身体质量(body condition)是反映有机体存活能力的指标，通常指有机体的营养或健康状况(Andersson，1994)。性选择理论的遗传指示模型(genetic indicator model)假定性信号能真实地反映雄性个体的身体质量，雌性选择与性信号及存活能力间存在遗传相关(Searcy & Nowicki，2005)。然而，雄性性信号真实度是如何维持的呢？障碍原理(handicap principle)认为，性信号的表达必须支付适合度代价。而且，这种代价的高低与信号发出者的身体质量相关(Zahavi，1975；Grafen，1990)。因而，确定性信号的适合度代价是性信号进化研究的重要目标。根据代价的来源，性信号代价可分为信号接收者依赖性或非依赖性代价(receiver-dependent or receiver-independent costs)，后者根据形成的时序又可分为生成(production)、发育(developmental)及维持(maintenance)代价。例如，蛙类或马鹿吼叫时的能量消耗、鸣禽类鸣唱时的时间支出、三刺鱼Gasterosteus aculeatus炫耀色彩时的捕食风险属于生成代价；雄孔雀长出细长羽毛的能量和营养投资，属于发育代价；鸟类尾羽长超过阈值时会明显增加飞行负荷，则属于维持代价。性信号的代价是多方面的，代价间并不是互相排斥的，它们单独或协同作用以维持性信号的真实度(Searcy & Nowicki，2005)。

Hamilton和Zuk(1982)提出寄生物与寄主的协同进化能维持适合度的遗传变异，促进了针对寄生与性信号关系的大量研究。随后，Folstad和Karter(1992)提出了免疫能力障碍假说(immunocompetence handicap hypothesis)，即免疫抑制是性信号的表达代价，类固醇激素(如睾酮)介导了性信号与免疫能力间的生理权衡。尽管这个假说得到很多实验证据的支持，但仍存在争论(Roberts et al.，2004)。除了类固醇激素介导的权衡，基于有限资源(能量、营养)的分配权衡(allocation trade-off)也是免疫与性信号的潜在关联途径(Peters，2007)。此外，也有研究发现氧化损伤是表征性信号免疫代价的潜在机制(Costantini et al.，2015)。

由于性信号的身体质量依赖性，理论预测免疫能力与性信号表达在个体间呈正相关，在个体内呈负相关(Folstad & Karter，1992；Getty，2002)。这个预测得到大量的相关数据支持(Møller et al.，1999)。然而，相关分析不能等同于因果关系，免疫能力与性信号的权衡关系只有通过实验操纵途径(experimental manipulation)才可以确定(Møller et al.，1999；Roberts et al.，2004；López et al.，2009；Ibáñez et al.，2014)。采用实验操纵途径检测性信号免疫代价的研究主要集中在基于类胡萝卜素的视觉性信号上，因为类胡萝卜素是合成某些动物视觉性信号(如鸟类羽毛的艳丽色彩)的必需成分，同时又可调节免疫系统(Svensson & Wong，2011)。采用实验操纵途径检测语音性信号的免疫代价的研究很少，且集中在鸣禽类(Garamszegi，2005；Costantini et al.，2015)。免疫代价在维持无尾两栖类语音性信号真实度中的作用还不清楚。

非洲爪蟾Xenopus laevis是一种生活在非洲南部营完全水生的蛙类，经过长期室内驯化实现了室内种群的生长、繁殖，且保存了与野外种群一致的语音通讯特征(Tobias et al.，2004)，因而是验证无尾两栖类语音性信号免疫代价的理想模型。语音性信号具有多个结构特征参数(蒋志刚等，2012)，既包括反映身体质量的"障碍"信号成分(handicap signals)，也包括反映身体形态固有属性、不依赖于身体质量的"指示"信号成分(index signals)(Grafen，1990；Smith & Harper，1995)。一般来说，在语音性信号的结构特征参数中，与机能相关的特征(performance-related trait)参数与寄生强度或免疫能力的相关性更强(Garamszegi，2005)。我们前期的研究发现，在众多结构特征参数中，鸣叫时长(call duration)、总的鸣叫个数(total calls)、回合内鸣叫速率(within-bout call rate)等参数与身体质量指数都为正相关关系(Xu et al.，2011;王小翠等，未发表数据)。因此，在本研究中我们仅选择与身体质量相关性最强的参数——鸣叫时长来指示非洲爪蟾语音性信号的强度。为了激活非洲爪蟾的免疫系统，选用主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的灭活大肠杆菌作为刺激源(Morales et al.，2003；Ibáñez et al.，2014)。此外，很多研究表明，只在资源获取或分配受到限制的条件下，免疫与其他耗能的生理学过程之间才可能发生权衡关系(Zera & Harshman，2001；张志强，王德华，2005；张志强，2015)。因此，本研究拟在禁食条件下检测非洲爪蟾免疫功能与性信号表达的关系。

以性成熟的雄性非洲爪蟾为研究对象。采用长61 cm×宽43 cm×高37 cm的蓝色塑料箱饲养(水深20 cm)，饲养箱顶部一半用箱盖遮蔽以提供隐蔽环境。每周定时投食(锦鲤颗粒饲料，深圳寸金鱼饲料公司)3次，每次保证2 h内水面有饲料可以采集。每隔14 d更换1次饲养水体。室内空调温度设定为20 ℃，但实验期间室外昼夜温差较大(6.09 ℃±0.59 ℃)，对实际室温及水温影响较大。考虑到外温动物行为生理与温度的线性关联，统计采用环境温度作为协变量以去除干扰。光周期12L∶12D(08∶00开，20∶00关)。实验前给每只非洲爪蟾拍照保存以用于个体鉴定，每隔21 d重新拍照记录以防止蜕皮等因素影响个体识别。

实验选取66只体质量为23～59 g(平均36.46 g±0.84 g)的个体，随机分为3组(每组22只):对照组(control)、禁食组(fasting)和禁食加免疫刺激组(fasting+immunized)。免疫激活剂为灭活的大肠杆菌溶液。制备流程简述如下:将在琼脂糖培养基中过夜培养的大肠杆菌沸水浴1 h后冰上放置5 min，再在4 ℃下3 500 rpm离心15 min。离心得到的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解稀释。实验期间，对照组自由采食，禁食组和禁食加免疫刺激组禁食处理。同时为避免过度饥饿造成病理性损伤，每周监测体质量，将其下降幅度控制在10%～15%内。实验开始时(第0天)，先测定非洲爪蟾的繁殖鸣叫(鸣叫时长和趋声速率)，然后进行自由采食或禁食处理，至第43天时对照组和禁食组分别注射0.3 mL生理盐水，禁食加免疫刺激组则注射相同体积的灭活大肠杆菌溶液，次日(第44天)再次测定非洲爪蟾的繁殖鸣叫。

录音测定在2只内壁粘有消音海绵的玻璃缸(长87 cm×宽37 cm×高50 cm)中进行。为保证非洲爪蟾处于性活跃状态，在录音前24 h和6 h每只非洲爪蟾分别注射100和50单位(IU)的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)。录音测定开始于每晚20∶00，每次随机选取2只非洲爪蟾随机放入2只测定水缸内，每晚测定6只非洲爪蟾，测定的前后顺序随机。录音测定时将非洲爪蟾由饲养水箱转移至录音测定水缸后适应15 min。然后采用水下扬声器(响应频率:0.1~10 kHz，Sun Pride Inc.，Zhejiang)回放雌性个体的rapping鸣叫，同时通过水下麦克风((Lab-core System，Washington DC)记录45 min内雄性个体的鸣叫状况，录音同时采用红外摄像机(BL-CS3720IB-WL-I2H；4 mm，深圳波粒科技股份有限公司)拍摄非洲爪蟾的行为活动。其中水下扬声器通过功率放大器(T-50U，杭州中河电子器材有限公司)与电脑相连，水下麦克风连接电脑后通过Adobe Audition 3.0录制声音，红外摄像机通过电脑服务器软件PDVR(8.5.5.28版本，深圳波粒科技股份有限公司)监测行为。

非洲爪蟾的鸣叫通过Adobe Audition 3.0进行分析。鸣叫时长为45 min内所有鸣叫回合的累加值。通过PDVR和MB-Ruler 4.0统计时间和运动距离。趋声速率为非洲爪蟾由所在位置游向播放雌性个体的rapping鸣叫的水下喇叭的距离/运动时间。数据主要使用IBM SPSS Statistics 21.0进行统计分析。分析前均采用Kolmogorov-Smirnov检验对所有数据进行正态性检验。若不符合正态分布，则取平方根进行转换。免疫刺激及能量限制对鸣叫时长的影响采用适应重复测量的混合线性模型(linear mixed models)。所有模型包括温度、时间(处理前、处理后)、实验处理(对照、禁食、禁食加免疫刺激)以及处理时间×实验处理作为固定效应变量，实验个体作为随机效应变量。将温度和测定群组顺序作为随机变量增加了AIC(Akaike information criterion)值，因此没有包括在模型中。参数估计值及标准误采用限制性最大似然迭代法。实验处理前和实验处理后趋声速率的差异采用Kruskal-Wallis Test分析。显著性水平设定为P=0.05，所有数值以平均值±标准误表示(Mean±SE)。

实验第0天，3组非洲爪蟾间体质量差异无统计学意义(图 1)。实验结束时，对照组体质量增加3.02%，禁食组和禁食加免疫刺激组体质量分别下降11.27%和11.63%，ANOVA分析表明，3组非洲爪蟾间体质量差异有统计学意义(F_2，63=3.679，P<0.05)，其中对照组体质量显著大于禁食组与禁食加免疫刺激组，而后两者间差异无统计学意义。这说明禁食处理造成了能量限制，但免疫激活没有进一步增加能量限制效应。

图 1 非洲爪蟾实验期间体质量变化(*表示组间差异有统计学意义) Fig. 1 Change of body mass of Xenopus laevis during experiment(* P < 0.05)

图选项

混合线性分析结果显示(表 1，表 2)，处理时间对鸣叫时长有显著效应(P<0.001)，实验处理前鸣叫时长显著大于实验处理后。禁食以及禁食加免疫刺激对鸣叫时长均无显著影响，但温度作为协变量对鸣叫时长具有显著的负效应(P<0.05)。然而，t值显示温度对鸣叫的影响还不足以解释非洲爪蟾在实验前后个体内鸣叫时长的变异，内源性的节律可能是产生此类变异的重要原因。

实验处理前(χ²=0.189，df=2，P>0.05)和实验处理后(χ²=3.179，df=2，P>0.05)的组间趋声速率差异均无统计学意义，这说明禁食或免疫刺激对非洲爪蟾的繁殖活性均无明显影响。

图 2 实验处理前后非洲爪蟾的行为趋声性 Fig. 2 Behavioral phonotaxis of Xenopus laevis before and after treatment

图选项

无尾两栖类整个生活史高度依赖富含寄生物的水生环境。因此，相比其他陆生脊椎动物类群，寄生物应该在无尾两栖类信号进化中扮演更为重要的作用(Todd，2007)。然而，我们的结果显示，激活免疫能力与非洲爪蟾语音性信号间不存在生理权衡，免疫代价不是非洲爪蟾语音性信号真实度的维持机制。也有研究发现，线虫感染对草莓箭毒蛙Oophaga pumilio的语音性信号和视觉性信号均无显著作用(Pröhl et al.，2013)；灰树蛙Hyla versicolor鸣叫参数与寄生物负荷强度间无显著相关性(Hausfater et al.，1990)。但是，在鸟类中的研究则发现，绵羊红细胞刺激白领姬鹟Ficedula albicollis可以抑制其鸣叫速率(Garamszegi et al.，2004)；鸡新城疫苗刺激欧洲椋鸟Sturnus vulgaris抗体生成也降低了鸣唱速率(Costantini et al.，2015)。因为数据有限，我们尚不能确定这些不一致的结果是否反映了语音性信号免疫代价的种间或类群差异。如前所述，性信号的代价主要来自存活，而这种存活代价与物种的生态和进化历程相关。适合度存活组分间也存在权衡，例如反捕食风险的能力与免疫能力。如果适合度对捕食风险更加敏感，雌性偏好的则是一个反映反捕食能力而不是免疫能力的性信号(Getty，2002)。有证据显示，非洲爪蟾对寄生物有较强的耐受性，如它可以耐受感染许多两栖类的强致病菌壶菌Batrachochytrium dendrobatidis (Robert & Ohta，2009)。这可能部分解释了非洲爪蟾语音性信号对免疫刺激无应答的现象。

然而，值得注意的是，本研究第二次鸣叫测定时，非洲爪蟾已处于繁殖末期(11月底—12月初)，所有组别的鸣叫时长较初次测定已显著下降。非洲爪蟾的季节性鸣叫与睾酮含量显著正相关，如夏季含量是冬季的10倍(Kang et al.，1995)。因而可以推测，免疫刺激时非洲爪蟾的睾酮及受体表达水平都处于较低水平。如果睾酮是导致非洲爪蟾免疫能力与性信号生理权衡的内在机制，免疫激活对语音性信号的抑制效应可能会因内分泌系统的敏感性降低而被掩盖。所以，相关结论尚需在繁殖盛期进一步加以验证。

蛙类的鸣叫是耗能的，随物种不同，鸣叫时与其静止时的能耗比值可以为1.13~15.07(Stoddard & Salazar，2011)。因而能量是限制蛙类鸣叫的重要因素(Brepson et al.，2013)。我们的研究发现，与对照组比较，非洲爪蟾在体质量减少10%的情形下鸣叫时长没有显著变化；另一项限食实验也确认了这个结果(王小翠等，未发表数据)。这可能有两方面的原因:首先，与许多小型蛙类比较，非洲爪蟾个体较大，考虑到体型与能量支出的异速关系(Burton et al.，2011)，其应对能量限制的能力较强。已有研究表明，禁食60 d时非洲爪蟾肝脏中糖酵解过程中的酶类及中间代谢产物都没有变化(Woof & Janssens，1978)；禁食6个月后体质量降幅达30%，但通过降低代谢率、减少尿素和乳酸排泄、动用脂肪储存等适应策略可保持稳定的血糖水平(Merkle & Hanke，1988)。其次，蛙类鸣叫应对能量限制的策略与身体质量相关。例如，无斑雨蛙Hyla arborea禁食10 d体质量下降15%没有减少鸣叫总量，但在能量受限组别内，体质好的大个体主要是抑制其鸣叫属性(call property)，而体质差的小个体则主要是降低其鸣叫活性(call activity)(Brepson et al.，2013)。在非洲爪蟾中也发现了类似现象(王小翠等，未发表数据)。

总之，研究发现禁食和免疫激活对非洲爪蟾的鸣叫时长和反映繁殖活性的趋声速率无明显影响，说明非洲爪蟾免疫能力和语音性信号表达间不存在生理权衡。考虑温度和雄激素的节律效应，有必要在繁殖盛期严格控温的条件下再次检测非洲爪蟾语音性信号的免疫代价。