大熊猫Ailuropoda melanoleuca是我国特有的珍稀濒危动物，由于受人类活动的影响，大熊猫栖息地逐渐缩小为四川、陕西和甘肃的一些山脉(Li et al., 2003；Wan et al., 2005)，特别是秦岭、岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山山脉。根据全国第四次大熊猫调查结果新闻发布会可知，全国野生和圈养的大熊猫种群数量均有增长，其中野生大熊猫种群数量为1864只，圈养大熊猫375只，其中四川省1387只，占全国野生大熊猫总数的74.4%。大熊猫趋于濒危的主要原因之一是疾病致死，而肠道疾病是大熊猫疾病致死的最严重疾病(Zhang et al., 2009)。肠道菌群对宿主的消化、免疫和抗病等功能具有重要的影响(朱达坚等，2012；Wang et al., 2014)。菌群失调不仅会引起二重感染，还会导致机体免疫力下降，出现体弱多病、营养不良、腹泻、便秘等(Zhang et al., 2010)。肠球菌是大熊猫肠道菌群的优势菌群，其数量、种类等的变化直接关系到大熊猫肠道菌群的平衡，同时也是一种重要的条件致病菌。近年来，由肠球菌导致的临床感染不断增加，人们已逐渐认识到肠球菌的危害而不再认为其是无害的共栖菌(唐晓丹等，2007)。目前针对肠球菌仍采用预防和抗生素治疗的方法，然而随着抗生素的广泛使用，耐药菌株日益增多，多重耐药和高耐现象相当严重。由于肠球菌本身具有对某些抗生素天然耐药的特性，加上又有获得性耐药的传播和蔓延(Poeta et al., 2006)，给肠球菌尤其是耐药肠球菌感染的治疗带来极大困难。特别是近年来，人和动物源性细菌耐药性已引起世界各国的广泛关注和重视(Schouten et al., 1999；Aarestrup et al., 2000；Hershberger et al., 2005；Poeta et al., 2007)。

本研究首次对254份大熊猫(野生、野化和圈养)粪便样品进行了肠球菌分离鉴定，共计分离得到11种肠球菌，共计381株。对这些肠球菌进行药物敏感试验，监测大熊猫源肠球菌耐药现状，以期为大熊猫疾病发生和临床合理用药提供参考，进而提高大熊猫的存活率，从而更好地保护大熊猫这一濒危旗舰物种。郝中香等:不同生境大熊猫源肠球菌耐药性分析 1 材料与方法 1.1 样本

254份粪便样品来源信息见表 1。

所用菌株为四川农业大学分子生物学实验室郝中香等(2015)分离鉴定得到的381株大熊猫源肠球菌(表 2)，其中105株为小肠肠球菌Enterococcus hirae，124株为粪肠球菌E. faecalis、45株为坚韧肠球菌E. durans、34株为屎肠球菌E. faecium，23株为鸟肠球菌E. avium、23株为鹑鸡肠球菌E. gallinarum、10株为棉子糖肠球菌E. raffinosus、9株为乳酸肠球菌E.lactis、4株为铅黄肠球菌E.casseliflavus、3株为病臭肠球菌E.malodoratus、1株为蒙氏肠球菌E.mundtii。标准质控粪肠球菌ATCC29212购自广东环凯微生物科技有限公司。

试验所用药敏纸片(批号：20130714)均购自杭州微生物试剂有限公司，药敏纸片及其规格见表 3。

MH琼脂(MHA)、MH肉汤(MHB)，购自OXOID LTD(Basingstoke，Hampshire，Engl and )，使用时按照产品说明书配制。 1.5 方法 1.5.1 菌种接种及稀释

将肠球菌菌种接种于MH琼脂培养基上35 ℃培养24 h，挑取单个菌落于10 mL MH肉汤中(部分菌株营养要求高，需加入5%小牛血清)，35 ℃振荡培养12~16 h。将菌液稀释为0.5麦氏标准的菌液，然后获得浓度为1.0×10⁸ CFU·mL^-1的菌液。 1.5.2 肠球菌药物敏感试验

本研究采用临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的K-B纸片法。将381株大熊猫源肠球菌参照文献(马越等，2005；谭瑶等，2010)试验规范进行药敏试验，药敏试验结果参照CLSI标准(Poeta et al., 2007)来判定。用ATCC29212作为标准质控菌株，每种药敏纸片做3次平行重复，取其平均值作为最终结果。判定结果分别以敏感(S)、中介(I)、耐药(R)3种形式记录。 2 结果 2.1 381株大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药性

381株大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药率见表 4。可以看出，大熊猫源肠球菌对21种常用抗生素中的部分药物产生了耐药性。其中对青霉素耐药率为13.91%，先锋霉素V耐药率为11.55%，链霉素耐药率为10.24%，其余抗生素的耐药率均低于10%，绝大部分抗生素的耐药率均在4%以下，未发现有对恩诺沙星、复方新诺明、万古霉素、庆大霉素、替考拉宁耐药的菌株。

从表 5(a)和表 5(b)可以看出，不同种类大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药率不同。未发现棉子糖肠球菌和病臭肠球菌对所选择的21种抗生素具有耐药性。其余各类肠球菌对所选的部分抗生素产生了耐药性，且部分菌株耐药率较高，如鹑鸡肠球菌对链霉素耐药率为26.09%;小肠肠球菌对链霉素耐药率为11.43%;粪肠球菌对β-内酰胺类的青霉素和先锋霉素V耐药率较高，分别为29.84%、17.74%;屎肠球菌对头孢噻肟、先锋霉素V、青霉素耐药率最高，均为11.76%。

图 1 8种圈养大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药性 Fig. 1 Antimicrobial resistance for 21 kinds of antibiotics in 8 kinds of Enterococcus isolates from captive giant pandas

图选项

8种圈养大熊猫源肠球菌对所用的21种抗生素中的16种产生了耐药性。其中粪肠球菌耐药性 最为严重，共对14种抗生素产生了耐药性；小肠肠球菌对10种抗生素产生了耐药性；屎肠球菌和蒙氏肠球菌各对8种抗生素产生了耐药性；坚韧肠球菌对6种抗生素产生了耐药性；鸟肠球菌、鹑鸡肠球菌和乳酸肠球菌各对3种抗生素产生了耐药性。8种肠球菌均未发现有对恩诺沙星、复方新诺明、替考拉宁、万古霉素和庆大霉素耐药的菌株。 2.4 野化大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药性

由表 7和图 2得知，9种野化大熊猫源肠球菌对所用的21种抗生素中的14种产生了耐药性。其中粪肠球菌耐药性最严重，共对12种抗生素产生了耐药性；小肠肠球菌对7种抗生素产生了耐药性；屎肠球菌和鹑鸡肠球菌各对6种抗生素产生了耐药性；坚韧肠球菌和乳酸肠球菌各对4种抗生素产生了耐药性；鸟肠球菌对2种抗生素产生了耐药性；铅黄肠球菌对1种抗生素产生了耐药性。未发现棉子糖肠球菌对所选择的21种抗生素具有耐药性。9种肠球菌均未发现有对恩诺沙星、复方新诺明、环丙氟哌酸、替考拉宁、氟苯尼考、万古霉素和庆大霉素耐药的菌株。

图 2 9种野化大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药性 Fig. 2 Antimicrobial resistance for 21 kinds of antibiotics in 9 kinds of Enterococcus isolates from reintroduced giant pandas

图选项

由表 8和图 3可知，10种野生大熊猫源肠球菌对所用的21种抗生素中的14种产生了耐药性。其中粪肠球菌耐药性最严重，共对14种抗生素产生了耐药性；鹑鸡肠球菌对5种抗生素产生了耐药性；铅黄肠球菌对4种抗生素产生了耐药性；小肠肠球菌和屎肠球菌各对2种抗生素产生了耐药性；坚韧肠球菌、鸟肠球菌和乳酸肠球菌各对1种抗生素产生了耐药性。未发现棉子糖肠球菌和病臭肠球菌对所选择的21种抗生素具有耐药性。10种肠球菌均未发现有对恩诺沙星、复方新诺明、四环素、替考拉宁、氟苯尼考、万古霉素和庆大霉素耐药的菌株。

图 3 10种野生大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药性 Fig. 3 Antimicrobial resistance for 21 kinds of antibiotics in 10 kinds of Enterococcus isolates from wild giant pandas

图选项

从表 9和图 4可以看出59种耐药谱，381株肠球菌中的113株具有耐药性。主要耐药谱为1耐、2耐和3耐，所占比例分别为11.55%，6.56%和5.25%，4~8耐的耐药菌株相对较少。总之，大熊猫源肠球菌分离株的多重耐药总体情况相对较轻。

图 4 大熊猫源肠球菌耐药谱 Fig. 4 Distribution of multi-resistance of Enterococcus isolates from giant pandas

图选项

人类对抗生素的滥用，造成环境抗生素污染，使自然环境中耐药菌群数量逐渐增加(王冉等，2006)，同时也增加了大熊猫源细菌获得耐药性的机会；圈养大熊猫发生细菌疾病时与其他动物一样使用抗生素进行治疗，在抗生素选择压力下，细菌可能产生耐药性；另外，肠球菌具有天然耐药性和获得耐药性，使其对抗生素产生耐药性的可能性大大增加(周铁丽，张李雅，1998)。近年的研究发现，与大熊猫源肠球菌的耐药性相比，其他动物源肠球菌耐药情况更严重，表明在对大熊猫选用抗菌药物治疗时药物使用相对较合理，减少或避免细菌耐药性的产生。段志刚(2010)研究发现，湖南省猪源肠球菌对四环素、卡那霉素和红霉素耐药。王熙楚等(2012)、郭秉娇等(2013)对不同动物源肠球菌的耐药性研究结果表明，不同动物来源的肠球菌对某些抗生素表现出的耐药性存在差异。

本研究首次系统地对不同栖息地和生存方式的大熊猫源肠球菌耐药性进行了监测分析，以期全面了解大熊猫源肠球菌耐药性发展和流行现状，为大熊猫源细菌耐药性监测体系的建立和大熊猫细菌性疾病的控制奠定基础，同时为临床合理选用抗菌药物提供参考。研究表明，不同种类大熊猫源肠球菌对21种抗生素的耐药率不同。各类肠球菌中粪肠球菌的耐药现象最为严重，共对15种抗生素耐药；其次为小肠肠球菌，对11种抗生素耐药；肠球菌耐药率最高的为β-内酰胺类，其次为氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类。多重耐药主要以1~3重耐药为主，且整体多重耐药情况相对较轻微。大熊猫源肠球菌耐药率总体低，耐药性差异主要体现在肠球菌的种类上，大熊猫的生存环境和方式等对其影响相对较小，圈养、野化和野生大熊猫之间只有很细微的差别，可以从侧面反映出目前给予圈养大熊猫使用的抗菌药物较为科学合理。大熊猫源肠球菌产生耐药性的可能原因分析如下：抗生素预防和治疗圈养大熊猫细菌性疾病，细菌产生抗生素选择压力从而产生耐药性；大熊猫生活环境中存在人类、野生鼠类等其他动物散播的耐药菌株；耐药基因在不同微生物间转移，使敏感菌株产生耐药，受抗生素污染和细菌耐药性广泛传播，自然界中耐药微生物菌群数量越来越多；肠球菌对某些药物存在天然的固有耐药。提示在治疗肠球菌感染时应更加谨慎合理地使用抗生素，避免或减少耐药菌株的产生和耐药基因的传播。