 Cd2+,对照组不添加。用ClustalW2将麻雀的GR和MR氨基酸序列与其他物种氨基酸序列进行相似性比对分析。采用Real-time PCR检测基础水平下麻雀各组织中GR和MR基因的表达水平。Cd2+处理后,测定GR和MR基因在脑组织中的表达变化。 结果 麻雀与斑胸草雀Taeniopygia guttata和原鸡Gallus gallus的GR和MR氨基酸序列的相似性大于90%;GR和MR基因在麻雀肝脏、肠、心脏、眼球、脑、肺、肌肉、肾脏和性腺9个组织中均有表达;Cd2+处理后,处理组脑组织中GR和MR mRNA表达水平均上调,且显著高于对照组(P<0.05)。 结论 GR和MR在麻雀各组织中广泛表达;推测GR和MR基因在Cd2+的应激反应中具有重要作用,具体作用还有待于进一步论证,同时该研究为野外工作提供了一定的实验依据。
关键词糖皮质激素受体     盐皮质激素受体     麻雀     基因表达     应激    
Expression of Glucocorticoid Receptors and Mineralocorticoid Receptors in the Brain of Passer montanus after Cadmium Treatment
SUO Lijuan1, LUO Lei1, GAO Xuebin1, ZHAO Hongfeng2*     
1. Shaanxi Institute of Zoology, Xi'an 710032, China;
2. College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, China
Abstract: [Objective] The expression levels of glucocorticoid receptors (GR) and mineralocorticoid receptors (MR) were measured in the brain of Passer montanus after cadmium treatment. Methods Six P. montanus were randomly divided into 2 groups. Treatment group was fed with water of 500μg·L-1 Cd2+. Alignment of amino acid sequence of GR and MR was performed using the ClustalW2. Real-time PCR was performed to study the baseline expression levels of GR and MR among different tissues. Finally, the expressions of GR and MR were determined in the brain of P. montanus after cadmium treatment. Results The result of amino acid sequence alignment showed that the GR and MR of P. montanus had high similarity with Taeniopygia guttata and Gallus gallus (>90%). Real-time PCR results showed that the GR and MR expressed in all of nine detected organs and tissues. Compared with the control, the expression levels of GR and MR were significantly up-regulated after cadmium treatment (P<0.05). Conclusion The GR and MR were widely expressed in tissues of P. montanus. GR and MR might play a significant role under the cadmium stress. This research provided the experimental evidence for fieldwork.
Key words: glucocorticoid receptors     mineralocorticoid receptors     Passer montanus     gene expression     stress    

鸟类是野生动物的一个重要类群,是食物链中的高级消费者。鸟类广泛分布于不同生态环境以及生态环境中的不同生态位,生活史较为复杂,寿命较长,体温高,代谢速率快,从环境中获取物质相对多,对自然环境变化较为敏感(Donald et al.,2001Gregory et al.,2005)。另一方面,鸟类生理行为(内分泌和组织发育)对于重金属污染物有显著的响应(Janssens et al.,2003Burger & Eichhorst et al.,20052007Carere et al.,2010),因而常被作为环境污染的代表性指示物种。

重金属镉(Cd)是动物体内的非必需元素,属于环境内分泌干扰物,具有激素效应,对生殖和内分泌功能有较大的影响(Messner & Bernhard,2010)。随着现代工农业的发展,Cd2+被大量释放,对环境造成了污染。通过测定鸟体组织(Burger & Eichhorst,2005张丹等,2013Luo et al.,2015)中重金属的含量可以反映鸟类所处环境中的重金属浓度。但该方法不足以反映重金属污染的实际毒理效应,所以本研究拟从分子水平上探讨重金属污染对鸟类的影响。 索丽娟等:Cd2+处理后麻雀脑组织中糖皮质激素受体和盐皮质激素受体表达变化

长期的Cd2+污染对鸟是一种慢性应激刺激,Cd2+往往通过取食、饮水、呼吸等途径在鸟体内积累。鸟类应激反应的最早表现为糖皮质激素(glucocorticoid,GC)浓度升高(Sapolsky et al.,2000Romero,2004)。GC由肾上腺分泌,是下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴激活的终产物,同时可以负反馈调节HPA轴,抑制HPA轴的活性(Aguilera,1998),也可以动员能量储备,调节一系列激素的合成和作用,抑制免疫系统功能,并促进避害和自我维持行为(Wingfield & Kitaysky,2002邓琼,2014),其功能的发挥往往依赖糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors,GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptors,MR)(Du et al.,2014)。GR和MR作为核受体可以调控基因转录(基因组反应)(Oitzl et al.,2010),同时也可以介导快速的非基因组反应(Groeneweg et al.,20112012)。在脊椎动物中,GR和MR的核苷酸和氨基酸序列高度保守(Kwok et al.,2007Oka et al.,2013)。斑胸草雀Taeniopygia guttata GR和MR的部分DNA片段已经被克隆(Hodgson et al.,2007),并成功预测出全长cDNA,且正确性已经被表达序列标签(expressed sequence tag)技术证实(Warren et al.,2010)。

麻雀Passer montanus是一种常见的杂食性雀形目留鸟,数量庞大,分布广泛,且易于获取,实验室饲养技术成熟,所以被选为本实验的研究对象。首先,将麻雀的GR和MR氨基酸序列与其他物种的进行相似性比较;其次,通过Real-time PCR测定基础水平下GR和MR基因在麻雀不同组织中的表达状况;然后比较Cd2+处理前、后麻雀脑组织中GR和MR基因表达的变化。本研究旨在探讨秦岭水域附近麻雀体内GR和MR基因表达水平变化能否作为监测秦岭水源涵养区重金属污染的敏感标志物之一,并为其提供实践基础和理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验对象

6只麻雀购于陕西省西安市朱雀路花鸟鱼虫市场,体质量19.6~20.3 g,均健康无病,饲养在陕西师范大学生命科学学院动物实验室。适应性饲养1周后,随机分成2组,每组3只。处理组饮水中含有500 μg·L-1 Cd2+,对照组不添加Cd2+。实验期间,麻雀可以自由取食饮水,食物(带壳的谷子)充足,每日换水3次(早、中、晚)。

1.1.2 主要试剂

RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa),氯仿(天津市天力化学试剂有限公司),异丙醇(天津市天力化学试剂有限公司),无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司),焦碳酸二乙酯(DEPC,Amresco),琼脂糖(Biowest Agarose),FastQuant cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司],Taq酶(TaKaRa),普通琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司],SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)。

1.1.3 主要仪器

CFX96 TouchTM荧光定量PCR检测仪(Bio-Rad),高速冷冻离心机(Thermo),Nanodrop分光光度计(Thermo),凝胶成像分析系统(Bio-Rad)。

1.2 方法 1.2.1 总RNA提取

饲养15 d后处死麻雀,解剖取其肝脏、肠、心脏、眼球、脑、肺、肌肉、肾脏和性腺9个组织,液氮浇冻研磨。研磨后按RNAiso Plus试剂盒说明书提取麻雀各组织RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。用Nanodrop分光光度计测定RNA样品浓度和OD260/OD280值。样品存于液氮中备用。

1.2.2 总RNA反转录

用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1 μg·μL-1。以此为模板按FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。将反转录产物置于-20 ℃保存备用。

1.3 Real-time PCR反应检测体系

根据GenBank中报道的麻雀GR(登录号:KJ414462.1)和MR(登录号:KJ414463.1)基因序列,利用Primer 5设计引物,由上海华大基因科技有限公司合成(表 1)。

表 1 实验引物的相关信息 Table 1 Primer used in this study
基因Gene引物 Primer引物序列(5’→3’) Primer sequence(5’→3’)退火温度 Annealing temperature/℃产物长度 Product size/bp
糖皮质激素 受体GRSGTCCTCGCAGGTGTTTCTT56199
AGCTTGTCACTGGTGGTTTG
盐皮质激素 受体MRSTGAAATCTCCCGTCTCAAGTC56149
AATCCCACAGTGCTAACCG
β-actinSACACTGTGCCCATCTACGA56155
AGATGTCACGCACGATTTCC

利用CFX96 TouchTM 荧光定量PCR检测仪对各基因的表达情况进行检测,反应体系如下:0.5 μL 20 μmol·μL-1的上、下游引物,1 μL反转录产物,12.5 μL SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ,10.5 μL ddH2O。反应条件为95 ℃30 s;95 ℃5 s,56 ℃30 s,72 ℃30 s,35个循环;在最后1个循环结束后做熔解曲线,温度65 ℃~95 ℃。同一样品重复3个反应。结果采用2-△Ct和2-△△Ct法进行相对表达分析,以β-actin作为内参基因对结果进行标准化。

1.4 数据分析

采用SPSS 16.0和Excel 2010进行数据统计与分析,所有数据均以平均值±标准差(±SD)表示。对实验数据进行One-Way ANOVA分析并用LSD法进行多重比较。当P<0.05时,差异有统计学意义。

2 结果 2.1 麻雀GR和MR氨基酸序列相似性分析

在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中获得8个物种GR和MR的氨基酸序列,采用ClustalW2进行相似性分析(表 2)。结果表明,麻雀与斑胸草雀、原鸡Gallus gallus的氨基酸序列相似性较高,均高于90%,与斑马鱼Danio rerio的相似性最低,仅为54.70%。

表 2 麻雀与其他8个物种糖皮质激素受体和盐皮质激素受体氨基酸序列的比对 Table 2 Amino acid sequence alignments of Passer montanus glucocorticoid recoptors(GR)and mineralocorticoid receptors(MR)with other species
物种SpeciesGenBank登录号GenBank accession number相似性Similarity/%
GRMRGRMR
斑胸草雀Taeniopygia guttataXP_002192988.1NP_001070158.198.7198.17
原鸡Gallus gallusNP_001032915.1NP_001152817.193.9195.51
斑马鱼Danio rerioNP_001018547.2NP_001093873.151.2454.70
非洲爪蟾Xenopus laevisNP_001081531.1NP_001084074.166.5370.08
美洲短吻鳄 Alligator mississippiensisBAM78289.1BAM78288.185.3891.53
野猪Sus scrofaNP_001008481.1XP_013834297.174.0982.14
小鼠Mus musculusNP_032199.3NP_001077375.174.9080.97
Homo sapiensCAJ65924.1AAA59571.175.2383.78
2.2 GR和MR基因在基础水平各组织的表达分析

采用Real-time PCR检测到GR和MR mRNA在麻雀各组织中均有表达,其在心脏和肌肉中的相对表达量高于其他组织,肝脏、眼球、脑和肺次之,肠、肾脏和性腺较低。脑中的相对表达量与其他各组织相比,差异有统计学意义(P<0.05)(图 1)。

图 1 在麻雀不同组织中糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)mRNA的相对表达量(结果用2-△Ct分析) Fig. 1 Relative expression of glucocorticoid receptors(GR)and mineralocorticoid receptors(MR)mRNA in different tissues of Passer montanus (based on the analysis of 2-△Ct)
2.3 Cd2+对麻雀脑组织GR和MR基因表达的影响

在饮水中加入500 μg·L-1 Cd2+ 15 d后,处理组麻雀脑组织中GR和MR mRNA的表达水平均上调,且显著高于对照组(P<0.05)(图 2)。

图 2 Cd2+对麻雀脑组织中糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)mRNA表达量的影响(结果用2-△△Ct分析) Fig. 2 Effects of watering cadmium contamination on glucocorticoid receptors(GR)and mineralocorticoid receptors(MR)mRNA expression levels in the brain of Passer montanus (based on the analysis of 2-△△Ct)* P<0.05.
3 讨论

GR和MR因参与GC的下游调控而备受关注。ClustalW2分析结果表明,麻雀的GR和MR氨基酸序列与其他鸟类、鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类存在相似性。与斑胸草雀的相似性最高,这与它们同属于雀形目是相对应的。另外,有研究表明,GR和MR在家麻雀P. domesticus和斑胸草雀中广谱表达并且参与应激反应(Schmidt et al.,2010Lattin & Romero,2014),推测麻雀的GR和MR基因也具有类似的分布特征和功能。

对麻雀基础水平下GR和MR基因的组织表达分析是研究这2个基因功能的重要基础工作。本实验随后测定了麻雀不同组织中GR和MR mRNA的相对表达量。Real-time PCR结果分析显示,GR和MR在麻雀的9个组织中均有表达,与家麻雀(Lattin et al.,2012)和斑胸草雀(Schmidt et al.,2010)的研究结果类似,且在肌肉、心脏中表达较高。总体来说,在具有代谢功能的组织中GR和MR表达相对较高,如肝脏是糖异生的主要场所,肾脏是第二场所,肌肉中可以产生糖异生的底物——氨基酸,这些组织可能参与应激反应时的能量动员。

应激反应中,GC的浓度会随着机体生理、环境和社会等因素的变化而变化(Lattin et al.,2012)。GC通过与GR和MR结合发挥生物学效应,并且这2种受体与GC的亲和力不同。MR与GC的亲和力高于GR,低水平GC优先与MR结合,高水平GC优先与GR结合(Oitzl et al.,2010)。高水平的GC与GR结合之后,GR被激活,GR-GC复合物进入细胞核内,对下游促炎转录因子发挥转录抑制的调节作用,进而达到抗炎的效应(de Kloet et al.,2005)。另外,在代谢性组织(肌肉、肝脏、脂肪等)中GR-GC可以与GC应答元件结合,促进参与糖异生、蛋白分解和脂肪分解相关基因的转录表达(Poleti et al.,2015)。哺乳动物大脑富含GR和MR,而GR和MR共同参与HPA轴的负反馈调节(Rozeboom et al.,2007Oitzl et al.,2010)。在应激反应中,大脑中的MR主要负责维持神经元的完整性和稳定性(Oitzl et al.,2010),GR通过抑制HPA的过度反应使GC恢复到基础水平(Tasker & Herman,2011)。为了解Cd2+处理后,麻雀脑组织中GR和MR的表达变化,本实验在麻雀饮水中添加500 μg·μL-1 Cd2+ 15 d后,对其脑组织中MR和GR mRNA表达水平进行检测,结果显示GR和MR mRNA表达水平均显著上调。有研究表明,MR过表达的雄性转基因小鼠脑组织中的GC水平低于正常小鼠,由此可见,MR过表达可能会降低GC水平(Kanatsou et al.,2015)。综上所述,推测上调的MR和GR mRNA都有可能降低GC浓度并使其恢复到正常的水平。随着时间的延长,GC是否会恢复到正常水平,长时间Cd2+刺激是否会引起大脑的病理变化,还有待进一步研究。

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