四川动物  2015, Vol. 34 411-414

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祁珊珊, 郑红星
QI Shanshan, ZHENG Hongxing
牦牛肠源Lactobacillus acidophilusL3对其肠道分泌型免疫球蛋白A及免疫相关因子的影响
Effect of Intestinal Lactobacillus acidophilus L3 on the SIgA and Immune Factors of Small Intestine in Yaks
四川动物, 2015, 34: 411-414
Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34: 411-414
10.3969/j.issn.1000-7083.2015.03.016

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收稿日期：2014-11-05
接受日期：2014-12-26
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祁珊珊, 郑红星. 牦牛肠源Lactobacillus acidophilusL3对其肠道分泌型免疫球蛋白A及免疫相关因子的影响[J] 四川动物, 2015, 34: 411-414.
QI Shanshan, ZHENG Hongxing. Effect of Intestinal Lactobacillus acidophilus L3 on the SIgA and Immune Factors of Small Intestine in Yaks[J] Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34: 411-414.
牦牛肠源Lactobacillus acidophilusL3对其肠道分泌型免疫球蛋白A及免疫相关因子的影响
祁珊珊1, 郑红星2,3     
1. 陕西理工学院维生素D生理与应用研究所, 陕西汉中723000;
2. 陕西理工学院生物科学与工程学院, 陕西汉中723000;
3. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所, 农业部兽用药物创制重点实验室和甘肃省新兽药工程重点实验室, 兰州730050
收稿日期:2014-11-05;接受日期：2014-12-26
基金项目：陕西省教育厅科学研究计划(自然科学专项)项目2013JK0721;陕西理工学院人才启动院项目SLGQD13-19;陕西理工学院人才启动院项目SLGQD14-01;农业部兽用药物创制重点实验室和甘肃省新兽药工程重点实验室开放课题1610322011011
作者简介: 祁珊珊(1984—),女,博士,讲师,主要从事动物病理学研究,E-mail：qishanshan101@126.com
通信作者：郑红星,博士,讲师,主要从事药理毒理学研究,E-mail：zhenghongxing100@126.com
摘要：为了研究牦牛肠源Lactobacillus acidophilus L3(嗜酸乳杆菌)对其肠道分泌型免疫球蛋白A(SIgA)及免疫相关因子的影响,将10头健康牦牛(2~2.5岁)随机分为2组,分别为益生菌组和空白对照组,益生菌组在饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3,饲喂28 d后取其小肠样品,ELISA检测试验组和对照组十二指肠、空肠、回肠中SIgA、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、干扰素γ(IFN-γ)的含量.研究结果表明,L. acidophilus L3可有效增加试验组牦牛肠道SIgA的分泌量(P ＜0.05),组内比较发现SIgA在回肠含量最高,其次为空肠和十二指肠.IL-2、IL-4、IL-6在试验组小肠中的表达量较对照组显著增加(P＜0.05),试验组小肠IFN-γ的表达量较对照组降低(P＜0.05).证实L. acidophilus L3可提高牦牛肠道的黏膜免疫功能.
关键词： 牦牛     Lactobacillus acidophilus L3     小肠     SIgA     免疫相关因子    
Effect of Intestinal Lactobacillus acidophilus L3 on the SIgA and Immune Factors of Small Intestine in Yaks
QI Shanshan1, ZHENG Hongxing2,3     
1. Institute of Vitamin D, Shaanxi University of Technology, Hanzhong, Shaanxi Province 723000, China;
2. College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong, Shaanxi Province 723000, China;
3. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS, Gansu Key Lab of New Animal Drug Project, Key Lab of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry Agriculture, Lanzhou 730050, China
Abstract:In order to study the effects of Lactobacillus acidophilus L3 on the intestinal SIgA and immune factors of yaks, 10 yaks aged from 2 to 2.5 years were used in this study, and 5 of which were fed daily with L. acidophilus L3 (a concentration of 2×109 CFU·kg-1 feed), while the others were conventional feed without adding L. acidophilus L3. Small intestinal samples were collected on day 28, and the content of SIgA, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ in duodenum, jejunum, and ileum were detected by ELISA. The results showed that the content of intestinal SIgA was significantly increased in the probiotic group compared with the control (P < 0.05). The highest content of SIgA was found in ileum followed by jejunum and duodenum. The content of intestinal IL-2, IL-4 and IL-6 were also significantly increased in the probiotic group compared with the control (P < 0.05). The content of intestinal IFN-γ was decreased in the probiotic group compared with the control (P < 0.05). These results indicated that L. acidophilus L3 can effectively improve the intestinal mucosal immune function of yaks by increasing the levels of intestinal SIgA, IL-2, IL-4 and IL-6.
Key words: yak     Lactobacillus acidophilus L3     small intestine     SIgA     immune factors    

肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)是肠道黏膜表面主要的体液免疫成分，是防御病原体在黏膜黏附与定植的重要防线。SIgA可抑制细菌或病毒黏附在肠黏膜上皮表面，抑制病毒的装配和释放，对减少病毒在肠道黏膜上皮的复制起着重要的作用(Blaise，2013)。白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6均是重要的免疫相关因子，其分泌细胞主要分布在肠黏膜固有层，与IgA阳性浆细胞的分布有着密切的关系，IL-2、IL-4、IL-6可增加肠道IgA的分泌;干扰素γ(IFN-γ)是由活化辅助性T细胞1(helper T cell 1，Th1)和自然杀伤细胞(natural killer，NK)产生的，IFN-γ对肠道IgA的分泌具有下调作用。

许多研究表明益生菌提高肠道黏膜免疫功能的主要作用机制是增加肠道SIgA的分泌及刺激肠道中某些免疫相关因子的表达(Solis et al.，1997;Vinderola & Matar，2007)，牦牛肠源Lactobacillus acidophilus L3是本课题组从健康牦牛肠道分离得到的益生菌，前期研究表明它可有效改善小肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度比值(V/C)，以及回肠黏膜淋巴集结厚度等，但其是否也对肠道SIgA有作用?是否也对某些黏膜免疫相关因子有调节作用？本研究主要回答这个问题，以探讨L. acidophilus L3的免疫增强作用。祁珊珊等:牦牛肠源Lactobacillus acidophilus L3对其肠道分泌型免疫球蛋白A及免疫相关因子的影响 1 材料与方法 1.1 试验动物

试验用牦牛均来自甘肃省天祝县石门镇牦牛养殖场。10头健康牦牛雌雄各半(2~2.5岁)，随机均分为2组，分别为益生菌组和空白对照组，益生菌组在基础饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，对照组仅饲喂基础饲料，供试牦牛均采用舍饲固定位置栓养，2组牦牛饲养环境温度、湿度均相同，每天给予等量饲料，饲喂28 d后将牦牛颈动脉放血处死取其小肠。 1.2 饲料制备

基础饲料为北京荣达兴饲料技术有限公司生产的牛羊专用配合饲料，将一定比例的菌液与水混匀后喷洒在基础饲料上，揉搓阴干，阴干后的饲料放于4 ℃冷藏库，每周涂平板检测饲料中菌含量是否达标。 1.3 样品取材

在牦牛小肠的近端空肠5 cm以下处取1 cm长的空肠，将其放入10 mL离心管中，十二指肠、回肠取材方法同空肠，所有样品均在-20 ℃保存备用。 1.4 仪器设备及重要试剂

Eppendorf冷冻离心机，Pro 200型精密组织匀浆器，Bio-Tek酶标仪，牛分泌型免疫球蛋白A(SIgA)酶联免疫分析试剂盒(上海永叶生物科技有限公司)，牛细胞因子定量检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。 1.5 SIgA、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的测定

将在-20 ℃存放的样品从冰箱取出平衡至室温，准确称量0.3 g肠组织，剪碎后移入组织匀浆器中，加入预冷的生理盐水至总体积为3 mL，制备成10%的肠组织匀浆。将匀浆液低温离心(4 ℃，8000 r·m-1)10 min，取上清液，以备测定SIgA、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量。SIgA的测定采用双抗体夹心ELISA法，用牛SIgA ELISA试剂盒检测肠组织中SIgA抗体浓度，酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，通过标准曲线计算SIgA抗体的浓度。IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ测定方法同SIgA，严格按照试剂盒说明书进行。 1.6 试验数据统计分析

试验数据用SPSS 17.0统计软件进行单因素组间方差分析，结果以"平均值±SD"表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 L. acidophilus L3对牦牛肠道SIgA含量的影响

饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，试验组十二指肠、空肠、回肠SIgA的含量均较对照组显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，组内比较发现SIgA在回肠含量最高，其次为空肠，十二指肠SIgA的含量最低。可见，L. acidophilus L3对牦牛肠黏膜具有明显免疫调节作用，SIgA在回肠含量最高与回肠黏膜淋巴集结分布有关(表 1)。

表 1 对照组和试验组牦牛肠道SIgA、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量(pg·mL-1) Table 1 Content of SIgA，IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ in small intestinal of yak in control and probiotic groups(pg·mL-1)
表选项
2.2 L. acidophilus L3对牦牛肠道IL-2含量的影响

饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，试验组十二指肠、空肠、回肠组织中IL-2的含量均较对照组显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);组内比较发现IL-2在回肠含量最高，其次为空肠，十二指肠和空肠IL-2含量差异不具有统计学意义(表 1)。 2.3 L. acidophilus L3对牦牛肠道IL-4含量的影响

饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，试验组十二指肠、空肠、回肠组织中IL-4含量均较对照组显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);组内比较发现IL-4在回肠含量最高，其次为空肠、十二指肠。但是回肠和空肠IL-4[KG(1x]含量差异无统计学意义，十二指肠与空肠 IL-4含量差异具有统计学意义(表 1)。 2.4 L. acidophilus L3对牦牛肠道IL-6含量的影响

饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，试验组十二指肠、空肠、回肠组织中IL-6含量均较对照组显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);组内比较发现IL-6含量在十二指肠、空肠、回肠中差异均无统计学意义(表 1)。 2.5 L. acidophilus L3对牦牛肠道IFN-γ含量的影响

饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，试验组十二指肠、空肠、回肠组织中IFN-γ含量均较对照组显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05);组内比较发现IFN-γ含量在十二指肠、空肠、回肠中差异均不具有统计学意义(表 1)。 3 讨论 3.1 L. acidophilus L3对牦牛肠道SIgA含量的影响

SIgA是机体内分泌量最多的免疫球蛋白，是胃肠道和黏膜表面主要免疫效应分子，对消化道黏膜防御起着重要作用，其主要由肠黏膜固有层中的IgA+浆细胞分泌，是肠道黏膜免疫的主要抗体(祁珊珊，郑红星，2014)。SIgA的功能可归纳为以下几点:(1)中和毒素、酶、病毒和其他抗原物质;(2)直接作用于细菌表位，降低病原体毒力;(3)增强单核细胞依赖的杀菌活性，调理黏膜多形核白细胞和吞噬细胞的吞噬功能，抑制NK的活性及抗体依赖的细胞毒活性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，调节T细胞活性，参与介导嗜酸性粒细胞脱颗粒;(4)激活补体的C-3旁路途径，同溶菌酶和补体共同参与抗菌(刘冬，刘沛，2004;Zheng et al.，2012)。总之，SIgA可阻止肠道病原微生物及其毒素分子对肠黏膜的攻击。Perdigón等(1986，1988)的研究发现给予大鼠治疗剂量的乳酸杆菌饲喂3 d，其肠道SIgA的分泌量大大增加;Yasui等(1992)的研究也发现双歧杆菌可有效增加大鼠肠道SIgA的分泌量;研究发现用瑞士乳杆菌灌喂小鼠可增加小肠IgA+浆细胞的数量，从而增加SIgA的分泌量(Vinderola & Matar，2007)。本研究发现，牦牛饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，其肠道SIgA的量较对照组显著增加，表明L. acidophilus L3可有效增强牦牛肠道的黏膜免疫功能。 3.2 L. acidophilus L3对牦牛肠道IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影响

IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，其可以促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子;IL-4由Ⅱ型辅助T细胞分泌，其主要功能是刺激B细胞活化和T细胞增殖，在调节体液免疫和获得性免疫中起关键作用，同时也是SIgA阳性B细胞产生的重要开关因子;IL-6由活化的T细胞和成纤维细胞产生，能使B细胞前体分化成产生抗体的细胞。IL-2、IL-4、IL-6的分泌细胞主要分布在肠黏膜固有层，与IgA+浆细胞的分布有着密切的关系，因此这些细胞因子均可刺激SIgA的分泌。IFN-γ是由活化T细胞产生，IFN-γ通过拮抗IL-4抑制SIgA抗体的分泌。

多项研究表明摄食益生菌可刺激某些免疫相关细胞因子的产生。朱于敏等(2005)用储存不同时期的酸奶进行小鼠试验，发现乳酸菌作为有效成分刺激小鼠肠道淋巴细胞使IL-2的水平增高;高源等(2011)的研究发现嗜酸乳杆菌可通过提高IL-4水平来调节感染HRV乳鼠的细胞免疫功能;曹晋宜等(2009)的研究发现小鼠连续灌胃瑞士乳杆菌15 d后，其小肠IL-2、IL-4、IL-6的量均较对照组显著增加。我们的研究发现饲料中添加2×109 CFU·kg-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，牦牛肠道IL-2、IL-4、IL-6的量均较对照组显著增加，IL-2、IL-4、IL-6是调节肠道SIgA分泌的主要因子，它们可有效上调肠道SIgA的分泌。饲喂L. acidophilus L3后小肠IFN-γ含量的降低可减少IFN-γ对肠道SIgA分泌的抑制作用。因此，L. acidophilus L3可通过调节IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的表达量间接调节肠道SIgA的分泌，以增强牦牛的肠道黏膜免疫功能。 4 小结

SIgA在肠道黏膜免疫中发挥重要作用，L. acidophilus L3可有效增加肠道SIgA的分泌量，可增加肠道黏膜免疫相关因子IL-2、IL-4、IL-6的表达量，减少小肠IFN-γ的表达。IL-2、IL-4、IL-6对肠道SIgA的分泌起上调作用;IFN-γ对肠道SIgA的分泌具有下调作用。通过分析这些黏膜免疫相关因子的测定结果，证实L. acidophilus L3可提高牦牛肠道的黏膜免疫功能。

参考文献
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