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文章信息
- 林慧彪, 李延鹏, 段继霞, 夏丰雨, 熊和菊, 王嘉宝, 杨晓燕, 肖文
- LIN Huibiao, LI Yanpeng, DUAN Jixia, XIA Fengyu, XIONG Heju, WANG Jiabao, YANG Xiaoyan, XIAO Wen
- 滇金丝猴肠道寄生线虫的生防捕食线虫真菌筛选
- Screening of Nematode-trapping Fungi for Biocontrol Intestinal Parasitic Nematode of Yunnan Snub-nosed Monkey
- 四川动物, 2016, 35(1): 31-37
- Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(1): 31-37
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20150200
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文章历史
- 收稿日期: 2015-06-03
- 接受日期: 2015-09-14
2. 大理大学东喜玛拉雅资源与环境研究所, 云南大理 671003
2. Institute of Eastern-Himalaya Biodiversity Research, Dali University, Dali, Yunnan Province 671003, China
滇金丝猴Rhinopithecus bieti又名黑白仰鼻猴,隶属于灵长目Primates猴科Cercopithecidae疣猴亚科Colobinae仰鼻猴属Rhinopithecus,是我国特有灵长类之一,分布于金沙江和澜沧江间云岭山脉的一 个狭小区域内(98°37′~99°41′E,26°14′~29°20′N),是目前发现栖息地最高的非人灵长类,我国Ⅰ级保护动物,世界自然保护联盟(International Union for the Conservation of Nature,IUCN)将之确立为濒危(EN)等级,数量稀少,极需保护(白寿昌等,1988;Long et al.,1994;龙勇诚等,1996;李学友等,2008)。
野生动物寄生虫感染情况不容乐观,特别是灵长类,各种群间都存在交叉感染状况(Huffman & Chapman,2009)。据李延鹏等(2014)报道,滇金丝猴体内受到毛首线虫Trichuris sp.、钩虫Ancylostoma sp.、 结节线虫Oesophagostomum sp.、蛔虫Ascaris sp.、肝毛细线虫Capillaria hepatica等多种线虫的感染,其健康受到严重威胁。目前,对动物寄生线虫病的防治主要依赖于化学药物,但由此产生的线虫耐药性问题及药物残留导致的环境污染问题也日渐受到人们的广泛关注(明安宇,1991;张宏伟等,2002;孙建华,姜中其,2004;蔡葵蒸,2007;郝成,2007;姜波等,2007;蒲文兵,2009)。因此,从自然界发掘寄生线虫的天敌逐渐成为国内外研究的热点(Duddington,1951;Rubner,1996;李天飞等,2000;张克勤,莫明和,2006),但目前还未见有关滇金丝猴寄生线虫生物防治的研究报道。
捕食线虫真菌是以菌丝特化形成黏性菌网(adhesive nets)、黏性分枝(adhesive branches)、无柄黏性球(sessile adhesive knobs)、有柄黏性球(stalked adhesive knobs)、非收缩环(non-constricting rings)、收缩环(constricting rings)等捕食器官捕杀线虫的一类菌物,是自然界中控制线虫数量的主要方法之一,因此是生物防治线虫的重要资源(Duddington,1951;Rubner,1996;李天飞等,2000;张克勤,莫明和,2006)。
尽管国内外对粪生捕食线虫真菌有一定的调查(Ghanfarolehi et al.,2004;苏鸿雁,2006;苏锡钧等,2014),但高原野生灵长类的粪生捕食线虫真菌资源却一直无人问津。本研究从滇金丝猴粪便中直接分离捕食线虫真菌,并通过自制可量化的设备测定来自不同生境的捕食线虫真菌的捕食率,以筛选滇金丝猴肠道寄生线虫的高效生防菌株。本实验结果对利用捕食线虫真菌生防滇金丝猴体内寄生线虫的研究具有重要应用价值,对其他动物寄生线虫的生防研究具有一定的指导意义。
1 材料与方法 1.1 捕食线虫真菌的分离鉴定 1.1.1 样品采集滇金丝猴新鲜粪便由大理大学东喜玛拉雅资源与环境研究所在云南省迪庆州维西县塔城滇金丝猴保护基地采集,共采集21份粪样,样品置于4 ℃冰箱保存,并在2周内完成撒样工作。
1.1.2 玉米琼脂培养基(CMA)的配制称取40 g新鲜玉米粉,加入1000 mL蒸馏水,微火煮沸30 min,补足水分至1000 mL,用纱布过滤后,取滤液10 mL,加990 mL蒸馏水,然后加入20 g琼脂粉,经121 ℃ 20 min高压灭菌后,倾注于直径为90 mm和60 mm的灭菌玻璃培养皿中备用。
1.1.3 诱饵线虫的制备采用贝尔曼氏法(Giuma & Cooke,1972)制备全齿复活线虫Panagrellus redivivus幼虫混悬液,每0.1 mL约含线虫500条,备用。
1.1.4 撒样培养采用诱饵平板法。用无菌牙签将采回的粪便和土样均匀地撒在CMA培养基上,撒样时样品之间要留有适当空隙,样品距培养皿边缘空1 cm左右以便于观察,且单孢分离时可减少污染,每个样品设3个重复。每个撒样平板中加入线虫2000~5000条做诱饵,室温培养30 d左右(李天飞等,2000)。
1.1.5 分离纯化在体视显微镜下对每个平板进行镜检,并用无菌牙签挑取单个被检出的捕食线虫真菌孢子,转接到CMA培养基中,置于25 ℃培养箱恒温培养6~7 d,得到目的菌的纯培养(李天飞等,2000)。
1.1.6 鉴定采用黏片法,用透明的塑料胶带黏取菌落,黏在滴有一滴吕氏美蓝染色液的载玻片上,加盖盖玻片,制成临时装片,显微镜(40×)下镜检,确定分生孢子和菌丝形态及分生孢子梗的类型,并测定100个分生孢子的大小和分隔数,分生孢子梗的顶宽、基宽和长度以及菌丝的宽度,计算出最小值、最大值和平均值。诱导捕食器官,在纯培养的CMA平板中央切除1 cm×1 cm的培养基作为捕食器官观察室,待菌丝铺满观察室后滴加诱饵线虫悬液(约200条线虫),置于25 ℃恒温培养箱培养24 h后,在体视显微镜下观察形成的各种捕食器官类型。对不易在CMA平板上产生捕食器官的菌株,转接至水琼脂培养基,于25 ℃恒温培养3 d后再接入诱饵线虫,待捕食器官生成后再观察捕食器官类型。结合菌株形态特征(李天飞等,2000)及捕食器官类型(Li et al.,2005)进行分类和鉴定。
1.1.7 数据处理检出率(occurrence frequency,OF)=某个种出现的土样数/总的土样数×100%。
1.2 标准模具设计与制作用于捕食率测定的标准模具的设计主要符合3点基本要求:可标准化测定捕食率;可用于高压蒸汽灭菌;可多次重复使用。基于以上3点,模具设计如下:以直径为66 mm,厚度为7 mm不锈钢圆盘为主体,在直径为62~56 mm处挖一个宽3 mm,深5 mm的环形凹槽,用于卡住60 mm的平板边缘,以达到准确定位的效果;在直径为35 mm的圆周上等距分布4个点,分别以这4个点为中心,以螺纹的形式打一个贯穿整个圆盘的直径为6 mm的圆孔,圆孔处拧上一根一端是渐细的圆台形的螺丝,用于培养基上标定4个等距的加入捕食线虫真菌分生孢子的位点(以下简称加孢位点),螺丝的高度是可以调节的,以保证在培养基上所留下记号的痕迹的深度一致;在直径为25 mm处嵌上一个外径为25 mm的不锈钢圆管,用于在培养基上切下一个直径为25 mm的观察室。该模具由兴化市银莱不锈钢制品有限公司制作。
1.3 捕食线虫真菌菌株来源除本次分离所得菌株外,其余待测菌株(9株)由大理大学农学与生物科学学院微生物实验室的菌种库提供,分别为Arthrobotrys属的A. oligospora(HA135-2和66-1)2株,A. conoides(67-1)1株,A. musiformis(ZB15-1)1株;Dactylellina属的Dac. gephyropaga(83-3)1株,Dac. drechsleri(84-1和317-1)2株;Drechslerella属的Dre. dactyloides(342-2和14-1)2株。
1.4 捕食线虫真菌菌株最适生长温度的测定将目的菌株在25 ℃下纯培养7 d,用已灭菌的内径6 mm、外径7 mm的标准不锈钢圆管将菌块切成等大的圆柱形,接种于60 mm的CMA平板中央,分别置于22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的恒温培养箱中恒温培养,每组设3个平行。每隔24 h测量一次菌落直径,5 d后统计数据。
1.5 捕食线虫真菌菌株捕食率的量化测定和比较 1.5.1 捕食率量化测定培养基的制备取直径60 mm,培养基厚度刚好是平板一半的CMA平板,在无菌操作下用已灭菌的标准模具在培养基中央切出直径为25 mm的圆形观察室,并标定4个加孢位点。
1.5.2 菌种的定量转接、培养及生长率测定在每个加孢位点依次加入3个分生孢子。然后将已接菌的平板分别置于各自的最适生长温度下恒温培养,每组设3个平行。每隔24 h测量一次菌落直径,直至相邻2个菌落相接触。
1.5.3 捕食器官的生成时间及捕食率测定将上述用于生长率测定的培养基继续培养至第15天后加50 μL线虫悬浮液(约150条线虫),再将已接菌的平板分别置于各自的最适生长温度下恒温培养。每隔5 h在体视显微镜下观察捕食器官生成情况并计数死活线虫量。连续观察至第5天。空白对照:在给实验平板加入线虫悬浮液的同时,在未接线虫的标准化CMA平板中央观察室加50 μL线虫悬浮液(约150条线虫),并与实验平板同时进行恒温培养和计数。
1.5.4 捕食率的计算公式R=X/(X+Y)× 100%-N,其中:R为捕食率;X为被捕获的虫体数;Y为自由活动的虫体数,N为空白对照的自然死亡率。
1.5.5 数据的处理与分析数据使用Excel 2013进行初步整理,SPSS 19.0软件进行统计分析。对各菌株的生长率、 加入线虫后至捕食器官生成时间、捕食率采用邓肯氏新复极差法进行差异性分析。对捕食器官的生成时间与捕食率的相关关系采用Pearson系数法进行相关性分析。显著性水平设为α=0.05。
2 结果 2.1 捕食线虫真菌资源调查结果本次调查共从21份滇金丝猴新鲜粪便样品中分离到2属6种共27株捕食线虫真菌,其中Arthrobotrys 4种,Dactylellina 2种,产黏性菌网的捕食线虫真菌占86.37%,为优势菌群(表 1)。
种名Species | 捕食器官Trapping devices | 检出率OF/% |
Arthrobotrys oligospora | AN | 33.33 |
A. musiformis | AN | 23.81 |
A. conoides | AN | 23.81 |
A. botryospora | AN | 9.52 |
Dactylellina gephyropaga | AB | 9.52 |
Dac. huisuniana | SK | 4.76 |
注Notes: AN. 黏性网adhesive nets, AB. 黏性分枝adhesive branches, SK. 有柄黏球stalked adhesive knobs; 表3同, the same as table 3. |
基于对滇金丝猴粪便中捕食线虫真菌的资源调查结果,本次滇金丝猴肠道寄生线虫的生防捕食线虫真菌筛选实验共选用了滇金丝猴粪生菌5株,其中Arthrobotrys属的A. oligospora(315-1)1株,A. musiformis(314-1)1株,A. conoides(316-1)1株,Dactylellina 属的Dac. gephyropaga(329-1,331-1)2株。加上1.3中9株菌,本实验共用14株菌。
2.2 标准模具的设计与制作结果标准模具成品如图 1。
2.3 生长率的测定结果生长率的测定结果显示各捕食线虫真菌菌株的最适生长温度为24 ℃~28 ℃;Arthrobotrys属捕食线虫真菌在最适温度下的生长率大于Dactylellina属和Drechslerella属的菌株(表 2)。
菌株编号 Strain number | 种名Species | 不同温度下生长率 The growth rate at different temperatures/(cm·d-1) | ||||
22 ℃ | 24 ℃ | 26 ℃ | 28 ℃ | 30 ℃ | ||
316-1 | Arthrobotrys conoides | 1.43±0.04d | 1.65±0.01b | 1.53±0.01c | 1.81±0.02a | 1.46±0.02cd |
67-1 | A. conoides | 0.83±0.02c | 0.87±0.03c | 1.09±0.05a | 1.11±0.02a | 0.97±0.05b |
314-1 | A. musiformis | 1.49±0.02e | 1.73±0.02b | 1.59±0.01d | 1.87±0.03a | 1.77±0.04b |
ZB15-1 | A. musiformis | 0.83±0.03d | 0.89±0.03c | 1.05±0.03a | 1.09±0.03a | 0.97±0.03b |
315-1 | A. oligospora | 1.58±0.04a | 1.63±0.01a | 1.65±0.05a | 1.42±0.06b | 0.47±0.04c |
HA135-2 | A. oligospora | 0.63±0.03d | 0.78±0.02b | 0.89±0.03a | 0.69±0.02c | 0.48±0.02e |
66-1 | A. oligospora | 0.79±0.02d | 0.91±0.04c | 1.05±0.04a | 1.09±0.01a | 0.97±0.03b |
331-1 | Dactylellina gephyropaga | 0.60±0.02c | 0.79±0.03a | 0.80±0.01a | 0.67±0.03b | 0.50±0.02d |
329-1 | Dac. gephyropaga | 0.77±0.01b | 0.77±0.01b | 0.87±0.03a | 0.71±0.04c | 0.50±0.02d |
83-3 | Dac. gephyropaga | 0.77±0.01c | 0.88±0.02b | 0.93±0.03a | 0.84±0.03b | 0.77±0.03c |
84-1 | Dac. drechsleri | 0.53±0.03d | 0.53±0.03cd | 0.67±0.03a | 0.56±0.02bc | 0.49±0.03d |
317-1 | Dac. drechsleri | 0.57±0.01c | 0.60±0.01b | 0.79±0.01a | 0.59±0.01bc | 0.40±0.02d |
342-2 | Drechslerella dactyloides | 0.21±0.01d | 0.23±0.01d | 0.31±0.01b | 0.34±0.02a | 0.27±0.01c |
14-1 | Dre. dactyloides | 0.42±0.02c | 0.48±0.02b | 0.59±0.03a | 0.48±0.01b | 0.38±0.02d |
注: 同列上标的不同字母代表差异有统计学意义, 下表同。 Notes: Different superscripts in the same row indicate there is a significant difference, the same below. |
应用标准模具对来自不同生境、产不同捕食器官的捕食线虫真菌的捕食率进行测定后发现:来自滇金丝猴粪便、产黏性菌网的捕食线虫真菌(316-1、314-1和314-1)的捕食率明显低于产黏性分枝(331-1和329-1)的捕食线虫真菌,其中Dac. gephyropaga(331-1)的捕食率(81.10%±3.24%)较高,仅次于分离自大理洱海的Dre. dactyloides(342-2);同种捕食线虫真菌菌株的捕食率存在生境差异;同种异株间,生长率较高的菌株捕食率相对较低,反之亦然;除317-1,83-3和14-1外,其余菌株在观测时间内都未产生捕食器官。仅从捕食器官类型来看,捕食率较高的捕食器官为收缩环、黏性分枝和有柄黏性球,黏性菌网的捕食率整体偏低(表 3)。
菌株编号 Strain number | 种名Species | 捕食器官 Trapping devices | 捕食器官的生成时间 The time of trapping devices formation/h | 生长率 Growth rate/(cm·d-1) | 100 h捕食率 The trapping efficacy within 100 h/% |
316-1* | Arthrobotrys conoides | AN | 46.67±3.17fg | 1.53±0.01c | 47.16±3.11c |
67-3 | A. conoides | AN | 35.00±0.00def | 1.09±0.05d | 36.74±2.08d |
314-1* | A. musiformis | AN | 45.00±3.47fg | 1.59±0.01b | 28.08±2.01def |
ZB15-1 | A. musiformis | AN | 33.33±1.67cde | 1.05±0.03d | 34.11±1.98de |
315-1* | A. oligospora | AN | 38.33±3.47efg | 1.65±0.05a | 35.18±0.45de |
HA135-2 | A. oligospora | AN | 30.00±0.00bcde | 0.89±0.03ef | 31.67±2.34def |
66-1 | A. oligospora | AN | 26.67±2.34abcd | 1.05±0.04d | 51.89±2.06bc |
331-1* | Dactylellina gephyropaga | AB | 23.33±2.88abc | 0.81±0.01g | 81.10±3.24a |
329-1* | Dac. gephyropaga | AB | 30.00±0.00bcde | 0.87±0.03f | 60.08±2.41b |
83-3 | Dac. gephyropaga | AB | — | 0.93±0.03e | 24.72±1.17f |
84-1 | Dac. drechsleri | SK | 21.67±1.45ab | 0.67±0.03h | 76.17±3.33a |
317-1 | Dac. drechsleri | SK | — | 0.79±0.01g | 27.16±2.10ef |
342-2 | Drechslerella dactyloides | CR | — | 0.31±0.01j | 81.33±2.48a |
14-1 | Dre. dactyloides | CR | 16.67±1.45a | 0.59±0.03i | 15.22±2.01g |
注: CR. 收缩环, * 粪生菌, — 表示观测时间内菌株未产生捕食器官。 Notes: CR. constricting rings, * fecal fungi, — within the observation time, no trapping devices generate. |
加入线虫至捕食器官生成的时间与捕食率的相关关系如图 2所示,二者的Pearson相关系数r=-0.772(P=0.005),呈明显的负相关关系。捕食器官的生成时间越短,菌株捕食率越高,反之亦然。83-3、317-1、14-1在观测时间内未产生捕食器官,这3株菌株的捕食率明显低于其他菌株。
3 分析与讨论 3.1 捕食器官类型与捕食率的相关关系关于捕食器官的演化过程与捕食效力强弱之间的关系,研究学者们的观点一直存在分歧。李天飞等(2000)认为黏性菌网捕食效力低,是一种较其他黏性捕食器官原始的捕器类型。Li等(2005)应用 分子系统发育学研究后提出:黏性球是最早形成的捕食器官,由此分两支分别演化为收缩环和黏性菌网,黏性菌网被认为是进化地位和捕食效力较强的捕食器官,而Yang等(2007)却认为黏性网是一种比较古老的捕器类型。Yang等(2012)则认为捕食线虫真菌的总体进化趋势是增加黏性面积和延长黏性结构以提高捕食效力。这些研究都将捕食效力强弱作为判定不同捕食器官进化地位高低的主要依据之一,但对有关不同捕食器官的捕食效力强弱的研究却一直没有实现可量化的测定。本研究通过标准模具定量比较来自不同生境、产不同捕食器官的捕食线真菌的捕食率,发现仅从捕食器官类型来看,捕食率较高的捕食器官为收缩环、黏性分枝和黏性球,黏性菌网的捕食率整体偏低,而来自不同生境或相同生境的同种异株捕食线虫真菌的捕食率均存在较明显的菌株差异,再结合生长速度与捕食关系的研究结果分析,我们认为捕食器官的捕食能力强弱与捕食线虫真菌的腐生能力有关,因此把捕食器官的捕食效力作为判断捕食线虫真菌演化地位的依据的科学性还有待更加系统的研究。
3.2 捕食器官的生成时间与捕食率的相关关系捕食线虫真菌的捕食率与加入线虫后其产生捕食器官的时间呈明显的负相关关系(Pearson相关系数r=-0.772,P=0.005)。收缩环、黏性球及黏性分枝类产生菌产生捕食器官的时间明显早于黏性菌网产生菌,且捕食率均显著高于后者。其原因可能是因为捕食线虫真菌所产生的捕食器官能够增强真菌捕杀线虫的主动性及杀伤力,因此,如果采取相应措施加快捕食线虫真菌捕食器官生成速度,可显著提高捕食线虫真菌的捕食率。有研究发现:某些多肽类物质可诱导A. oligospora捕食器官的形成(Nordbring-Hertz,1973);不同生长期的秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans对捕食线虫真菌捕食器官的诱导效果存在显著性差异(刘珅坤,2008);一些细菌的发酵产物可加快捕食线虫真菌捕食器官的形成(马名川,2012);用低能氮离子束可使A. oligospora 对线虫的捕食率等方面产生正突变(王军等,2012)。因此,在捕食线虫 真菌生防菌株的构建中,可以将环境适应能力强的菌株进行定向改造,提高捕食器官的生成速度,则可获得较为优秀的生防菌株。
3.3 捕食线虫真菌生防滇金丝猴肠道寄生线虫的展望目前,国内外共报道捕食线虫真菌近100种(Zhang et al.,2014)。利用捕食线虫真菌对寄生线虫进行生物防治的研究始于1938年,Linford和Yap(1938)首次将捕食线虫真菌作为制剂放入土壤中防治线虫,从此拉开了用生防菌剂防治线虫的序幕。对动物寄生线虫的生物防治研究也取得了一定进展,如:Larsen等(1995),Grønvold等(1996)和杨晓野等(2005)的研究显示,给放牧羊、牛、马等家畜服用捕食线虫真菌后,多种寄生线虫的感染强度下降,牧场中感染性幼虫数量显著降低,从而使放牧家畜的胃肠道寄生虫数量和粪便中虫卵数量减少,脏器病变减轻,体质量明显增加,达到了生防线虫的目的;Fernández等(1999)和Sarkunas等(2000)研究了真菌水平对减少幼虫数量有无差异的实验,结果表明:孢子量的多少与感染性幼虫数量的增减有关;Waller等(2001a,2001b)已能利用捕食线虫真菌的孢子制成片剂,羊群服用后,其寄生线虫感染率显著降低。
野生动物种类多,活动范围广,交叉感染寄生虫的概率比较高,野生动物寄生虫感染情况不容乐观,特别是灵长类,各种群间都存在交叉感染(王根红等,2002;蔡娟等,2009;Huffman & Chapman,2009;明珠,2010;李延鹏等,2014)。因此,寄生虫病严重危害着野生动物的健康,更威胁濒危动物的生存,是濒危动物保护工作中亟待解决的一大难题。采用化学药物防治寄生线虫存在的问题已经被广泛认识。因此,生物防治寄生线虫的研究也就逐渐成为研究热点,但针对野生动物寄生线虫的生物防治研究却一直未被相关学者关注。从自然界中筛选适合野生动物寄生线虫病防治的高效生防菌株,是研发生防菌剂的重要工作基础。
本次调查从21份滇金丝猴粪便中分离到Arthrobotrys属和Dactylellina属共27株捕食线虫真菌。通过定量比较,发现分布其中的产黏性分枝的331-1和329-1捕食率均较高,其中331-1(Dac. gephyropaga)的捕食率(81.10%)仅稍低于分离自大理洱海的342-2(Dre. dactyloides),说明滇金丝猴肠道中存在丰富的捕食线虫真菌资源和捕食效力较强的捕食线虫真菌菌株,捕食线虫真菌能够适应滇金丝猴肠道环境。结合已有的利用捕食线虫真菌孢子制成菌剂并有效防治牛、羊肠道寄生线虫的成功案例(Waller et al.,2001a,2001b),从滇金丝猴粪便中直接筛选捕食效力较强的生防菌株用于滇金丝猴肠道寄生线虫的生物防治是确实可行的。开展滇金丝猴肠道寄生线虫的生物防治研究不仅对滇金丝猴保护意义重大,同时可为其他野生动物寄生线虫进行生物防治提供参考。
由于本研究还未对其他生境来源菌株进行滇金丝猴肠道环境适应能力测试,因此尚不确定非滇金丝猴肠道生境菌株是否能够用于滇金丝猴肠道寄生线虫的防治,我们将对此进行更加系统的研究。
白寿昌, 邹淑荃, 林苏, 等. 1988. 滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)的数量分布及食性调查[J]. 动物学研究, S1: 67-75. |
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姜波, 杨光友, 邓家波. 2007. 动物线虫抗药机制研究进展[J]. 安徽农业科学, 29: 9255-9260. |
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