3’-甲氧基-3，4’，5，7-四羟基黄酮(3’-Methoxy-3，4’，5，7-tetrahydfoxyflavone，MTHF)是O-甲基化黄酮醇，广泛存在于蓼科植物中，也是哺乳动物和植物中槲皮素的中间代谢物(Lee et al., 2008)。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如抗癌和抗氧化作用。研究表明黄酮类化合物能够通过抑制细胞周期，诱导凋亡进而抑制肿瘤细胞。黄酮类化合物为潜在的抗癌治疗药物(Maqqioni et al., 2014)。MTHF作为黄酮类化合物，在体内对肿瘤细胞的抑制作用很少被报道(Lee et al., 2006)。本实验通过建立C57BL/6鼠Lewis肺癌移植瘤模型，从动物水平进一步探讨其抗肿瘤作用的机理。 1 材料与方法 1.1 细胞培养及细胞悬液的制备

将鼠Lewis肺癌LL₂细胞株(本实验室提供)复苏，加入含10%已灭活的小牛血清(成都哈里生物有限工程公司)的DMEM(GIBCO)培养基，置于含5%CO₂，37 ℃恒温细胞培养箱中培养，传代收集对数生长期细胞后制备细胞悬液，调节浓度为1×10⁷/mL。 1.2 鼠Lewis肺癌LL₂细胞移植瘤的建立

受体鼠为6周龄C57BL/6鼠(购自四川省抗生素研究所，合格证号：0005)，体质量20~23 g，接种部位为右前肢腋窝皮下，微量注射器注射细胞悬液0.2 mL/只(细胞数为2×10⁶个)，接种约15 d后形成明显的移植瘤。将荷瘤鼠随机分成3组，每组14只，雌雄各半：对照组注射生理盐水0.1 mL/只，每日1次，共7 d;MTHF处理组，瘤体注射MTHF50 mg/(kg·d)，共7 d;顺铂组，瘤体注射顺铂25 mg/(kg·d)，共7 d。 1.3 抑瘤率观察

每隔1 d测量肿瘤体积(a×b²)/2(a、b分别是肿瘤的长和宽)，并绘制移植瘤生长曲线；药物注射7 d后，断髓法处死小鼠，完整切取肿瘤，测量瘤重，计算各组药物的抑瘤率。抑瘤率=[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。 李小雪等:MTHF对C57BL/6鼠Lewis肺癌细胞生长的影响 1.4 组织学观察

光镜观察：4%多聚甲醛固定肿瘤组织，常规包埋石蜡切片，切片进行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肿瘤细胞坏死程度，并计算坏死斑面积。

电镜观察：将肿瘤组织块投入2%冷戊二醛中固定，洗涤液漂洗2 h后在4 ℃下用1%饿酸固定2 h。而后组织经逐级脱水，浸透包埋，超薄切片，电子染色后在H-600IV型透射电镜下观察肿瘤组织。 1.5 PCNA、Bcl-2、Bax表达的检测

免疫组化SP法：常规包埋石蜡切片脱蜡，封闭内源性过氧化酶，柠檬酸用于抗原修复，一抗封闭过夜，加二抗辅助试剂，孵二抗后经DAB显色，再将组织切片进行苏木素染色，置于氨水中以便充分返蓝，晾干后封片进行显微镜观察。PCNA以细胞胞核出现棕黄色或褐色颗粒为阳性标准。Bcl-2和Bax以细胞胞质被染成棕黄色颗粒为阳性。按下述标准进行结果判定：光镜下观察100个肿瘤细胞中阳性细胞的百分比，其阳性率<10%为-，阳性率10%~25%为+，阳性率25%~50%为++，阳性率>50%为+++。阴性对照组均用PBS代替第一抗体。其中PCNA、Bcl-2、Bax抗体及相关试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。 1.6 统计学分析

实验结果进行方差分析，P<0.05表示结果具有统计学意义。 2 结果 2.1 药物对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用

C57BL/6鼠接种Lewis肺癌细胞后，15 d左右形成明显的移植瘤，用药期间未发现鼠死亡(图 1)。计算MTHF组、顺铂组的抑瘤率分别为46.2%、54.5%(表 1)，MTHF组、顺铂组移植瘤体积较对照组减小(图 2，图 3)，结果显示移植瘤对MTHF和顺铂治疗均敏感。

图 1 C57BL/6鼠移植瘤 Fig. 1 C57BL/6 mice transplantation tumor A. 对照组Control group，B. MTHF组 MTHF treatment group，C. 顺铂组Cisplatin treatment group; 下同the same below.

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图 2 移植瘤生长曲线 Fig. 2 Growth curve of transplantation tumor

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图 3 各实验组C57BL/6鼠肿瘤大小 Fig. 3 C57BL/6 mice transplantation tumor of each group

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光镜下观察肿瘤组织，对照组细胞仍保持着培养状态下原有的异质性，呈不规则形态，核异型深染，出现异常的核分裂组(图 4：A)。MTHF组细胞较对照组呈现不同程度的退行性变化，细胞体积减小，部分肿瘤组织明显坏死(图 4：B，C)。

图 4 各实验组HE染色比较(×100) Fig. 4 Comparison of each group after HE staining(×100)

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电镜下观察对照组细胞胞膜结构完整，胞核大而圆，核膜光滑无褶皱，核仁清晰可见。MTHF组可见典型的凋亡细胞形态：细胞膜完整，胞体皱缩并形成突起，胞浆内密度加深，核质浓缩，核膜、核仁破裂，异染色质趋边聚集，排列在核膜内侧。顺铂组细胞膜完整，核膜出现褶皱(图 5)。

图 5 透射电镜观察各实验组超微结构(×12 000) Fig. 5 Observation of the ultrastructure of each group by transmission electron microscope(×12 000)

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PCNA免疫组化结果显示：PCNA蛋白表达于Lewis肺癌细胞核内，阳性细胞呈棕褐色。对照组PCNA阳性率明显高于MTHF组、顺铂组(图 6：A~C)，药物处理后的PCNA指数明显下降，与对照组相比差异具有高度统计学意义(P<0.01)(表 2)。表明MTHF对肿瘤细胞增殖有抑制作用。

图 6 免疫组化法检测各实验组肿瘤组织PCNA表达(×100) Fig. 6 Positive immunohistochemical expression of PCNA in cancer tissue(×100)

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免疫组化结果显示MTHF组、顺铂组Bcl-2表达明显低于对照组(P<0.05)(图 7，表 3)，而Bax的表达却高于对照组(图 8，表 4)。表明MTHF可抑制Bcl-2蛋白的表达并促进Bax蛋白的表达。

图 7 免疫组化法检测各实验组肿瘤组织Bcl-2表达(×100) Fig. 7 Positive immunohistochemical expression of Bcl-2 in cancer tissue(×100)

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图 8 免疫组化法检测各实验组肿瘤组织Bax表达(×100) Fig. 8 Positive immunohistochemical expression of Bax in cancer tissue(×100)

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黄酮类化合物是最常见的多酚类植物化合物，分离出的化合物常为山奈酚、槲皮素的衍生物。黄酮类化合物是苯丙烷类代谢途径产生的次生代谢产物，由15个C原子和1个共同的C6-C3-C6骨架，2个苯环通过吡喃杂环或者1个吡喃酮环连接在一起(Carletti et al., 2014)。已报道的黄酮类化合物对多种肿瘤细胞系均有抑制增殖的作用，包括肝癌、结肠癌、胶质瘤、食道癌等(Tsai et al., 2010；Yan et al., 2014)。Tsui等(2014)发现黄酮类化合物能够阻断H460与A549细胞周期。本研究发现，MTHF能够抑制Lewis肺癌细胞的生长、增殖而发挥抗肿瘤的作用。

PCNA在细胞分裂过程中发挥着至关重要的作用，在调控细胞周期、染色体代谢和DNA复制过程中起着重要的作用。在真核细胞和古细菌中发现PCNA是在进化上十分保守的蛋白质。PCNA是DNA聚合酶的聚合因子，可作为细胞增殖的指标(Strzalkaet & Ziemienowicz，2011)。本实验中发现MTHF组PCNA的表达量显著低于对照组，表明MTHF能够抑制细胞的增殖。Bcl-2家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质。Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。研究表明Bcl-2缺陷小鼠能诱发淋巴细胞凋亡，Bax缺陷小鼠的淋巴细胞却增生(McDonnell et al., 1989)。说明Bcl-2是抗凋亡因子，而Bax的作用等同于凋亡因子。Bcl-2蛋白与Bax相竞争。当Bax过量时，Bax自身形成的同源二聚体占优势，细胞执行死亡的命令；当Bcl-2占优势时，Bcl-2和Bax形成异源二聚体，凋亡被抑制细胞存活(Korsmeyer，1999)。Bcl-2和Bax的比值可以作为测定凋亡的指标。C57BL/6鼠Lewis肺癌移植瘤细胞经MTHF处理后Bcl-2的表达明显低于对照组，表明MTHF可能能够诱导Bax的表达，从而抑制Bcl-2基因，进而诱导细胞凋亡。

通过上述实验可见，MTHF能抑制C57BL/6鼠Lewis肺癌移植瘤的增殖，这是MTHF在体内具有抗肿瘤作用的实验依据，为抗癌药物的筛选提供一条可能的途径。