随着分子生物学技术的飞速发展，分子营养学也发展成为一个崭新的研究方向。研究已表明，饲料营养素的改变以及添加剂的补充均会显著影响某些基因的表达水平，从而引起养殖动物在生长代谢和免疫水平上的改变，但目前在水产动物上的应用仍处于起步阶段。饲料中添加海藻酸钠可诱导斑节对虾Penaeus monodon中β-1，3-葡聚糖结合蛋白(β-1，3-glucan binding protein，BGBP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、细胞粘连因子(peroxinectin，PE)、对虾素-5(penaeidin-5，PA-5)和单一乳清酸性蛋白域蛋白(single whey acidic protein domain protein，SWDP)基因表达量的上调，而对酚氧化酶原(prophenoloxidase，proPO)的表达没有显著影响(Liu et al. ，2006)。在凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei饲料中添加β-1，3-葡聚糖，投喂6~24 h后，对对虾素-3a(penaedin-3a，PEN-3)、溶菌酶(Lysozyme)和锰超氧化物歧化酶(cMnSOD)的表达量即有显著影响;投喂7 d后，对BGBP和脂多糖与β-1，3-葡聚糖结合蛋白(lipopolysaccharide and β-1，3-glucan binding protein，LGBP)的表达均有显著的诱导作用(Wang et al. ，2008)。饲料中添加30 mg Cu/kg的蛋氨酸铜可显著提高凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体的mRNA表达水平，从而提高虾体的抗菌能力(郭腾飞等，2012)。 酚氧化酶原系统是虾重要的免疫防御系统，主要以无活性的酶原形式(proPO)储存在颗粒细胞的颗粒中，酚氧化酶原系统是一个由proPO、酚氧化酶(PO)、模式识别蛋白和多种丝氨酸蛋白酶等构成的一个复杂的级联反应。BGBP作为一种模式识别受体，在甲壳动物的先天免疫中发挥重要作用，它识别结合病原体的β-1，3-葡聚糖后激活酚氧化酶原系统。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase activating factor，PPAF)是proPO被激活为PO的重要因子。PE是酚氧化酶原系统中的重要免疫因子，伴随proPO的激活，PE也获得其生物学活性，通过结合到颗粒细胞表面特定受体上来促进对较大异物的包埋，所形成的包埋物通常被PO产生的黑色素所黑化，PE与PO共同完成免疫反应(郭慧等，2013)。proPO1、proPO2、BGBP、PPAF和PE在酚氧化酶原系统中均发挥重要作用，本研究选用这些基因作为目标基因，分析它们的表达量对饲料铜离子含量的响应。 铜是虾体内多种重要酶和蛋白质的组成成分，其中包括PO。研究表明饲料中适宜的铜离子含量可显著提高对虾血清的PO活力(郭志勋等，2003;董晓慧等，2007)，但其具体的调控机理仍不明确。在本研究中，以不同铜添加水平饲料饲喂斑节对虾8周，应用实时荧光定量PCR的方法分析铜添加水平对酚氧化酶原系统相关基因(proPO1、proPO2、PE、PPAF和BGBP)表达水平的影响，探讨铜离子的营养免疫作用机理，并为铜离子在虾类饲料中的添加应用提供分子营养学的理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料与试剂

斑节对虾于5月购自广东省珠海市某私人养殖场。购入后在实验室系统中驯养1周以适应环境，驯养期间投喂基础饲料(表 1)。选取附肢完整、无病患、处于蜕皮间期的个体作为实验用虾，初始平均体重为2.98 g± 0.04 g，随机分配到养殖桶中，每桶放养35尾。养殖桶为圆形塑料桶，放水约200 L，每个饲料组3个重复。DNA marker、PCR试剂盒(Taq Mix)购自东盛公司;Trizol RNA提取试剂、反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)、荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq^TM)均购自大连TaKaRa公司;焦炭酸二乙酯(DEPC)和琼脂粉均购自上海生工生物工程有限公司，其他试剂为国产分析纯。所有使用的器具和耗材经过RNase free处理。

表 1 基础饲料的组成(%) Table 1 Composition of the basal diet(%)

表选项

基础饲料的组成和营养成分见表 1。以硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)为铜源，设置6个饲料组，分别添加铜离子含量为0 mg·kg^-1(基础饲料，对照组)、10 mg·kg^-1、25 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1、55 mg·kg^-1和110 mg·kg^-1饲料，实际测得饲料中的铜离子含量分别为6.57 mg·kg^-1、15.8 mg·kg^-1、30.7 mg·kg^-1、45.8 mg·kg^-1、61.9 mg·kg^-1和115 mg·kg^-1饲料。各饲料原料进行粉碎，过60目筛，然后加入脂肪源和水进行混合，用饲料机制成颗粒饲料，60 ℃烘箱烘干后，置于-10 ℃保存备用。 1.3 对虾的养殖

对虾的养殖在室内循环过滤系统中进行。养殖盐度20‰，温度22~28 ℃，pH7.9~8.0，养殖期间不间断充氧，溶氧量6.5~6.9 mg·L^-1。每日投喂量为对虾体重的4%，每2周称重调整投喂量，每日投喂3次，分别于08∶ 30、11∶ 30和18∶ 00投喂。养殖周期为8周。取样前停食一天，选取健康状况良好、无病患、处于蜕皮间期的个体进行取样。 1.4 血细胞总RNA提取

养殖8周后进行取样。用2.5 mL一次性注射器吸取预冷的抗凝剂(葡萄糖20.5 g·L^-1，柠檬酸钠8 g·L^-1，氯化钠4.2 g·L^-1，pH7.5)，然后从虾的围心腔抽取等量的血淋巴，800×g、4 ℃离心10 min，弃上清，沉淀为血细胞，用于总RNA提取。应用Trizol RNA提取试剂进行总RNA提取，具体方法参考说明书进行。得到的RNA样品用1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，取2 μL利用NanoDrop ND-100 Spectrophotometer测定RNA浓度和纯度，测定OD_260/280，数值在1.9~2.0之间的RNA作为反转录模板。 1.5 cDNA第一链的合成

根据RNA浓度用焦碳酸二乙酯(DEPC)水进行稀释，在10 μL的反转率体系中加入500 ng RNA作为反转录模板。实验使用TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，按照说明书步骤进行。 1.6 表达定量

从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库查找所需基因的cDNA序列，根据查找到的序列利用Primer Premier 5软件进行引物的设计或者参考文献中的引物，各基因的引物序列、扩增长度及基因库序列号见表 2，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。荧光定量PCR实验使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒，实验步骤按照说明书进行。所得数据以ABI 7500 SDS进行分析，以β-actin作为内参，根据目的基因和β-actin的Ct值用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。每个样品做3个重复。

表 2 荧光定量PCR引物 Table 2 Primers used in quantitative real-time PCR study

表选项

PO活力的测定参考Huang等(2010)的方法，以左旋多巴(L-DOPA)为特异性底物。分别取30~50 mL血清，与800 mL L-DOPA(用0.1 M pH6.6的磷酸钾缓冲液配制，磷酸钾缓冲液:38.1 mL 1 M K₂HPO₄，61.9 mL 1 M KH₂PO₄)充分混合，立刻读取490 nm波长下的光密度值，每10 s读数一次，共读数120 s。PO活性单位定义:1 mL血清每分钟OD₄₉₀增加0.001为一个PO活力单位(U·mL^-1)。 1.8 统计分析

结果显示为平均值±标准差(Mean±SD)。实验数据利用SPSS 13.0进行Tukey单因素方差分析，P＜0.05确认为差异显著。 2 结果 2.1 对proPO基因表达的影响

饲料铜添加量对proPO1基因表达的影响如图 1所示，当铜添加量为10 mg·kg^-1和25 mg·kg^-1时，proPO1的表达量相对对照组无显著变化(P>0.05);当添加量为 40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时，proPO1的表达量相对对照组有显著的提高(P＜0.05);添加量为110 mg·kg^-1时，proPO1的表达量下降，显著低于40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1组(P＜0.05)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。 饲料铜添加量对proPO2基因表达的影响如图 2所示，当铜添加量为10 mg·kg^-1时，proPO2的表达量相对对照组无显著变化(P>0.05);当添加量为25 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时，proPO2的表达量相对对照组有显著的提高(P＜0.05);添加量为110 mg·kg^-1时，proPO2的表达量下降，显著[KG(18x]低于10 mg·kg^-1、25 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1组(P＜0.05)，低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图 1 铜添加量对proPO1基因表达的影响 Fig. 1 Effect of copper supplementation on gene expression of proPO1 注Note:不同的上标字母表示组间的差异有统计学意义(P＜0.05); 下图同。Different superscripts indicate significant difference between treatments(P＜0.05)，the same below.

图选项

图 2 铜添加量对proPO2基因表达的影响 Fig. 2 Effect of copper supplementation on gene expression of proPO2

图选项

饲料铜添加量对PE基因表达的影响如图 3所示，当铜添加量为10 mg·kg^-1时，PE的表达量相对对照组无显著变化(P>0.05);当添加量为25 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时，PE的表达量相对对照组有显著的提高(P＜0.05)，PE 的表达量在铜添加量为40 mg·kg^-1时最高;添加量为110 mg·kg^-1时，PE的表达量下降，显著低于40 mg·kg^-1组(P＜0.05)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

图 3 铜添加量对PE基因表达的影响 Fig. 3 Effect of copper supplementation on gene expression of PE

图选项

饲料铜添加量对PPAF 基因表达的影响如图 4所示，当铜添加量为10 mg·kg^-1时，PPAF的表达量相对对照组无显著变化(P>0.05);当添加量为25 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时，PPAF的表达量相对对照组有显著的提高(P＜0.05);添加量为110 mg·kg^-1时，PPAF的表达量下降，显著低于10 mg·kg^-1、25 mg·kg^-1、40mg·kg^-1和55 mg·kg^-1组(P＜0.05)，低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图 4 铜添加量对PPAF基因表达的影响 Fig. 4 Effect of copper supplementation on gene expression of PPAF

图选项

饲料铜添加量对BGBP基因表达的影响如图 5所示，各饲料组间的BGBP表达量变化均无统计学意义(P>0.05)。

图 5 铜添加量对BGBP基因表达的影响 Fig. 5 Effect of copper supplementation on gene expression of BGBP

图选项

饲料铜添加量对PO活力的影响如图 6所示，铜添加量为25~55 mg·kg^-1时，血清PO活力显著高于对照组(P＜0.05)，添加量为10 mg·kg^-1和110 mg·kg^-1时，血清PO活力与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

图 6 铜添加量对PO活力的影响 Fig. 6 Effect of copper supplementation on PO activity

图选项

铜离子是甲壳动物重要的必需微量元素，但同时又是具有潜在毒性威胁的重金属元素，其摄入量的多少对甲壳动物的生长、生理、免疫甚至存活都至关重要。关于虾类生长和免疫对铜的需求量的研究已较多，这些研究均表明饲料中添加一定含量的铜离子可显著提高虾类的生长性能、免疫功能及抗胁迫能力(刘发义等，1990;阳会军等，2001;Lee & Shiau，2002;郭志勋等，2003;董晓慧等，2007;周萌等，2010;郭腾飞等，2012;冼健安，王安利，2013;冼健安等，2013)。

PO是一种铜蛋白，研究已表明铜摄入量的不足和过量均会导致虾类PO活力的下降(郭志勋等，2003;董晓慧等，2007)。本研究结果显示，饲料中铜水平对PO的酶原(proPO)在转录水平上有显著影响。proPO1的表达量在铜添加量为40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时显著提高，proPO2则在25 mg·kg^-1时开始出现显著提高，表明proPO2对铜的摄入量更为敏感;当铜离子添加过量(110 mg·kg^-1)时，proPO1和proPO2的表达量均受到抑制，proPO1下降至对照组水平，proPO2则低于对照组，也暗示proPO2对铜离子的摄入量更为敏感。但就表达量变化而言，当铜添加量均为40 mg·kg^-1和55 mg·kg^-1时，proPO1的表达量约为对照组的5.5倍，而proPO2的表达量约为对照组的4.5倍，proPO1表达量的增幅大于proPO2，这些结果表明proPO1和proPO2在功能上可能存在一定的协同互补作用。

PE是酚氧化酶原系统的重要组分之一。伴随proPO的激活，PE获得其生物学活性，包括其过氧化物酶活性、调节细胞粘着、加强组装、促进吞噬作用、抗氧化作用、通过结合到颗粒细胞表面特定受体上来促进对较大异物的包埋等，所形成的包埋物通常被黑化，PE与PO共同完成免疫反应(郭慧等，2013)。在本研究中，PE的表达量也受饲料铜添加量的影响。与proPO2的变化相似，PE表达量在铜添加量为25~55 mg·kg^-1时有显著的提高，在110 mg·kg^-1时受到抑制。表明PE是酚氧化酶原系统不可缺少的重要免疫因子，当proPO的表达量上升时，PE的表达量也伴随着上升，共同协作发挥免疫作用。

PPAF作为proPO转化为活性PO的必需因子，其表达水平也伴随着proPO表达水平的变化而变化。PPAF也在铜添加量为25~55 mg·kg^-1时表达量显著上调，在110 mg·kg^-1时下调，变化情况与proPO2和PE相似。

BGBP是机体识别病原体的重要蛋白，当BGBP与β-1，3-葡聚糖结合后，会诱导血细胞进行脱颗粒释放酚氧化酶原系统(郭慧等，2013)。

本研究发现，饲料铜添加量对血细胞中BGBP的表达量没有显著的影响。可能是由于在没有病原体刺激的情况下，BGBP含量已足以满足基础免疫防御功能的需要，其在血细胞中的表达量相对稳定，不受铜离子摄入量的影响，同时也表明血细胞中proPO1、proPO2、PE和PPAF的表达与BGBP的表达无直接联系。 本研究结果表明，铜作为PO的组分之一，其摄取量会影响酚氧化酶原系统中几个重要基因的表达水平，一定含量的饲料铜离子能够诱导proPO、PE和PPAF基因表达水平的上调。笔者以往的研究发现，饲料中补充适量的铜离子对斑节对虾的血细胞总数没有显著影响，但可提高颗粒细胞的比例(冼健安，王安利，2013)，因此饲料中添加铜离子可诱导PO活力的上升，主要有两方面的原因:一是诱导酚氧化酶原系统相关基因表达量的上调，二是提高了储存酚氧化酶原系统颗粒细胞的比例。根据本文研究的结果，针对提高斑节对虾酚氧化酶原系统免疫功能，在本基础饲料中适宜的铜添加范围为25~55 mg·kg^-1。