四川动物  2015, Vol. Issue 34(6): 880-884

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张婷, 史晋绒, 赵田田, 宋柯, 解崇友, 岳兴建
ZHANG Ting, SHI Jinrong, ZHAO Tiantian, SONG Ke, XIE Chongyou, YUE Xingjian
四种鱼的血清、体表黏液SDS-PAGE分析
Analysis of SDS-PAGE on Serum and Surface Mucus from Four Fishes
四川动物, 2015,34(6): 880-884
Sichuan Journal of Zoology, 2015,34(6): 880-884
10.11984/j.issn.1000-7083.20140482

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收稿日期: 2014-10-29
接受日期: 2015-06-28
四种鱼的血清、体表黏液SDS-PAGE分析
张婷, 史晋绒, 赵田田, 宋柯, 解崇友, 岳兴建     
内江师范学院生命科学学院, 长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室, 四川内江641112
摘要: 鱼类的血清和体表黏液在其适应复杂水体环境的生理生化反应中起着重要的作用。为了解鱼类血清和体表黏液的蛋白组分与含量的差异,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对体表黏液丰富的宽体沙鳅Sinibotia reevesae、中华沙鳅S. superciliars、长薄鳅Leptobotia elongata及南方鲇Silurus meridionalis四种鱼的血清与体表黏液的蛋白组分展开研究,共获得158条蛋白区带,其中血清67条,体表黏液122条,其分子量在10.92~194.48 kD之间。聚类分析显示宽体沙鳅血清蛋白与中华沙鳅的相似度最高(0.67),与南方鲇的相似度最低(0.40)。四种鱼的血清蛋白组分的差异体现了其在进化上的亲缘关系。而体表黏液蛋白组分中中华沙鳅与南方鲇的相似度最高(0.53),与长薄鳅的最低(0.47),未呈现出与血清类似的遗传分化规律。
关键词: 血清     体表黏液     SDS-PAGE     蛋白组分    
Analysis of SDS-PAGE on Serum and Surface Mucus from Four Fishes
ZHANG Ting, SHI Jinrong, ZHAO Tiantian, SONG Ke, XIE Chongyou, YUE Xingjian     
Key Laboratory of Sichuan Province for Fishes Conservation and Utilization in the Upper Reaches of the Yangtze River, College of Life Sciences, Neijiang Normal University, Neijiang, Sichuan Province 641112, China
Abstract: The serum and surface mucus play an important role during the adaption of fishes into the complex environment of the water. To investigate the difference of protein components between fish serum and surface mucus, the serum and surface mucus of Sinibotia reevesae, S. superciliaris, Leptobotia elongate and Silurus meridionalis were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE). A total of 158 protein zones from four fishes including 67 serum slimes and 122 surface mucus slimes were obtained. The molecular weight of these proteins ranged from 10.92 kD to 194.48 kD. The homology of serum protein between S. reevesae and S. superciliaris was higher than that between S. reevesae and Si. meridionalis as determined by cluster analysis. The protein profiles were accordant to the phylogenetic relationships among four fishes. The similarity of surface mucus protein among the 4 fishes ranged from 0.53 (between S. superciliaris and Si. meridionalis) to 0.47 (between S. superciliaris and L. elongate), and this was inconsistent with their phylogenetic relationships.
Key words: serum     surface mucus     SDS-PAGE     protein components    

鱼类生活在水体环境中,有着复杂的生理生化反应,血清和体表黏液对于鱼类适应变化的环境有着重要的意义。血清能维持渗透压、缓冲pH值、载体营养等,且其中含有大量免疫球蛋白Ig(欧铜等,2012)。体表黏液是水生动物与外界交流的平台,有防止机械损伤、调节渗透压、抵御外界病原微生物等作用(Shephard,1994AranishiAranishi & Nakane,1997)。同种鱼类的血清与体表黏液含有部分相同的蛋白组分,并可能具有相同的生理生化功能(陈昌福等,1995)。对欧洲鳗鲡Anguilla japonica的研究表明,其体表黏液中含有大量不同于血清的蛋白质,但缺乏对不同水生动物血清与体表黏液蛋白组成与含量之间差异的认识(黄智慧等,2009)。因此对鱼类血清和体表黏液蛋白组分异同的了解,有助于更好地掌握鱼类的生理活动机制,从而认识它们在水体环境中的适应机制。

长江上游特有鱼类宽体沙鳅Sinibotia reevesae、中华沙鳅S. superciliaris、长薄鳅Leptobotia elongata以及南方鲇Silurus meridionalis经济价值高,广受青睐。宽体沙鳅和中华沙鳅体表黏液丰富,俗称“玄鱼”,目前研究主要集中在基本生物特征方面(黄燕等,2011王芳等,2011岳兴建等,2011)。长薄鳅俗称花鳅、花鱼等,具有较高的观赏价值。南方鲇是长江中上游重要经济鱼类,个体大、生长快、易繁殖、抗病力强,其相关研究较为深入。这4种鱼均具有丰富的体表黏液,但相关报道缺乏。本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和聚类分析(cluster analysis)对这4种鱼的血清和体表黏液的蛋白组分进行分析,检测血清和体表黏液蛋白,探究其组分差异与生理功能间的关系,为了解这些鱼类在水体环境中的适应机制、免疫机制和疾病预防提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

宽体沙鳅、中华沙鳅和长薄鳅试验用鱼于2013年4—11月采自长江上游支流沱江内江段,南方鲇购自水产市场。实验室暂养10~15 d,挑选生长状况良好、体格健壮的3种鳅各10尾,宽体沙鳅体质量6.50~13.00 g,体长70.00~120.00 mm,中华沙鳅体质量6.10~12.30 g,体长80.00~129.00 mm,长薄鳅体质量34.60~35.50 g,体长154.00~ 159.00 mm。南方鲇3尾,体质量4300.00~7500.00 g,体长720.00~885.00 mm。试验前饥饿处理1~2 d,尽量避免采集体表黏液时产生代谢物污染样品。

1.2 体表黏液蛋白样品的制备

参考吕爱军等(2008)的方法略作改变。用双蒸水将试验用鱼表面清洗2~3次,放入大小适宜的培养皿中,再倒入10 mL 4 ℃双蒸水静置8~10 min。用消毒玻片从鱼的吻端沿体侧轻轻地向尾部刮取黏液,来回刮取3次。每隔半小时重复上述步骤,共刮取鱼体表黏液3次,收集到的黏液放入50 mL离心管中,置于-20 ℃冻结,冷冻干燥机冷冻干燥,得到体表黏液蛋白,-20 ℃保存。

1.3 血清蛋白样品的制备

鳅科鱼类采取断尾取血(华文青,1998)的方式采集血液,南方鲇采用心脏抽血的方式采集血液。将血液轻轻地注入1.5 mL离心管中,室温下静置30 min,-4 ℃过夜,3000 r/min、4 ℃离心10 min,上清液于-20 ℃保存备用。

1.4 蛋白浓度测定、SDS-PAGE与数据分析

使用牛血清蛋白母液(10 mg·mL-1)制作标准曲线(Bradford,1976),用以获得蛋白浓度计算公式。蛋白质条带分离采用Laemmli不连续系统电泳法(欧铜等,2012)。根据对蛋白组分区带分离清晰度的要求,采用浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度分别为8%、10%、12%的聚丙烯酰胺凝胶分离血清和体表黏液蛋白,并分别统计分子量范围为45.00~116.00 kD、25.00~45.00 kD和14.40~25.00 kD的蛋白组分。用双蒸水将血清和体表黏液总蛋白浓度稀释至相近浓度,取稀释血清或体表黏液样品等量上样。各样品蛋白以3∶ 1的比例与5×上样缓冲液混合,瞬时离心,沸水浴变性5~6 min,5 μL maker蛋白沸水浴10 min,瞬时离心,分别取样品上清20 μL和maker 5 μL滴入样品孔。浓缩胶80 V电压电泳1~2 h,分离胶120 V电泳6~7 h,待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时,停止电泳,采用硝酸银染色的方式染胶。所得图谱带用GEL DocX+软件和Quantity one软件分别对条带进行分析,计算每个蛋白组分的分子量。重复3次读数,取其平均值。根据4种鱼血清或者体表黏液条带的有无,编制0-1数字矩阵,利用NTsys 2.10软件分别对4种鱼的血清及体表黏液蛋白组分进行聚类分析(陈军辉等,2006)。

2 结果 2.1 血清与体表黏液总蛋白含量

根据牛血清白蛋白的浓度和吸光值绘制标准曲线,其标准曲线方程为:Y=0.7608X+0.1144(R2=0.9820)。测得4种鱼血清和体表黏液样品的平均吸光值和总蛋白浓度,宽体沙鳅、中华沙鳅、长薄鳅及南方鲇的血清总蛋白含量分别为 0.107 mg·mL-1、0.093 mg·mL-1、0.115 mg·mL-1和0.166 mg·mL-1(±0.005 mg·mL-1),体表黏液溶液总蛋白分泌量分别为0.031 mg·mL-1、 0.011 mg·mL-1、0.011 mg·mL-1和0.061 mg·mL-1(±0.005 mg·mL-1),其单位质量蛋白浓度分别 为3.1633 mg·(mL·kg)-1、1.1957 mg·(mL·kg)-1、0.3134 mg·(mL·kg)-1和0.0103 mg·(mL·kg)-1,平均为1.1707 mg·(mL·kg)-1。 鳅科鱼类体表黏液分泌量高于南方鲇,其中宽体沙鳅分泌量最大(表 1)。

表 1 四种鱼血清与体表黏液蛋白含量测定 Table 1 The concentration of serum protein and mucus protein of the four fishes
种Species 生物学参数Biological parameter 血清蛋白样品Serum protein 体表黏液蛋白样品 Surface mucus protein
平均体质量Weight/g 平均体长Body length/mm 平均吸光值Average absorbance 蛋白浓度Protein concentration 平均吸光值Average absorbance 蛋白浓度Protein concentration/(mg·mL -1) 分泌量 Production/
宽体沙鳅 Sinibotiareevesae 9.80 95.00 0.196 0.107 0.138 0.031 3.1633
中华沙鳅 S. superciliaris 9.20 104.50 0.185 0.093 0.122 0.011 1.1957
长薄鳅 Leptobotiaelongata 35.10 156.50 0.202 0.115 0.122 0.011 0.3134
南方鲇 Silurus meridionalis 5900.00 802.50 0.241 0.166 0.160 0.061 0.0103
2.2 种内血清与体表黏液蛋白组分比较

4种鱼的血清和体表黏液蛋白组分,在分子量14.80~114.00 kD之间,共得到158条蛋白区带,其中血清蛋白67条,体表黏液蛋白122条。宽体沙鳅血清27条,体表黏液39条;中华沙鳅血清14条,体表黏液41条;长薄鳅血清21条,体表黏液50条;南方鲇血清36条,体表黏液37条。各种鱼的血清蛋白组分均少于体表黏液蛋白。宽体沙鳅血清与体表黏液共有的蛋白组分有5种,其分子量分别为: 100.00 kD、68.00 kD、56.00 kD、32.80 kD、31.50 kD; 中华沙鳅4种,分子量分别为:103.10 kD、 99.50 kD、63.50 kD、54.20 kD;长薄鳅5种,分子量分别为:67.20 kD、52.00 kD、47.50 kD、41.00 kD、35.00 kD;南方鲇8种,分子量分别为:59.90 kD、58.80 kD、56.00 kD、51.10 kD、50.50 kD、41.00 kD、38.90 kD、29.40 kD(图 1: A~L)。

图 1 宽体沙鳅、中华沙鳅、长薄鳅和南方鲇血清和体表黏液蛋白SDS-PAGE图谱 Fig. 1 Serum and surface mucus proteins’ SDS-PAGE profile of Sinibotia reevesae, S. superciliaris, Leptobotia elongata and Silurus meridionalis A、D、G. 8%分离胶, B、E、I. 10%分离胶, C、F、L. 12%分离胶; M. maker, 1. 宽体沙鳅黏液, 2. 中华沙鳅黏液, 3. 宽体沙鳅血清, 4. 中华沙鳅血清, 5. 长薄鳅血清, 6. 南方鲇血清, 7. 长薄鳅黏液, 8. 南方鲇黏液。
A,D,G. 8% separating gel, B,E,I. 10% separating gel, C,F,L. 12% separating gel; M. maker, 1. surface mucus of S. reevesae, 2. surface mucus of S. superciliaris, 3. serum of S. reevesae, 4. serum of S. superciliaris, 5. serum of L. elongata, 6. serum of Si. meridionalis, 7. surface mucus of L. elongata, 8. surface mucus of Si. meridionalis.
2.3 种间血清、体表黏液蛋白组分比较

聚类分析结果显示,宽体沙鳅与中华沙鳅的血清蛋白组分相似度最大(0.67),与长薄鳅的相似度略低(0.56),与南方鲇的相似度最低(0.40)(图 2)。而体表黏液蛋白组分比较结果显示,中华沙鳅与南方鲇的相似度最大(0.53),与宽体沙鳅的略低(0.52),与长薄鳅的最小(0.47)(图 3)。

图 2 四种鱼血清蛋白组分聚类分析 Fig. 2 Cluster analysis on the four fishes serum protein component
图 3 四种鱼体表黏液蛋白组分聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis on the four fishes surface mucus protein component
3 讨论

同种鱼类的血清和体表黏液蛋白种类上表现出差异,其中血清蛋白种类较少,体表黏液蛋白成分复杂。在本研究中,宽体沙鳅与中华沙鳅同属鲤形目Cypriniformes鳅科Cobitidea沙鳅属,亲缘关系最近,与长薄鳅同属鲤形目鳅科,而与鲇形目Siluriformes鲇科Siluridae鲇属的南方鲇亲缘关系最远。4种鱼的血清蛋白组分种类聚类分析的结果正好与此关系相一致:宽体沙鳅与中华沙鳅的血清蛋白组分相似度最大,为0.67,与长薄鳅的相似度略低,为0.56,与南方鲇的相似度最低,只有0.40,此结果符合系统进化规律,说明了分类上不同种属动物的血清蛋白分子量的相似度越高,则亲缘性越近,其血清蛋白组分的相似度也越大(王宗仁,贾凤兰,1988)。但4种鱼的体表黏液蛋白组分种类聚类分析结果显示,其蛋白组分差异与鱼类进化上的亲缘关系不一致:中华沙鳅与南方鲇的相似度最大,为0.53,与宽体沙鳅的略低,为0.52,与长薄鳅的最小,为0.47。这可能是由于鱼类血清存在于稳定的内环境中,功能明确(欧铜等,2012),其蛋白差异与进化水平一致;而体表黏液分布于体表,成分复杂,功能多样(Ross et al.,2000Fagan,2003),其分泌蛋白差异不仅来源于物种的固有遗传差异,可能还受外界环境影响。由此,分析动物血清蛋白组分差异可以大致了解不同种属动物之间的亲缘关系,但不能用体表黏液的蛋白组分差异来分析不同鱼类系统分类关系。

鱼类血清中含多种蛋白组分,其中有较多的免疫球蛋白,目前已从硬骨鱼类中分离出不同种类的免疫球蛋白,如IgM、IgD和IgZ及红鳍东方鲀Takifugu rubripes中新发现的IgH等类型。IgM是一类存在于所有有颌类脊椎动物中的免疫球蛋白(丁炜东等,2010)。鱼类的体表黏液中也含有免疫球蛋白,且参与鱼类体表黏液免疫的是IgM(杨桂文,安利国,1999徐国晶等,2011)。血清蛋白,特别是体表黏液蛋白可能与鱼类适应不同水体环境直接相关。本研究通过电泳获得了4种鱼67条血清蛋白条带,122条体表黏液蛋白条带,为进一步分离纯化、研究它们的生理功能,探讨这4种鱼类血清和体表黏液蛋白在其环境适应中的生理作用提供了有意义的数据。

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