非人灵长类动物(nonhuman primate，NHP)因与人有着最近的亲缘关系，且在生殖生理学、神经生物学和病理学等诸多方面最接近于人，因此是研究人类生命领域最高级的模式动物。NHP相关繁殖技术的优化不仅有助于提高动物繁殖效率，而且对提高转基因灵长类疾病模型制备效率具有重要的应用意义(Wolf，2004)。同时，NHP资源的匮乏和价格昂贵，使得繁殖技术的优化具有必要性。其中，食蟹猴Macaca fascicularis因体型小、性格温顺且常年均可繁殖和已完成基因组测序(Yan et al.，2011)等优势，近年来在转基因灵长类疾病模型制备研究中备受关注。然而食蟹猴个体平均月经周期天数差异大(26~34 d)(Sun et al.，2008)，而导致胚胎移植程序中选择自然受体的生殖周期同步性差、准确性低，常常需要很大的观察群体和较高的同步性检测费用的投入，但同时胚胎移植受体的有效选择又是影响模型制备的关键因素(Yang et al.，2008;Niu et al.，2010)，因此，本研究试图优化食蟹猴胚胎移植同步受体的处理技术。 1 材料与方法 1.1 研究对象与主要试剂

5~9岁月经周期正常的成年雌性食蟹猴37只，由广东蓝岛生物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(粤)2009-0010。实验猴采用单笼饲养，自动光控12 h光照与12 h黑暗，笼具中提供镜子和空心球供实验猴玩耍，每天观察月经情况并记录。

重组人促卵泡激素(recombinant human follicle stimulating hormone，rhFSH)和重组人绒毛膜促性腺激素(recombinant human chorionic gonadotropin，rhCG)为默克公司产品，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)为Sigma公司产品，人雌二醇(E2)ELISA试剂盒为Cayman公司产品。 1.2 超数排卵和实验猴分组

食蟹猴群中连续3 d内同时观察到月经血的3~5只个体组成一实验批次。在出现月经血的第2~3天，每日肌注rhFSH，按超排剂量分2个实验组，超排供体组(n=13)于每日08∶00和20∶00注射25 IU/只rhFSH，超排受体组(n=6)采用30%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)缓释技术(胡鹏飞等，2011)，于每日晨08∶00注射25 IU/只rhFSH，其余为自然受体组(n=21)。连续注射rhFSH 7~8 d后，B超检测双侧卵巢超排反应和卵泡发育的大小和数量，并于次日晨08∶00注射rhCG 1000 IU/只。 1.3 食蟹猴卵母细胞的获取

在无菌手术室手术法获取卵母细胞。要点是腹中线切口并暴露双侧卵巢，直尺测量左右侧超排后卵巢的直径，定义超排后卵巢的大小至少2 cm为反应良好;统计卵巢上直径≥3 mm的卵泡数量、平均获卵总数、平均排卵数及其中第二次减数分裂期(MⅡ)和第一次减数分裂期(MⅠ)卵数量。 1.4 E2的检测

血清样本的采集:rhFSH注射第6天起，连续4~5 d于早晨08∶00采集超排供体组、超排受体组和自然受体组个体的隐静脉血液1 mL，置于促凝管中，室温放置30 min，4000 r·min^-1离心20 min分离血清，并立即-80 ℃保存备用。

按照人E2 ELISA试剂盒的检测说明书执行。绘制超排供体组、超排受体组和自然受体组的E2曲线。 1.5 排卵同期化评价

以超排供体组的E2曲线为参考标准，统计超排受体组与超排供体组排卵同期化的准确率和月经周期相差3 d以内的自然受体组排卵同期化的准确率。 1.6 统计分析

采用Excel和SPSS 17.0软件统计分析。 2 结果 2.1 rhFSH剂量对食蟹猴卵泡发育的影响

未经超排处理的食蟹猴卵巢大小如绿豆，而经超排处理后的卵巢显著增大，超排良好的食蟹猴卵巢平均大小在3 cm左右，其上布满大小不同的未排优势卵泡和少数排卵后形成的血体。

通过统计rhFSH剂量(即超排供体组和超排受体组)对食蟹猴卵泡发育的影响(表 1)，结果表明2实验组超排后卵巢全部反应良好，B超检测超排供体组和超排受体组第8 天优势卵泡数(直径≥3 mm)分别为2.69个±0.49个和0.75个±0.48个(P＜0.05)，且获卵总数和平均排卵数分别为(15.18±6.51 VS. 5.67±3.79，6.77±3.61 VS. 1.00±0.00)(P＜0.05);卵巢获得超排供体组中占45.51%比例的卵处于MⅡ期，而超排受体组52.94%比例的卵处于MⅠ期。

表 1 rhFSH剂量对食蟹猴卵泡发育的影响(Mean±SD) Table 1 The effect on follicular development of Macaca fascicularis with different rhFSH injection dose(Mean±SD)

表选项

为了找到与超排供体组排卵周期同步的食蟹猴，检测每实验批次食蟹猴血清中E2浓度的变化(即E2曲线)来初步判断超排供体组有无排卵和有无排卵周期同步的受体食蟹猴。一般食蟹猴从注射rhFSH的第7天起，其体内E2的水平逐渐升高，并出现峰值，当天注射rhCG，引起E2急速下降，从而诱发排卵。从图 1可以看出，超排受体组和超排供体组的E2水平变化模式一致，2组水平浓度差异无统计学意义，于注射rhCG当日，E2浓度达到最高值(410.15 pg·mL^-1±207.47 pg·mL^-1 VS. 433.38 pg·mL^-1±208.68 pg·mL^-1)，而自然受体组对照血清中各采样点E2水平偏低，峰值仅为75.42 pg·mL^-1±22.32 pg·mL^-1。

图 1 不同rhFSH剂量对食蟹猴血清E2浓度的影响 Fig. 1 The effect on E2 concentration in serum

图选项

每实验批次中，以超排供体食蟹猴的E2曲线为参考标准，所有实验批次中超排受体组与超排供体组排卵同期化的准确率为5/6(83.33%)，而月经周期相差3 d以内的自然受体组排卵同期化的准确率仅为9/21(42.85%)。 3 讨论

相关繁殖技术在NHP的应用已有20多年的历史，通常是体外卵母细胞/早期胚胎的获得和通过胚胎移植建立怀孕(Bavister，2004)。目前，NHP刺激卵泡发育研究主要集中在使用促性腺激素种类、注射时间和剂量方面。近来，在恒河猴M. mulatta中应用合成的人促性腺激素，如人促卵泡激素(human follicular stimulating hormone，hFSH)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，获得了较好的超排效果(Schramm et al.，2002)，提高了卵母细胞的质量和受精后早期胚胎的发育质量(Yang et al.，2007)。早期研究表明PVP缓释剂可提高奶牛排卵数量(Yamamoto et al.，1994)，可使绵羊Ovis aries超排有效率达到80%，且卵巢上无大卵泡存留(曾培坚等，1996);本研究中应用30%的PVP溶解rhFSH单次注射方案对食蟹猴进行超排，超排受体全部有反应，表明PVP既促进了少量卵泡的发育，又能使超排受体及时排卵，其缓释促排作用在灵长类动物中可获得较好的应用效果。

在灵长类动物疾病转基因模型建立的过程中，如何准确把握受体的排卵时间是胚胎移植程序中最重要的技术环节。灵长类动物排卵受体内激素水平调控。MⅡ 期成熟的卵泡是在E2峰值出现后的24 h发生排卵反应的，而在排卵后约12 h，体内黄体素大量分泌，因此，常常使用分析灵长类动物血清中E2峰值的方法来评估排卵时间。Sun等(2008)研究结果暗示E2峰值出现后的24~36 h并伴随受体卵巢上黄体的出现是原核期胚胎移植的最佳时期，这就意味着超排供体和移植受体的排卵时间是一致的，或仅相差12 h左右。而在本研究中，采用30%的PVP溶解低剂量的rhFSH单次注射技术，可有效提高超排供体和超排受体排卵同期化的比例。

本研究表明以每日晨单次注射30%PVP溶解的rhFSH 25 IU/只剂量的方式，可获得与超排供体排卵同期化准确率较高的移植受体。