鱼类精子的形态及活力是影响其繁殖效果的重要因素(Gagnon，1990)。鱼类的精子活力是评价精子质量最重要的指标，与受精率成显著正相关(Vladic & Jarvi，1997)。而鱼类精子超微结构的研究不仅有助于揭示其受精机理及系统进化，而且在硬骨鱼类分类学研究中具有重要的实践意义(刘雪珠，杨万喜，2002)。

宽体沙鳅Sinibotia reevesae隶属鲤形目Cypriniformes鳅科Cobitidae沙鳅亚科Botiinae，为长江上游特有经济鱼类(丁瑞华，1994)。近年来，由于水利工程建设和采砂作业对其产卵场和索饵场的破坏，加之水体污染，其野生资源量急剧下降(岳兴建等，2011)。目前，对宽体沙鳅的研究主要集中在胚胎发育(岳兴建等，2011)、组织学(王芳等，2011)、个体生殖力(黄燕等，2011)、亲鱼脂肪酸组成(颉江等，2013)、繁殖生物学(王永明等，2014)及年龄与生长(王永明等，2015)等方面，尚无其精子超微结构及精子活力的研究。本文对宽体沙鳅精子超微结构及不同浓度Na⁺、K⁺、Ca²⁺溶液对其精子活力的影响进行了研究，旨在为该鱼生殖生物学的研究和深入开展人工养殖提供基础资料。

2014年5月，于沱江(银山段)收集性成熟宽体沙鳅，选取性腺发育良好的健康雄鱼进行试验，体质量12.42 g±0.58 g，体长88.33 mm±3.92 mm。

活体解剖并切取大小为0.1 cm³的成熟精巢，用2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，叔丁醇置换，CO₂临界点干燥，JEOL JEC-3000FC喷金，JSM 6510LV扫描电镜观察拍照，观察精子的外部形态。

活体解剖并切取大小约0.1 cm³的成熟精巢，用2.5%戊二醛固定，24 h后用pH7.4的0.2 mol·L^-1磷酸缓冲液冲洗3次，梯度乙醇脱水，丙酮置换，环氧树脂650聚合包埋，LKB-5型超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染，H-7500透射电镜观察、拍照，观察精子的超微结构。

精液采集 用吸水纸或干毛巾吸干雄鱼生殖孔表面及周围的水分并擦净，由前往后轻压鱼腹两侧获得精液。用干燥洁净的载玻片接取精液，置于冰浴中备用。要求精液乳白色、粘稠、无水、无血、无尿、无粪便，遇水后能迅速散开。采集的精液样品应至少每10 min更换一次，避免在空气中长时间暴露导致精子失活影响实验结果。

试验液配制 配置3种不同阳离子试验液，每种试验液用曝气去离子水配制6~7个浓度梯度：

NaCl溶液：0 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1、25 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1、75 mmol·L^-1和100 mmol·L^-1。

KCl溶液：0 mmol·L^-1、0.1 mmol·L^-1、0.3 mmol·L^-1、0.5 mmol·L^-1、0.7 mmol·L^-1、0.9 mmol·L^-1和1.0 mmol·L^-1。

CaCl₂溶液：0 mmol·L^-1、1 mmol·L^-1、3 mmol·L^-1、5 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1、15 mmol·L^-1和20 mmol·L^-1。

活力观察 参照鲁大椿(1989)的方法将宽体沙鳅精子的运动分为快速运动、中速运动、慢速运动和原地颤动4个阶段。有效运动时间(effective movement time，ET)是快速运动时间与中速运动时间之和，为精子的有效受精时间。精子寿命(sperm life time，ST)指精子从激活开始，到约90%的精子停止原地颤动所需的时间。

活力测定 用干净润洗过的胶头滴管滴半滴试验液于干燥洁净的载玻片上，置于Motic-BA210显微镜(40×)上，调节显微镜至视野清晰。用干净牙签蘸取少许新鲜宽体沙鳅精液于视野可见范围内的试验液调匀，同时按下秒表计时。观察视野范围中精子的运动状况，记录快速运动时间、中速运动时间、慢速运动时间和寿命。每个浓度连续观察30次，结果用“平均数±标准差”表示。

统计分析 采用SPSS 19.0和Excel 2003对实验所得数据进行统计分析。

扫描电镜观察发现，宽体沙鳅精子充满了整个精巢小叶腔(图版Ⅰ：1)。精子由头部、中片和尾部组成(图版Ⅰ：2)。头部圆球形，长径2.525 μm±0.197 μm，短径2.181 μm±0.148 μm；中片漏斗形，较短，长0.420 μm±0.033 μm;尾部为一细长的鞭毛。

图版Ⅰ 宽体沙鳅精子超微结构 Plate Ⅰ Ultrastructural of the sperm of Sinibotia reevesae1. 精子(sp)充满整个小叶腔; 2. 成熟精子，示头部(H)，中片(M)和鞭毛(F); 3. 精子头部纵切，示核膜(NM)，核空泡(NV)，精子细胞质膜(PM)，袖套腔(S)，囊泡(V)和鞭毛(F); 4. 精子头部纵切，示基体(BB)，线粒体(Mt)，近端中心粒(PC)和细胞核(N); 5. 鞭毛纵切，示轴丝(A); 6. 鞭毛横切，示中央微管(CM)，动力蛋白臂(DA)和外周二联管(PD)。 1. Sperm(sp)in the lobules of the rip testis of S. reevesae; 2. Mature sperm，showing head(H)，mid-piece(M) and flagellum(F); 3. Logitudinal section of a mature sperm，showing nuclear membrance(NM)，nuclear vacuole(NV)，plasma membrance of the sperm(PM)，central space of sleeve(S)，vesicle(V) and flagellum(F); 4. Logitudinal section of a mature sperm，showing basal body(BB)，mitochondrion(Mt)，nucleus(N) and proximal centriole(PC); 5. Logitudinal section of a flagellum，showing axoneme(A); 6. Transverse section of a flagellum，showing central microtube(CM)，dynein arm(DA) and peripheral doublet microtube(PD).

图选项

头部 透射电镜观察发现，宽体沙鳅精子头部无顶体，外被质膜，质膜表面凹凸不平，呈现微小波浪状，细胞质甚少(图版Ⅰ：3，4)。整个精子头部几乎被细胞核占据，核内染色质致密，偶见零星分布的核空泡，核空泡大小0.37 μm，其内可见有电子致密状颗粒分布，核膜紧贴质膜(图版Ⅰ：3)。核后有一凹陷的植入窝且植入窝偏向一侧，植入窝凹陷深度约为细胞核长径的1/6(图版Ⅰ：4)。

中片 宽体沙鳅精子中片较短，由中心粒复合体、袖套及少量线粒体组成。中心粒复合体由近端中心粒和基体组成(图版Ⅰ：4)。近端中心粒与基体呈“L”形排列，基体起始端横断面可见“9+2”型双联微管结构且基体两侧底部分别有少量线粒体分 布(图版Ⅰ：4)。袖套紧接细胞核的后端，不对称分布于鞭毛两侧，中央空隙为袖套腔(图版Ⅰ：4)。袖套一侧狭长，内含线粒体1~2个(图版Ⅰ：3)；另一侧肥厚，内含数个线粒体和多个囊泡(图版Ⅰ：3，4)。线粒体椭圆形，其内嵴清晰可见(图版Ⅰ:3)。

尾部 宽体沙鳅精子的尾部起始于袖套腔并由基体长出的轴丝外延形成，其主要结构为轴丝(图版Ⅰ：5)。 轴丝为典型的“9+2”型双联微管结构，微管膜结构及动力蛋白臂清晰可见(图版 Ⅰ：6)。尾部外表面质膜向外突出形成侧鳍，侧鳍呈两侧对称或等比例分为3支，尾部后段侧鳍较前段发达(图版 Ⅰ：3，6)。

在Na⁺浓度0~100 mmol·L^-1范围内，精子均可存活，精子活力在75 mmol·L^-1时达到最高，此时精子的有效运动时间和寿命分别为(37.45±4.43)s和(98.93±8.78)s。对照组中精子活力最低。单因素方差分析，Duncan多重检验显示：精子有效运动时间在75 mmol·L^-1与50 mmol·L^-1之间差异有统计学意义(P<0.05)，在75 mmol·L^-1与其余各组之间差异有高度统计学意义(P<0.01)； 精子寿命在75 mmol·L^-1与其他5种不同浓度的NaCl溶液之间差异有高度统计学意义(P<0.01)(图 1)。

图 1 不同浓度NaCl对宽体沙鳅精子活力的影响 Fig. 1 The effect of diverse concentrations of NaCl on Sinibotia reevesae sperm

图选项

精子在K⁺浓度0~1.0 mmol·L^-1范围内均具活力，在0.5 mmol·L^-1时达到最高，此时精子的有效运动时间和寿命分别为(26.05±1.86)s和(52.78±2.96)s。有效运动时间和寿命分别在对照组和K⁺浓度1.0 mmol·L^-1时最短。单因素方差分析，Duncan多重检验显示：精子有效运动时间和寿命在0.5 mmol·L^-1与在其他6种不同浓度的KCl溶液之间差异有高度统计学意义(P<0.01)(图 2)。

图 2 不同浓度KCl对宽体沙鳅精子活力的影响 Fig. 2 The effect of diverse concentrations of KCl on Sinibotia reevesae sperm

图选项

精子在Ca²⁺浓度为0~20 mmol·L^-1范围内均具活力，在5 mmol·L^-1时有效运动时间达到最高，为(19.61±0.99)s；在10 mmol·L^-1时寿命最高，为(61.30±7.14)s。精子活力的最低有效时间和最低寿命分别在20 mmol·L^-1和0 mmol·L^-1时。单因素方差分析，Duncan多重检验显示：精子有效运动时间和寿命在5.0 mmol·L^-1与其他6组不同浓度的CaCl₂溶液之间差异有高度统计学意义(P<0.01)(图 3)。

图 3 不同浓度CaCl2对宽体沙鳅精子活力的影响 Fig. 3 The effect of diverse concentrations of CaCl2 on Sinibotia reevesae sperm

图选项

鱼类精子的形态结构因物种的不同略有差异，其头部形态及内部构造显示出了种属的差异及受精方式的相关性(刘雪珠，杨万喜，2002)。精子按其头部的形状大致分为3类：螺旋形、柱塞形和圆形(刘雪珠，杨万喜，2002)。宽体沙鳅精子头部圆球形，为真骨鱼类所特有(谢从新，2012)。头部长径(2.525±0.197)μm，短径(2.181±0.148)μm，较泥鳅Misgurnus anguillicaudatus(长径2.1 μm，短径1.6 μm)(高令秋等，1995)、大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(长度1.79 μm±0.28 μm)(李飞等，2011)和长薄鳅Leptobotia elongata(直径0.9~1.1 μm)(王志坚等，2009)精子头部长。已有研究表明，绝大多数硬骨鱼类精子头部直径与其卵膜表面的受精孔大小有关，这是鱼类保证单精受精的重要因素(王永明，2011)。宽体沙鳅精子头部前端无顶体，与长薄鳅和大多数鲤科鱼类相同，为非顶体型(刘筠，1993)。头部细胞核中偶见核空泡分布。透射电镜观察发现核空泡无生物膜包裹，为一种非泡状结构，且空泡内有电子致密状颗粒分布。该现象与黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco(尤永隆，林丹军，1996a)中的观察结果一致。大多数硬骨鱼类精子头部细胞核的后端均存在植入窝，如黄颡鱼精子的植入窝呈井状(尤永隆，林丹军，1996a)，鲤Cyprinus carpio精子的植入窝周围有多余的核膜(尤永隆，林丹军，1996b)。宽体沙鳅精子的植入窝凹陷，凹陷深度为细胞核长径的1/6，不如长吻鮠精子植入窝发达(凹入深度约为长径的5/6)(张耀光等，1993)。宽体沙鳅质膜与核膜紧贴，与鲤形目鳅科的长薄鳅(王志坚等，2009)和鲤科的鲤(尤永隆，林丹军，1996b)结构相同，与鲈形目鮨科的斜带石斑鱼Epinephelus coioides(赵会宏等，2003)质膜与核膜之间存在细胞质和少量囊泡不同。这种细胞质的多少及囊泡的存在有何生理意义尚待进一步研究。

硬骨鱼类精子中片的有无尚存争议，尤永隆和林丹军(1997)认为硬骨鱼类精子头部与中片连接紧密，中性粒复合体与细胞核相并列，不应将之排斥在头部之外。结合宽体沙鳅的扫描电镜结果，宽体沙鳅精子中片是相对独立的，其由中心粒复合体和袖套组成。中心粒复合体包含近端中心粒与基体，两者呈“L”形排列。这与鲤(尤永隆，林丹军，1996b)的研究结果相同，与斜带石斑鱼的“〉”形(赵会宏等，2003)较为类似，与硬骨鱼类精子常见的“T”形(Billard，1986)不同。袖套大多存在于硬骨鱼类精子中，为精子储能仓库，其形态和结构因硬骨鱼类种属关系略有差异(刘雪珠，杨万喜，2002)：西伯利亚鲟Acipenser baerii精子未见袖套结构(章龙珍等，2003)；尼罗罗非鱼Tilapia nilotica精子的袖套分为上段和下段两部分，上段较厚，含有较多线粒体和囊泡，下段较薄，仅含有多余的核膜(尤永隆，林丹军，1998)；哲罗鱼Hucho taimen精子的袖套两侧不对称，线粒体不规则排列且存在部分线粒体融合现象(尹洪滨等，2008)；鲤精子的袖套包括肥厚一侧和狭窄一侧，肥厚一侧含较多的线粒体和囊泡，狭窄一侧线粒体则较少(尤永隆，林丹军，1996b)。宽体沙鳅的袖套结构与鲤相似。

鱼类精子尾部的主要结构为轴丝，Jamieson等(2009)依据轴丝的位置，将精子分为Ⅰ型(鞭毛轴丝与细胞核底部垂直)和Ⅱ型(鞭毛轴丝与细胞核横向平行)2种。宽体沙鳅精子属于Ⅰ型，与鲤形目鳅科的长薄鳅(王志坚等，2009)，鲤科的鲤(尤永隆，林丹军，1996b)、铜鱼Coreius heterokon(郑曙明，1997)、稀有鮈鲫Gobiocypris rarus(王永明，2011)，鲇形目鲿科的黄颡鱼(尤永隆，林丹军，1996a)，鲈形目鮨科的斜带石斑鱼(赵会宏等，2003)相同;而与鲈形目石首鱼科的黄姑鱼Nibea albiflora和大黄鱼Pseudosciaena crocea(胡谋等，2014)不同。宽体沙鳅精子尾部轴丝为典型的“9+2”型双联微管结构，与大多数硬骨鱼类相同(尤永隆，林丹军，1996b；赵会宏等，2003；王永明，2011)，与同属于鳅科的长薄鳅“9+3”型(王志坚等，2009)不同。侧鳍的形态及存在与否，不同的鱼类表现不一。斜带石斑鱼尾部无侧鳍(赵会宏等，2003)；哲罗鱼精子一侧侧鳍较另一侧发达(尹洪滨等，2008)；长薄鳅两侧侧鳍均发达(王志坚等，2009)。与上述鱼类不同，宽体沙鳅精子尾部侧鳍发达且呈两侧对称或等比例分为3支。有关侧鳍的有无能否影响精子游泳速率，进而影响受精率，不同学者观点不同。Stoss(1983)认为侧鳍对于改善精子的游泳速率，提高卵子受精率有重要意义。而Afzelius(1978)则认为侧鳍与精子游泳速率的提高关系不大。宽体沙鳅精子侧鳍的特殊形态可能与其鞭毛的摆动方式有关，具两侧侧鳍的精子鞭毛可能呈上下或左右摆动，具3个分支侧鳍的精子鞭毛可能呈螺旋形摆动，有关侧鳍是否能提高其精子的游泳速率有待进一步研究。

Na⁺、K⁺和Ca²⁺既是鱼类血浆、精浆的重要组分，也是构成渗透压和影响精子活力的主要离子(苏德学等，2004)。已有研究表明，适当浓度的Na⁺可通过诱发精子细胞膜去极化产生动作电位，间接地激活精子运动(徐革锋等，2005)；精浆中高浓度的K⁺能抑制虹鳟Oncorhynchus mykiss和马苏大麻哈鱼Oncorhynchus masou精子的活动(Mosrisawa et al.，1983)；精子细胞内的Ca²⁺也是激活精子的必需因素(Hadi Alavi，2004)。本实验测得，宽体沙鳅精子的最适Na⁺、K⁺、Ca²⁺浓度分别为75 mmol·L^-1(0.44% NaCl)、0.5 mmol·L^-1(0.0037% KCl)和5 mmol·L^-1(0.055% CaCl₂)。最适Na⁺浓度与泥 鳅(0.50%)(柴毅等，2009)相当，较宽口光唇鱼Acrossocheilus monticolus(0.51%)(罗芬，何学福，1999)、稀有鮈鲫(0.55%)(王永明等，2011)低。最适K⁺、Ca²⁺浓度均较泥鳅(阮国良等，2004)低。因此，鱼类精子对各种激活介质的最适浓度因种而异，可能与其生存环境和精浆组成相关。本实验发现，Na⁺、K⁺、Ca²⁺均对宽体沙鳅精子的激活具有促进作用，但较高浓度的Na⁺、K⁺、Ca²⁺皆能抑制宽体沙鳅精子的活力。建议人工授精时采用适当浓度的激活介质，对于硬度较高的水体，应适当降低硬度。有关Na⁺、K⁺、Ca²⁺ 在宽体沙鳅精子激活过程中的作用机理还有待进一步的研究。