四川动物  2016, Vol. 35 Issue (1): 105-108

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孙晓菲, 杨皓然, 柳弯, 解宇环
SUN Xiaofei, YANG Haoran, LIU Wan, XIE Yuhuan
性别对皮肤屏障障碍模型小鼠表皮厚度及丝聚合蛋白表达的影响
Gender Differences in Epidermis Thickness and Filaggrin Expression of Mice Skin Barrier Dysfunction Models
四川动物, 2016, 35(1): 105-108
Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(1): 105-108
10.11984/j.issn.1000-7083.20150207

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收稿日期: 2015-06-10
接受日期: 2015-09-14
性别对皮肤屏障障碍模型小鼠表皮厚度及丝聚合蛋白表达的影响
孙晓菲, 杨皓然, 柳弯, 解宇环     
云南中医学院基础医学院, 昆明 650500
摘要: 目的 探索性别对小鼠皮肤屏障功能的影响。方法 用丙酮-乙醚法和胶带粘贴法复制皮肤屏障功能障碍模型、观察性别对皮肤屏障障碍模型小鼠的表皮厚度和丝聚合蛋白(FLG)表达的影响。结果 与正常对照组相比,丙酮-乙醚组和胶带粘贴组小鼠表皮厚度增宽(P<0.05);正常对照组雄鼠与雌鼠相比,表皮厚度无差异;而丙酮-乙醚组和胶带粘贴组雌鼠表皮厚度均较同组雄鼠增加(P<0.05)。丙酮-乙醚组和胶带粘贴组与正常对照组相比,FLG蛋白表达水平降低(P<0.05),同组雄鼠表达水平均低于雌鼠(P<0.05)。结论 皮肤机械屏障功能被破坏后,小鼠的表皮厚度变化存在性别差异,而FLG蛋白表达在正常或是皮肤屏障障碍小鼠中的性别差异均有统计学意义,提示在研究小鼠皮肤屏障障碍相关疾病的发病机制和治疗措施时应重视性别差异。
关键词: 性别     皮肤屏障障碍模型     表皮厚度     丝聚合蛋白    
Gender Differences in Epidermis Thickness and Filaggrin Expression of Mice Skin Barrier Dysfunction Models
SUN Xiaofei, YANG Haoran, LIU Wan, XIE Yuhuan     
Basic Medicine School, Yunnan University of TCM, Kunming 650500, China
Abstract: Objective To investigate whether genders would affect mice skin barrier dysfunction models. Methods The mice skin barrier dysfunction models were constructed by the acetone-ether method and repeated tape stripping. The epidermis thickness and Filaggrin (FLG) expression of mice skin were measured by hematoxylin and eosin staining and western-blot. Results The result of morphological analysis showed that the epidermis thickness of model mice were thicker than normal control group (P<0.05). There was no significant difference between the males and females in normal group, whereas the epidermis were thicker in the females of both model groups than the males in the same group (P<0.05). Epidermal FLG expression was decreased in both model groups (P<0.05), additionally, the expression levels of model mice FLG were higher in the female in all groups (P<0.05). Conclusion There were gender differences of skin thickness in skin barrier dysfunction models. In both normal and barrier dysfunction model groups, the FLG expression showed a gender bias, and this suggested that we should pay more attention on the gender differences on the study of pathogenesis and treatment of disease with skin barrier dysfunction.
Key words: gender     skin barrier dysfunction model     epidermis thickness     filaggrin    

皮肤是机体与外部环境间的重要屏障。广义的皮肤屏障功能指皮肤的物理性屏障作用,以及色素屏障作用、神经屏障作用、免疫屏障作用以及其他与皮肤功能相关的诸多方面;狭义的皮肤屏障通常指表皮的机械性屏障结构(刘玮,2008)。皮肤结构及功能的稳定对保护机体内脏器官和组织免受外界有害因素损伤,防止体内水分电解质及营养物质的丢失具有重要意义。皮肤屏障功能可受诸多因素影响,如性别、年龄、基因遗传等。近年来人们逐渐重视性别与皮肤疾病的关系,一些常见的皮肤疾病如湿疹、脱毛、皮肤癌等在组织学、病理学和免疫学等方面均表现出性别差异(Dao et al. ,2007)。以往研究多集中于性别对健康机体皮肤屏障的影响,而本研究将采用化学试剂(丙酮-乙醚)法(李钦等,2008)和胶带粘贴法(Mona等,2008)复制小鼠皮肤屏障障碍模型,并观察性别对模型小鼠表皮厚度和丝聚合蛋白(Filaggrin,FLG)表达的影响,以进一步揭示性别与皮肤屏障障碍相关疾病发病机制的关系。

1 材料和方法 1.1 动物

SPF级ICR小鼠60只,雌雄各半,6~8周龄,体质量18~22 g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,使用许可证号:SCXK(滇)K2011-0011,生产许可证号SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要试剂

兔抗FLG antibody购自Santa Cruz公司;山羊抗兔GAPDH antibody购自博奥森生物科技有限公司;其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3 主要方法 1.3.1 皮肤屏障障碍模型的复制

将健康ICR小鼠60只,随机分为6组,分别是正常对照组(♂)、正常对照组(♀)、丙酮-乙醚组(♂)、丙酮-乙醚组(♀)、胶带粘贴组(♂)、胶带粘贴组(♀),每组10只。正常对照组不予模型干预。于造模前1 d将各组小鼠用剃刀剃掉颈背部毛。造模当天丙酮-乙醚组小鼠用2 cm×2 cm脱脂棉蘸取丙酮∶ 乙醚=1∶ 1混合液覆盖于剪毛处15 s,然后取另一2 cm×2 cm脱脂棉蘸取蒸馏水覆盖于剪毛处30 s,每天2次;胶带粘贴组小鼠用强力胶带反复粘贴剃毛处皮肤,每天2次,每次4~5下。连续造模6 d后将小鼠处死,取下造模处皮肤,用打孔器将剪下的皮肤打成皮肤圆片。

1.3.2 小鼠表皮厚度测量

取各组小鼠皮片1片置于10%中性甲醛溶液中,经石蜡包埋作组织切片,苏木精-伊红(HE)染色,在光镜下观察各组小鼠皮肤整体形态。每张皮肤共拍5张图,拍完后用Image-Pro Plus 6.0软件在每一张图片上选5个点,一张皮肤共选25个点测量小鼠表皮厚度,所得值的平均值即为小鼠表皮厚度值。

1.3.3 Western-blot法检测FLG表达水平

皮肤样品以20 mg加100~200 μL组织裂解液 提取蛋白并定量。10%SDS-PAGE 分离蛋白,以每平方厘米凝胶面积1.5 mA转1~2 h,将蛋白转至PVDF膜。1%牛血清白蛋白封闭1 h。滴加一抗(anti-Filaggrin)后,4 ℃过夜。将膜放入密封袋中加二抗,室温摇床上轻摇1 h,化学发光试剂自显影。凝胶成像分析系统扫描显色带,定量分析软件Quantity One分析其灰度值。

1.4 统计学处理

用GraphPad Prism 5软件进行分析。数据均以Mean±SD表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD)。

2 结果 2.1 性别对皮肤屏障障碍模型小鼠表皮厚度的影响

与正常对照组相比,丙酮-乙醚组和胶带粘贴组小鼠的表皮厚度增宽(P<0.05);正常对照组雄鼠与雌鼠相比,表皮厚度无差异;而丙酮-乙醚组和胶带粘贴组雌鼠表皮厚度均较同组雄鼠增加(P<0.05)(图 1)。

图 1 性别对小鼠皮肤屏障障碍模型表皮厚度的影响 Fig. 1 Effects of genders on epidermis thickness in skin barrier dysfunction model mice A为经HE染色的小鼠表皮石蜡切片(×20): a. 正常对照组(♀), b. 正常对照组( ♂ ), c. 丙酮-乙醚组(♀), d. 丙酮-乙醚组( ♂ ), e. 胶带粘贴组(♀), f. 胶带粘贴组( ♂ ); B为正常对照组、丙酮-乙醚组和胶带粘贴组雌雄小鼠表皮厚度的比较: 数值以Mean±SD表示, n=10; 与正常对照组相比, * P<0.05。 A. Paraffin sections of mouse epidermis stained with hematoxylin and eosin (×20): a. normal control group (♀), b. normal control group ( ♂ ), c. acetone-ether group (♀), d. acetone-ether group ( ♂ ), e. tape stripping group (♀), f. tape stripping group ( ♂ ); B. Comparison between male and female epidermis thickness in normal control group, acetone-ether group and tape stripping group: values are presented as Mean±SD, n=10; compared with the normal control group, * P<0.05.
2.2 性别对皮肤屏障障碍模型小鼠FLG蛋白表达的影响

与正常对照组相比,胶带粘贴组与丙酮-乙醚组小鼠FLG蛋白表达降低,而雌鼠FLG蛋白表达均高于同组雄鼠,差异有统计学意义(P<0.05)(图 2)。

图 2 Western-blot法检测小鼠表皮丝聚合蛋白表达水平 Fig. 2 Western-blot detection for filaggrin expression in mice epidermis 数值以Mean±SD表示, n=10; 与正常对照组相比, *P<0.05; 与同一模型组的雌鼠相比, △ P<0.05。 Values are presented as Mean±SD, n=10; compared with normal control group, * P<0.05; compared with normal the female individuals in the same model group, △ P<0.05.
3 讨论

有研究表明,皮肤是雌激素重要的靶器官(Brincat et al.,2005),雌激素可通过调节其受体α(ERα)增加角质层的厚度,促使角质层中脂类的沉积及角质层复层板层膜的形成(Azzi et al.,2005)。相反,给孕鼠注射睾丸激素会延缓小鼠皮肤屏障功能的形成。这一结果在离体皮肤培养中得到进一步证实。据此可知,性激素可直接作用于皮肤而影响皮肤屏障功能。本研究发现正常ICR雌性小鼠的表皮较雄性小鼠稍厚,但差异无统计学意义;而有机试剂和物理剥脱刺激所造成的小鼠皮肤屏障障碍模型却观察到雌鼠的表皮较雄鼠厚,且差异有统计学意义,说明雌激素可能参与了动物表皮损伤后的异常增生。

角质层中角质细胞是移行至角质层并呈终末分化的角质形成细胞,它们被角蛋白丝固定并由交联蛋白组成的细胞膜和共轭脂质膜包围,是角质层最重要的保护性结构组分之一,构成了“砖-墙”结构体系中的“砖”。在角质形成细胞正常分化的最后阶段,排列有序的角蛋白通过与中间丝相关蛋白相互作用构成了一种浓缩阵列。其中,中间丝相关蛋白聚合成束状角蛋白细丝,进而促进了细胞死亡后扁平形态的形成(Dang et al. ,2005),这对维持皮肤屏 障的结构稳态具有重要作用。在哺乳动物表皮中,角蛋白和中间丝相关蛋白占蛋白含量的80%~90%,若两者基因突变将直接影响角质层屏障组织结构的完整性,继而出现一系列以角质层屏障受损相关为主要表现的皮肤疾病(田燕,刘玮,2013);Presl and等(2004)研究发现,若正常的中间丝相关蛋白及丝聚合蛋白原缺失,小鼠在出生时可表现出皮肤干燥、脱屑等。有研究发现雌激素可以调节胎鼠表皮的分化和FLG的表达(Kömüves et al.,1998)。本研究发现皮肤屏障障碍模型小鼠的FLG蛋白表达明显低于正常对照组,而雌鼠的FLG蛋白表达均高于同组雄鼠,说明性别可能会影响皮肤屏障障碍小鼠角质层的完整性。本研究进一步揭示了性别对小鼠皮肤屏障的影响,并为皮肤疾病小鼠模型的性别选择提供了参考。

参考文献
李钦, 王妍, 刘晓青, 等. 2008. 小鼠皮肤机械屏障功能障碍瘙痒模型的研究[J]. 云南中医中药杂志, 29(10): 51-53.
刘玮. 2008. 皮肤屏障功能解析[J]. 中国皮肤性病学杂志, 22(12): 758-761.
Mona Man, 吕成志, 辛淑君, 等. 2008. 表皮通透屏障功能与表皮CD44表达关系的研究[J]. 临床皮肤科杂志, 37(7): 426-427.
田燕, 刘玮. 2013. 皮肤屏障[J]. 实用皮肤病学杂志, (6): 346-348.
Azzi L, E1-Alfy M, Martel C, et al. 2005. Gender differences in mouse skin morphology and specific effects of sex steroids and dehydroepiandrosterone[J]. Journal of lnvestigative Dermatology, 124(1):22-27.
Dang NN, Pang SG, Song HY, et al. 2015. Filaggrin silencing by shRNA directly impairs the skin barrier function of normal human epidermal keratinocytes and then induces an immune response[J/OL]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. [2015-06-05]. http://dx.doi.org/10.1590/1414-431X20144047.
Dao H Jr, Kazin RA. 2007. Gender differences in skin: a review of the literature[J]. Gend Med, 4(4): 308-328.
Kömüves LG, Hanley K, Jiang Y, et al. 1998. Ligands and activators of nuclear hormone receptors regulate epidermal differentiation during fetal rat skin development[J]. Invest Dermatol, 111(3): 429-433.
Presland RB, Coulombe PA, Eckert RL, et al. 2004. Barrier function intransgenic mice overexpressing K16, involucrin and filaggrin in thesuprabasal epidermis[J]. Invest Dermatol, 123(3): 603-606.