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文章信息
- 王双, 臧志和, 彭延娟
- WANG Shuang, ZANG Zhihe, PENG Yanjuan
- 白芍水提物的抗炎作用及作用机制研究
- The Anti-inflammatory Effect and Mechanisms of the Water Extract of White Peony Root
- 四川动物, 2015, 34(5): 748-751
- Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(5): 748-751
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20140525
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文章历史
- 收稿日期:2014-11-21
- 接受日期:2015-04-08
白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora的干燥根,性微寒、味微苦,归肝、脾经,具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗的功效。白芍是常用的传统中药,主产于四川、浙江、安徽等地,也是四川的道地药材之一。现代研究表明,白芍有保肝、镇痛、镇静、抗炎、改善心功能、抗病原微生物、抗凝、抗血栓、调节平滑肌运动和降温等作用(万德光等,2005)。
近年来研究白芍的抗炎作用取得了一定的进展,其中大多数关注于白芍总苷,而对白芍总苷以外的其他化学成分研究较少,它们可能以不同途径在抗炎中发挥作用(沈晓东,黄黛瑛,2009)。考虑到传统中药均采用水煎煮的方法,水溶性成分更能代表其传统作用成分。本研究采用炎症模型来评价白芍水提物的抗炎作用和作用机制,并与白芍总苷的抗炎作用进行比较,为白芍的进一步研究开发和应用提供基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物昆明种小鼠,全雄,体质量(20±2)g,SD大鼠,全雄,体质量(200±20)g,均由成都中医药大学实验动物研究中心提供,生产许可证号:SCXK(川)2008-11,检疫后备用。
1.1.2 实验药物白芍购自成都杏林大药房,经成都医学院鉴定教研室鉴定为正品。取白芍100 g,10倍水加热回流3次,每次1 h,过滤,合并滤液,浓缩成浸膏,4 ℃冰箱储存备用。取白芍500 g,参考刘陶世等(2007)的方法提取白芍总苷,得到白芍总苷22 g,即1 g白芍总苷相当于原生药23 g。
醋酸地塞米松:阳性对照,浙江仙琚制药股份有限公司生产。批准文号:国药准字H33020822,生产批号110733,规格0.75 mg/片。实验时用蒸馏水配制成0.1 mg·mL-1的药液,4 ℃冰箱储存备用。
1.1.3 实验仪器TD25-WS多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、分光光度计UV1100(上海天美科学仪器有限公司)、电子天平PA2003(上海天平仪器厂)、水浴锅、打孔器等。
1.1.4 实验试剂前列腺素E2(Dinoprostone,ProstinE,PGE2)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒,均由南京建成生物工程研究所提供。二甲苯、琼脂均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂生产。琼脂实验时用蒸馏水分别配制成2%的药液备用。其余试剂均为分析纯。
1.2 方法1.2.1 白芍水提物对二甲苯致小鼠耳片肿胀模型的影响昆明种全雄小鼠60只,随机分为6组,模型组、地塞米松组(1 mg·kg-1)、白芍总苷组(180 mg·kg-1)和白芍水提物高剂量组(4 g·kg-1)、中剂量组(2 g·kg-1)、低剂量组(1 g·kg-1),每组10只。每组动物以0.01 mL·g-1连续灌胃给药3 d,每天1次,模型组动物灌胃等体积生理盐水。末次给药30 min后,每只小鼠右耳廓滴注0.02 mL二甲苯,造模30 min后脱颈椎处死小鼠,沿耳廓基线剪下两耳,用直径6 mm打孔器分别在左右耳同一部位打下耳片,电子天平称重,两耳片质量的差值即为耳肿胀度。
1.2.2 白芍水提物对琼脂致小鼠肉芽肿模型的影响昆明种全雄小鼠60只,随机分为6组,模型组、地塞米松组(1 mg·kg-1)、白芍总苷组(180 mg·kg-1)和白芍水提物高剂量组(4 g·kg-1)、中剂量组(2 g·kg-1)、低剂量组(1 g·kg-1),每组10只。小鼠背中线皮下注射2%琼脂0.2 mL/只造模,造模次日开始灌胃给药0.01 mL·g-1,每天1次,连续7 d,模型组灌胃等体积生理盐水。末次给药1 h后脱颈椎处死小鼠,剥离琼脂肉芽肿块,并称湿重。
1.2.3 白芍水提物对琼脂致小鼠肉芽肿模型血清PGE2含量的影响1.2.2 中,末次灌胃给药1 h后断头处死小鼠取血,以3000 r·min-1离心15 min,取离心后的上清液0.3 mL,加入0.5 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液2 mL,50 ℃水浴20 min,再加入甲醇5 mL混匀后,用分光光度计在278 nm处测定其吸光度(A)值。以每克炎性组织的吸光度表示组织中的PGE2含量(邓琪等,2011)。
1.2.4 白芍水提物对蛋清致大鼠足跖肿胀模型的影响SD全雄大鼠60 只,随机分为6组,模型组、地塞米松组(1 mg·kg-1)、白芍总苷组(120 mg·kg-1)和白芍水提物高剂量组(2.8 g·kg-1)、中剂量组(1.4 g·kg-1)、低剂量组(0.7 g·kg-1),每组10只。每组动物按0.01 mL·g-1连续灌胃给药7 d,模型组灌胃等体积生理盐水。第7天先测定所有大鼠右后足容积,作为造模前的正常值。给药1 h后,于大鼠右后足跖皮下注射新鲜蛋清液0.05 mL致炎,测定造模后0.5 h、1 h、2 h、4 h和6 h大鼠右后足容积,以肿胀度作为检测指标。肿胀度=致炎后右足容积-致炎前右足容积。
1.2.5 白芍水提物对蛋清致大鼠足跖肿胀模型肿胀足PGE2、NO和MDA的影响1.2.4 中,测量完大鼠右后足容积后,脱颈椎处死大鼠,自踝关节处剪下右后肢,称重,剪碎皮肤和组织后,放入5 mL生理盐水中浸泡并不停地振摇,2 h后弃足,将浸泡液以3000 r·min-1离心15 min,分别取上清液测定NO、MDA含量,具体方法参照试剂盒说明书。
上清液PGE2含量测定方法同1.2.2,用分光光度计测定其吸光度(A)值,以每克炎性组织的吸光度表示组织中的PGE2含量。
1.2.6 统计学处理实验数据采用SPSS 16.0进行单因素方差分析,结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。
2 结果2.1 白芍水提物对二甲苯致小鼠耳片肿胀模型的影响模型组小鼠造模后30 min耳廓肿胀明显。白芍水提物高、中剂量组和白芍总苷组小鼠耳片肿胀均明显减轻,与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与白芍总苷组比较,白芍水提物高、中、低剂量组对小鼠耳片肿胀的影响差异均无统计学意义(P>0.05)(表 1)。
组别 | 剂量/(g·kg -1) | 耳肿胀度/mg |
模型组 | — | 17.67±5.68 |
阳性组 | 0.001 | 3.95±3.42 ** |
白芍总苷组 | 0.180 | 7.31±2.81 * |
白芍水提物高剂量组 | 4.000 | 10.93±4.97 * |
白芍水提物中剂量组 | 2.000 | 10.93±6.85 * |
白芍水提物低剂量组 | 1.000 | 14.90±5.40 |
注: 与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01; 下同。 Note: compared with model group, *P<0.05, **P<0.01; the same below. |
模型组小鼠肉芽增生明显,白芍水提物各剂量组和白芍总苷组的小鼠肉芽湿重均减轻。其中,白芍水提物高剂量组、白芍总苷组与模型组差异均有统计学意义(P<0.05)。白芍总苷组与白芍水提物高、中、低剂量组比较,对小鼠琼脂肉芽肿的影响差异均无统计学意义(P>0.05)(表 2)。
组别 | 剂量/(g·kg -1) | 肉芽肿湿重/g |
模型组 | — | 0.311±0.045 |
阳性组 | 0.001 | 0.220±0.072 * |
白芍总苷组 | 0.180 | 0.211±0.087 * |
白芍水提物高剂量组 | 4.000 | 0.242±0.030 * |
白芍水提物中剂量组 | 2.000 | 0.274±0.078 |
白芍水提物低剂量组 | 1.000 | 0.263±0.082 |
模型组小鼠血清PGE2水平升高,白芍水提物各剂量组和白芍总苷组的血清PGE2含量均降低。其中,白芍水提物高剂量组、白芍总苷组与模型组差异均有统计学意义(P<0.05)。白芍总苷组与白芍水提物高、中、低剂量组比较,对小鼠血清PGE2水平的影响差异均无统计学意义(P>0.05)(表 3)。
组别 | 剂量/(g·kg -1) | PGE 2(A值) |
模型组 | — | 0.381±0.170 |
阳性组 | 0.001 | 0.262±0.071 |
白芍总苷组 | 0.180 | 0.233±0.078 * |
白芍水提物高剂量组 | 4.000 | 0.213±0.070 * |
白芍水提物中剂量组 | 2.000 | 0.270±0.102 |
白芍水提物低剂量组 | 1.000 | 0.330±0.143 |
模型组大鼠右足跖注射蛋清后很快肿胀,注射后1 h肿胀达到高峰,注射后6 h肿胀仍然明显。在注射蛋清1 h、2 h、4 h、6 h后,白芍水提物各剂量组和白芍总苷组的大鼠足跖肿胀均减轻。其中,在注射蛋清1 h、2 h、4 h后,白芍水提物高剂量组、白芍总苷组与模型组差异均有统计学意义(P<0.05)。白芍总苷组与白芍水提物高、中、低剂量组比较,对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响差异均无统计学意义(P>0.05)(表 4)。
组别 | 剂量/(g·kg -1) | 足跖肿胀度/mL | ||||
0.5 h | 1 h | 2 h | 4 h | 6 h | ||
模型组 | — | 0.61±0.10 | 0.81±0.23 | 0.72±0.17 | 0.61±0.20 | 0.55±0.19 |
阳性组 | 0.001 | 0.53±0.10 | 0.58±0.19 * | 0.55±0.18 | 0.43±0.11 * | 0.38±0.14 * |
白芍总苷组 | 0.120 | 0.52±0.11 | 0.53±0.20 * | 0.50±0.16 * | 0.42±0.18 * | 0.39±0.11 |
白芍水提物高剂量组 | 2.800 | 0.55±0.13 | 0.57±0.17 * | 0.52±0.15 * | 0.44±0.15 * | 0.40±0.14 |
白芍水提物中剂量组 | 1.400 | 0.51±0.11 | 0.60±0.17 | 0.59±0.16 | 0.56±0.14 | 0.51±0.13 |
白芍水提物低剂量组 | 0.700 | 0.52±0.09 | 0.63±0.15 | 0.61±0.19 | 0.53±0.15 | 0.45±0.14 |
模型组大鼠肿胀足局部的PGE2、NO和MDA含量均明显升高,白芍水提物各剂量组和白芍总苷组大鼠肿胀足的PGE2、NO和MDA含量均降低。其中,白芍水提物高剂量组、白芍总苷组与模型组差异均有统计学意义(P<0.05)。
与白芍总苷组相比,白芍水提物中、低剂量组的NO水平显著升高,白芍水提物中剂量组的MDA水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。说明白芍水提物中、低剂量组降低模型大鼠足NO的作用不如白芍总苷组,白芍水提物中剂量组降低模型大鼠足MDA的作用不如白芍总苷组(表 5)。
组别 | 剂量/(g·kg -1) | PGE 2(A值) | NO/(μmol·L -1) | MDA/(nmol·L -1) |
模型组 | — | 0.340±0.089 | 33.30±6.16 | 4.99±0.37 |
阳性组 | 0.001 | 0.260±0.050 * | 22.13±5.06 * | 3.96±0.54 * |
白芍总苷组 | 0.120 | 0.249±0.058 * | 23.23±6.95 * | 3.82±0.58 * |
白芍水提物高剂量组 | 2.800 | 0.259±0.048 * | 26.95±3.29 * | 4.01±0.69 * |
白芍水提物中剂量组 | 1.400 | 0.268±0.062 | 30.88±5.12 △ | 4.56±0.96 △ |
白芍水提物低剂量组 | 0.700 | 0.289±0.075 | 32.06±4.01 △ | 4.40±0.68 |
注: 与模型组比较, *P <0.05; 与白芍总苷组比较, △P<0.05。 Note: compared with model group, *P<0.05; compared with total glucosides of paeonia group, △P<0.05. |
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。急性炎症的局部典型特征为红、肿、热、痛和功能障碍,全身反应可表现为发热、补体合成增多和末梢血白细胞改变等。炎症局部组织可发生变质、渗出、增生。在炎症反应中,损伤因子引起毛细血管扩张,通透性增加,中性粒细胞趋化、游走至炎症反应灶,细胞释放炎症介质如组胺、5-羟色胺、花生四烯酸代谢产物(如PGE2)、NO、细胞因子、血小板激活因子等参与炎症反应,同时产生活性氧自由基。这些氧自由基攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化,造成生物膜损伤,尤其脂质过氧化产物MDA毒性更强,能进一步加重炎症反应(王哓菲,金鸣,2007)。
以往的研究表明,白芍的水提醇沉物或者醇提物对急、慢性炎症均有一定抗炎作用(欧阳勇,2008;陈华,叶柳贤,2010;陈益山等,2010;舒心莹,2011)。
本研究采用3种炎症动物模型评价白芍水提物的抗炎作用,其中,二甲苯致小鼠耳片肿胀模型和蛋清致大鼠足跖肿胀模型是急性炎症模型,琼脂致小鼠肉芽肿模型是亚急性(慢性)炎症模型。实验结果表明,白芍水提物对急、慢性炎症均有一定的抑制作用。
不同提取方式对白芍中化学成分的溶出影响不同,如传统热水提取方法对多糖溶出较为有利(秦亚东等,2014),超声提取法(秦亚东等,2014)和醇提法(唐春发,1995;刘媛等,2006)对芍药苷溶出较为有利。
本研究运用水提醇沉法提取白芍总苷,通过3种炎症模型将白芍水提物与白芍总苷的抗炎作用比较发现,白芍水提物4 g·kg-1、白芍总苷180 mg·kg-1均可显著抑制二甲苯致小鼠耳片肿胀和琼脂致小鼠肉芽肿,降低琼脂致小鼠肉芽肿模型血清PGE2水平;白芍水提物2.8 g·kg-1、白芍总苷120 mg·kg-1均可显著抑制蛋清致大鼠足跖肿胀,降低肿胀足的NO、MDA和PGE2含量;白芍水提物和白芍总苷对急、慢性炎症的抑制作用差异无统计学意义。研究结果提示,白芍水提物的抗炎机制可能与减少血液中PGE2的合成,抑制局部组织PGE2、NO的合成或释放,抑制炎症过程中脂质过氧化产物的生成有关。其中具体的抗炎成分、更深入的抗炎机制及其与白芍总苷对不同炎症影响的异同有待进一步研究。
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