四川动物  2015, Vol. 34(2) 264-269

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潘延乐1,2, 汪开毓1,2*, 杨洁4, 阳磊1,2, 吉莉莉1,2, 耿毅1,2, 陈德芳3
PAN Yanle1,2, WANG Kaiyu1,2*, YANG Jie4, YANG Lei1,2, JI Lili1,2, GENG Yi1,2, CHEN Defang3
鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白N基因PCR快速检测方法的建立
Rapid Detection for Outer Membrane Porin Protein N Gene of Edwardsiella ictaluri by PCR
四川动物, 2015, 34(2): 264-269
Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(2): 264-269
10.3969/j.issn.1000-7083.2015.02.017

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收稿日期:2014-08-30
接受日期:2014-10-17
鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白N基因PCR快速检测方法的建立
潘延乐1,2, 汪开毓1,2 , 杨洁4, 阳磊1,2, 吉莉莉1,2, 耿毅1,2, 陈德芳3    
1. 四川农业大学鱼病研究中心, 四川雅安 625014;
2. 四川农业大学动物疫病与人健康四川省重点实验室, 四川雅安 625014;
3. 四川农业大学水产养殖系, 四川雅安 625014;
4. 宜宾市翠屏区水务局, 四川宜宾 644000
摘要:根据GenBank中鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri外膜微孔蛋白N(porin N)基因序列(GenBank No: NC_012779.2)设计了1对引物,预计目的片段大小为381 bp。通过对反应体系和条件的优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染组织样品检测,建立了一种快速检测鮰爱德华氏菌的PCR方法。结果表明,在所检测的鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、不动杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、拟态弧菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌15种细菌中仅鮰爱德华氏菌扩增出特异性条带;敏感性试验结果显示,该方法最小核酸检出量为9.35×10-3 ng·μL-1;同时对人工感染的病料肝脏、细菌基因组DNA、细菌菌液及菌落进行扩增,结果显示4种材料均能检测出大小为381 bp的基因片段。本研究所建立的方法特异强、灵敏度高,适用于鮰爱德华氏菌感染病例的高效、快速检测。
关键词鮰爱德华氏菌     外膜微孔蛋白基因     PCR    
Rapid Detection for Outer Membrane Porin Protein N Gene of Edwardsiella ictaluri by PCR
PAN Yanle1,2, WANG Kaiyu1,2 , YANG Jie4, YANG Lei1,2, JI Lili1,2, GENG Yi1,2, CHEN Defang3    
1. Fisheries Department, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province 625014, China;
2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province 625014, China;
3. Department of Aquaculture, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province 625014, China;
4. Cuiping District of Yibin Municipal Water Affairs Bureau, Yibin, Sichuan Province 644000, China
Abstract:Specific primers were designed and conducted to amplify a 381 bp DNA frangment from the gene (GenBank, NC_012779.2) encoding a outer membrane porin protein in Edwardsiella ictaluri. The PCR reaction system and reaction conditions were optimized. The specificity and sensitivity of this assay were tested on both normal and infected samples. The results from specific tests showed that the E. ictaluri strain GPY was the only strain that could be detected by this method among all the tested strains. The minimal concentration of DNA that can be detected by this method was 9.35×10-3 ng·μL-1. Moreover, the liver that artificially infected with E. ictaluri, bacterial genomic DNA, bacterial liquid and bacterial colonies were also tested. The 381 bp DNA fragment could be detected from all these materials. In conclusion, the established PCR in this study was specific, sensitive and rapid for the epidemiological surveillance of E. ictaluri infection in channel catfish. Therefore, a rapid method to detect E. ictaluri by PCR was established.
Key words: Edwardsiella ictaluri     outer membrane porin protein     PCR    

鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri为革兰氏阴性杆菌,属于肠杆菌科Enterobacteriaceae爱德华氏菌属Edwardsiella,能引起斑点叉尾鮰肠道败血症(enteric septicemia of catfish,ESC)。此外该菌还能感染黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco、日本鳗鲡Anguilla japonica、观赏鱼类、两栖类和人(肖克宇,黄志坚,1997;Hou et al.,1999;耿毅等,2010;Woo et al.,2011)。鮰爱德华氏菌病一旦暴发便很难控制,而常规检测鮰爱德华氏菌的方法费时、费力,要经过菌株的扩增、选择性培养、理化鉴定等一系列复杂的过程,操作繁琐,且敏感性、特异性较低,检出率不高,不利于及时准确诊断鮰爱德华氏菌病。因此,为了弥补常规检测方法的不足,有必要建立一种高效、快速、简便的检测技术。目前报道的鮰爱德华氏菌检测方法主要有单克隆免疫荧光法、酶免疫染色法(ELISA)和实时荧光定量PCR法,虽然这3种方法有较好的特异性和敏感性,对大量鱼群进行普查时较为有用,但康复后的鱼依然会被检出,而且需要购置昂贵的仪器设备,对人员要求较高,操作复杂,加上ELISA需要制备特异性抗血清,鱼类的品种繁多,制备的抗体不具有广谱性,在基层单位难以普及和应用(Al-Soud et al.,2000; Al-Soud & Rådström,2000;Lantz et al.,2000)。[JP2]随着分子生物学检测技术的不断发展,特别是PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时等特点,病原菌检测技术的研究已经发展到了一个全新的阶段。因此,本试验根据鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白porin N基因序列设计了一段特异性较高的引物序列,建立了一种快速简便的鮰爱德华氏菌特异性PCR检测方法,以期能在致病性鮰爱德华氏菌诊断中发挥积极作用。

外膜微孔蛋白(outer membrane porin protein,Porin)广泛存在于革兰氏阴性细菌中,镶嵌于细胞壁表面,是跨膜蛋白,具有良好的渗透性和免疫原性(Jalajakumari & Manning,1990;Nandi et al.,2005;Yu et al.,2013),并与细菌的致病性具有直接关系,在细菌的免疫保护和鉴定中具有重要作用(邹海杰等,2012)。研究表明弧菌Vibrio、大肠杆菌Escherich coli、沙门氏菌Salmonella、嗜水气单胞菌Aeromonas spp.等均具有Porin并且有良好的免疫原性。弧菌和嗜水气单胞菌ompW基因存在于所有已知弧菌和大部分气单胞菌中,具有良好的免疫原性并且相对保守,可以用于气单胞菌的鉴定(Jalajakumari & Manning,1990;Maiti et al.,2009)。已有学者分别用外膜[JP2]微孔蛋白基因成功诊断出鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer病(胡清海,刘晓文,2002;林树乾等,2009;孙龚等,2011;么乃全等,2013)、奶牛布鲁氏杆菌Brucella abortus病(杨莲茹等,2007)、猪传染性胸膜肺炎(彭小华等,2006)。在水产养殖业上,梁利国等(2010)建立了用ompK基因检测哈氏弧菌Vibrio harveyi的PCR诊断方法。但对鮰爱德华氏菌porin N基因作为PCR诊断方法的研究尚未见报道。 1 材料与方法 1.1 实验菌株

鮰爱德华氏菌标准菌株购于ATCC菌种库(编号:33202);其他试验菌株见表 1

表 1 本研究试验菌株 Table 1 The tested strains
1.2 试剂与仪器

组织DNA抽提试剂盒(批号:DV811A),rTaq DNA聚合酶、25 mmol·L-1 Mg2+、10×Buffer(Mg2+ free)、dNTP Mixture、DNA1000 Marker、DNA2000 Marker、DNA10000 Marker均购自大连宝生物工程有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒(批号:DV810A),Gold View购于天根生化科技(北京有限公司);脑心浸液培养基、胰蛋白胨、酵母抽提物购自OXOID公司;琼脂粉购自Promega公司;其他试剂均为分析纯。

C1000TM Thermal Cycler(MJ Research)PCR仪;DYCP-31D型水平电泳槽;TD-10K型高速冷冻离心机;THS-H恒温振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂);Bio-Rad生物电泳图像分析系统;Nanophotometer Pearl核酸蛋白仪。 1.3 引物设计及合成

根据GenBank中的porin N基因(GenBank No. NC_012779.2)序列设计引物,上游引物F:5’-GAGATTTACAACCAGAACG-3’,下游引物R:5’-TTAGAACTGGTAAACC-3’,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.4 porin N基因PCR诊断方法的建立 1.4.1 PCR反应条件的优化

以鮰爱德华氏菌GPY基因组DNA为模板进行PCR反应:在进行序列扩增前首先进行模拟并优化PCR反应体系,采用25 μL反应体系,其中含有无菌ddH2O 10.5 μL,6.125 mmol·L-1 Mg2+ 6 μL,10×Buffer(Mg2+ free)2.5 μL,模板DNA 2.5 μL,2.5 mmol·L-1 dNTP Mixture 2 μL,10 μmol·L-1引物各0.5 μL,rTaq DNA聚合酶0.5 μL。[JP3]最终确立PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,56.2 ℃复性30 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;最后72 ℃温育10 min。PCR产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳后检测。 1.4.2 PCR方法的特异性试验

应用已优化的PCR反应体系对鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、不动杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、拟态弧菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA进行扩增,产物进行电泳鉴定。 1.4.3 PCR方法的敏感性试验

以鮰爱德华氏菌GPY菌株的基因组DNA为模板。核酸蛋白仪测定基因组DNA含量,将基因组DNA进行10倍梯度稀释,每个稀释度分别取2.5 μL作为模板进行PCR扩增,产物经电泳鉴定。 1.4.4 临床分离株的PCR检测

利用所建立的PCR检测方法对来自四川眉山、乐山、汉源、雅安、湖北、河南、广西等地的7株鮰爱德华氏菌进行扩增,凝胶电泳比较其与16S rRNA细菌学鉴定结果的符合率,验证所建立PCR方法的准确性。 1.4.5 检测材料选择对比试验

选取人工感染病鱼的肝脏组织提取组织DNA、菌液DNA、菌液和菌落作为检测材料。DNA样品在进行PCR时,取2.5 μL作为扩增模板;菌落、菌液进行PCR扩增时,分别用灭菌牙签挑取单个菌落和取2.5 μL菌液作为模板。其他PCR反应体系不变,进行PCR扩增,产物经电泳鉴定。 2 结果 2.1 鮰爱德华氏菌GPY菌株的porin N基因的克隆及序列比对分析

以GPY和ATCC标准菌株基因组DNA为模板,扩增porin N基因序列,经琼脂糖电泳结果显示扩增出大小为381 bp的目的条带(图 1)。测序结果经BLASTN比对,显示其与已知鮰爱德华氏菌93~146基因组DNA基因序列同源性达99%(图 2)。

图 1 鮰爱德华氏菌GPY菌株porin N基因克隆 Fig. 1 Cloning of porin N gene of Edwardsiella ictaluri strain M. DNA分子质量标准,1. 鮰爱德华氏菌GPY,2. 鮰爱德华氏菌ATCC33202,3. 阴性对照。
M. DL1000 DNA Marker,1. The strain of E. ictaluri GPY,2. The strain of E. ictaluri(ATCC33202),3. Negative control.

图 2 鮰爱德华氏菌porin N与同源基因序列系统发育树 Fig. 2 The phylogenetic tree of the porin N of Edwardsiella ictaluri and its homologous of the reference strains
2.2 PCR反应条件的优化

8个退火温度中,56.2 ℃在381 bp处出现了清晰的目的条带,而其他几个退火温度扩增的目的条带亮度较弱,故选择56.2 ℃为PCR反应体系的退火温度(图 3)。

图 3 最佳退火温度的筛选 Fig. 3 Screening of optimial annealing temperature M. DNA分子质量标准DL1000 DNA Marker,1. 55.0 ℃,2. 55.4 ℃,3. 56.2 ℃,4. 57.4 ℃,5. 58.8 ℃,6. 60.0 ℃,7. 60.7 ℃,8. 61.0 ℃,9. 阴性对照Negative control.
2.3 PCR方法的特异性试验

用建立的PCR反应体系对鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)、鮰爱德华氏菌GPY、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、不动杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、拟态弧菌基因组DNA分别进行PCR扩增,只有标准菌株和鮰爱德华氏菌GPY扩增出381 bp基因片段,而其他菌均未见任何条带(图 4)。

图 4 特异性检测试验 Fig. 4 Specificity detection of PCR method M. DNA分子质量标准DL1000 DNA Marker,1. 鮰爱德华氏菌The strain of Edwardsiella ictaluri(ATCC 33202),2. 阳性对照Positive control,3. LT1,4. FF101,5. XJJ01,6. ZD3,7. ZZF07,8. CCF0024,9. FF003,10. DGX01,11. JT-0603,12. CCF00021,13. 44,14. G100814,15. 25922,16. SCCF05,17. 阴性对照Negative control.
2.4 PCR方法的敏感性试验

梯度稀释的基因组DNA的扩增结果见图 5。基因组起始浓度为93.5 ng·μL-1。模板基因组DNA在100~10-4稀释时均于381 bp处扩增出目的条带,因此建立的PCR方法最小检出量为9.35×10-3 ng·μL-1

图 5 PCR方法的敏感性试验 Fig. 5 Sensitivity test of PCR method M. DNA分子质量标准DL1000 DNA Marker,1. 鮰爱德华氏菌The strain of Edwardsiella ictaluri(ATCC33202),2. 阳性对照Positive control,3. 9.35 ng·μL-1,4. 9.35×10-1 ng·μL-1,5. 9.35×10-2 ng·μL-1,[JP2]6. 9.35×10-3 ng·μL-1,7. 9.35×10-4 ng·μL-1,8. 9.35×10-5 ng·μL-1,9. 阴性对照Negative control.
2.5 检测材料选择试验

以菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液、菌落4种材料为模板,用确定的最佳反应体系和反应程序进行PCR扩增并电泳,结果表明均能扩增出381 bp的特异性目的条带(图 6)。

图 6 不同试验材料检测 Fig. 6 The detection of different materials M. DNA分子质量标准,1. 阳性对照,2. 菌液,3. 菌液基因组DNA,4. 病鱼肝脏DNA,5. 菌落,6. 阴性对照。
M. DL1000 Marker,1. Positive control,2. Bacterium solution,3. Genomic DNA of bacteria,4. The liver tissue DNA from artificial infection,5. Colonies of bacteria,6. Negative control.
2.6 临床分离株的PCR检测

通过对来自四川眉山、乐山、汉源、雅安、湖北、河南、广西等地的不同来源分离株基因组DNA进行扩增,在381 bp处均扩增出清晰的目的条带(图 7),PCR检测结果与16S rRNA分离鉴定结果一致。

图 7 临床分离株的PCR检测 Fig. 7 PCR detection of clinical isolates M. DNA分子质量标准DL1000 DNA Marker,1. 鮰爱德华氏菌The strain of Edwardsiella ictaluri(ATCC 33202),2. 阳性对照Positive control,3. CGX,4. LW101,5. LW102,6. HSN-1,7. HSS-1,8. HAS-1,9. HAS-2,10. 阴性对照Negative control.
3 讨论

斑点叉尾鮰是鮰爱德华氏菌最易感鱼种,该菌易引起斑点叉尾鮰患ESC,在我国南方大部分地区如广东、湖北、湖南、四川、重庆等地均有发生,该病发病率和死亡率高,现已成为斑点叉尾鮰养殖业危害最大的传染病之一(Schneider et al.,2003)。近年来由于集约化养殖的发展以及抗生素的滥用,致使斑点叉尾鮰ESC病害愈发严重。有学者指出,控制该病最有效的方法是快速而准确的病原检测(Bader et al.,2003)。病原分离和生化实验为传统病原检测和鉴定方法,但耗时较长,至少需要4~6 d,待确诊后该病早已蔓延,不利于疾病的控制(Klesius,1994;Bilodeau et al.,2003)。本研究建立的PCR诊断方法具有检测速度快、特异性好、敏感性高等优点,在早期疾病诊断中具有良好的应用前景。

本实验通过对GPY菌株的外膜porin N基因进行扩增后发现该基因的存在,且序列对比分析显示,该基因与已经报道的鮰爱德华氏菌(CP001600.2)的同源性达99%,利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物,从患病斑点叉尾鮰体内分离得到的鮰爱德华氏菌为阳性株,成功扩增出了一个长度381 bp左右的基因片段。在所选的15种常见鱼类病原菌中只有鮰爱德华氏菌GPY扩增出381 bp的基因片段,揭示该方法在这15种菌中具有较高特异性,可用于鮰爱德华氏菌的鉴定。建立的PCR诊断方法对鮰爱德华氏菌DNA的最低检出量为9.35×10-3 ng·μL-1,灵敏度较高。同时用此方法对人工感染的病料组织总DNA、菌液基因组DNA、菌落及菌液进行检测,结果均为阳性,与细菌16S rRNA分离鉴定的结果一致。证实本试验建立的PCR快速检测方法不仅特异性高,敏感性好,缩短了检测时间,简化了操作步骤,而且成本低,同时对采样和病料的保存也降低了要求。应用该PCR方法进行临床检测时,可以根据实际情况选择不同的检测材料,并根据病情的实际情况进行合理选材,相互验证试验结果的准确性。[JP2]为进一步验证所建立的方法的准确性,本研究还对临床分离到的7株细菌进行了PCR、16S rRNA基因测序2种方法的比较。结果显示该PCR方法诊断结果与基于细菌16S rRNA基因序列进行的分类结果一致。表明所建立的PCR方法可以用于鮰爱德华氏菌的鉴定和分子流行病学调查,丰富了鮰爱德华氏菌的检测手段,为鮰爱德华氏菌的快速鉴定提供了新方法,为后续研究奠定了理论基础。

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