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文章信息
- 潘延乐1,2, 汪开毓1,2*, 杨洁4, 阳磊1,2, 吉莉莉1,2, 耿毅1,2, 陈德芳3
- PAN Yanle1,2, WANG Kaiyu1,2*, YANG Jie4, YANG Lei1,2, JI Lili1,2, GENG Yi1,2, CHEN Defang3
- 鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白N基因PCR快速检测方法的建立
- Rapid Detection for Outer Membrane Porin Protein N Gene of Edwardsiella ictaluri by PCR
- 四川动物, 2015, 34(2): 264-269
- Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(2): 264-269
- 10.3969/j.issn.1000-7083.2015.02.017
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文章历史
- 收稿日期:2014-08-30
- 接受日期:2014-10-17
2. 四川农业大学动物疫病与人健康四川省重点实验室, 四川雅安 625014;
3. 四川农业大学水产养殖系, 四川雅安 625014;
4. 宜宾市翠屏区水务局, 四川宜宾 644000
2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province 625014, China;
3. Department of Aquaculture, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province 625014, China;
4. Cuiping District of Yibin Municipal Water Affairs Bureau, Yibin, Sichuan Province 644000, China
鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri为革兰氏阴性杆菌,属于肠杆菌科Enterobacteriaceae爱德华氏菌属Edwardsiella,能引起斑点叉尾鮰肠道败血症(enteric septicemia of catfish,ESC)。此外该菌还能感染黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco、日本鳗鲡Anguilla japonica、观赏鱼类、两栖类和人(肖克宇,黄志坚,1997;Hou et al.,1999;耿毅等,2010;Woo et al.,2011)。鮰爱德华氏菌病一旦暴发便很难控制,而常规检测鮰爱德华氏菌的方法费时、费力,要经过菌株的扩增、选择性培养、理化鉴定等一系列复杂的过程,操作繁琐,且敏感性、特异性较低,检出率不高,不利于及时准确诊断鮰爱德华氏菌病。因此,为了弥补常规检测方法的不足,有必要建立一种高效、快速、简便的检测技术。目前报道的鮰爱德华氏菌检测方法主要有单克隆免疫荧光法、酶免疫染色法(ELISA)和实时荧光定量PCR法,虽然这3种方法有较好的特异性和敏感性,对大量鱼群进行普查时较为有用,但康复后的鱼依然会被检出,而且需要购置昂贵的仪器设备,对人员要求较高,操作复杂,加上ELISA需要制备特异性抗血清,鱼类的品种繁多,制备的抗体不具有广谱性,在基层单位难以普及和应用(Al-Soud et al.,2000; Al-Soud & Rådström,2000;Lantz et al.,2000)。[JP2]随着分子生物学检测技术的不断发展,特别是PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、省时等特点,病原菌检测技术的研究已经发展到了一个全新的阶段。因此,本试验根据鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白porin N基因序列设计了一段特异性较高的引物序列,建立了一种快速简便的鮰爱德华氏菌特异性PCR检测方法,以期能在致病性鮰爱德华氏菌诊断中发挥积极作用。
外膜微孔蛋白(outer membrane porin protein,Porin)广泛存在于革兰氏阴性细菌中,镶嵌于细胞壁表面,是跨膜蛋白,具有良好的渗透性和免疫原性(Jalajakumari & Manning,1990;Nandi et al.,2005;Yu et al.,2013),并与细菌的致病性具有直接关系,在细菌的免疫保护和鉴定中具有重要作用(邹海杰等,2012)。研究表明弧菌Vibrio、大肠杆菌Escherich coli、沙门氏菌Salmonella、嗜水气单胞菌Aeromonas spp.等均具有Porin并且有良好的免疫原性。弧菌和嗜水气单胞菌ompW基因存在于所有已知弧菌和大部分气单胞菌中,具有良好的免疫原性并且相对保守,可以用于气单胞菌的鉴定(Jalajakumari & Manning,1990;Maiti et al.,2009)。已有学者分别用外膜[JP2]微孔蛋白基因成功诊断出鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer病(胡清海,刘晓文,2002;林树乾等,2009;孙龚等,2011;么乃全等,2013)、奶牛布鲁氏杆菌Brucella abortus病(杨莲茹等,2007)、猪传染性胸膜肺炎(彭小华等,2006)。在水产养殖业上,梁利国等(2010)建立了用ompK基因检测哈氏弧菌Vibrio harveyi的PCR诊断方法。但对鮰爱德华氏菌porin N基因作为PCR诊断方法的研究尚未见报道。 1 材料与方法 1.1 实验菌株
鮰爱德华氏菌标准菌株购于ATCC菌种库(编号:33202);其他试验菌株见表 1。
1.2 试剂与仪器组织DNA抽提试剂盒(批号:DV811A),rTaq DNA聚合酶、25 mmol·L-1 Mg2+、10×Buffer(Mg2+ free)、dNTP Mixture、DNA1000 Marker、DNA2000 Marker、DNA10000 Marker均购自大连宝生物工程有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒(批号:DV810A),Gold View购于天根生化科技(北京有限公司);脑心浸液培养基、胰蛋白胨、酵母抽提物购自OXOID公司;琼脂粉购自Promega公司;其他试剂均为分析纯。
C1000TM Thermal Cycler(MJ Research)PCR仪;DYCP-31D型水平电泳槽;TD-10K型高速冷冻离心机;THS-H恒温振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂);Bio-Rad生物电泳图像分析系统;Nanophotometer Pearl核酸蛋白仪。 1.3 引物设计及合成
根据GenBank中的porin N基因(GenBank No. NC_012779.2)序列设计引物,上游引物F:5’-GAGATTTACAACCAGAACG-3’,下游引物R:5’-TTAGAACTGGTAAACC-3’,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.4 porin N基因PCR诊断方法的建立 1.4.1 PCR反应条件的优化
以鮰爱德华氏菌GPY基因组DNA为模板进行PCR反应:在进行序列扩增前首先进行模拟并优化PCR反应体系,采用25 μL反应体系,其中含有无菌ddH2O 10.5 μL,6.125 mmol·L-1 Mg2+ 6 μL,10×Buffer(Mg2+ free)2.5 μL,模板DNA 2.5 μL,2.5 mmol·L-1 dNTP Mixture 2 μL,10 μmol·L-1引物各0.5 μL,rTaq DNA聚合酶0.5 μL。[JP3]最终确立PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,56.2 ℃复性30 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;最后72 ℃温育10 min。PCR产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳后检测。 1.4.2 PCR方法的特异性试验
应用已优化的PCR反应体系对鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、不动杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、拟态弧菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA进行扩增,产物进行电泳鉴定。 1.4.3 PCR方法的敏感性试验
以鮰爱德华氏菌GPY菌株的基因组DNA为模板。核酸蛋白仪测定基因组DNA含量,将基因组DNA进行10倍梯度稀释,每个稀释度分别取2.5 μL作为模板进行PCR扩增,产物经电泳鉴定。 1.4.4 临床分离株的PCR检测
利用所建立的PCR检测方法对来自四川眉山、乐山、汉源、雅安、湖北、河南、广西等地的7株鮰爱德华氏菌进行扩增,凝胶电泳比较其与16S rRNA细菌学鉴定结果的符合率,验证所建立PCR方法的准确性。 1.4.5 检测材料选择对比试验
选取人工感染病鱼的肝脏组织提取组织DNA、菌液DNA、菌液和菌落作为检测材料。DNA样品在进行PCR时,取2.5 μL作为扩增模板;菌落、菌液进行PCR扩增时,分别用灭菌牙签挑取单个菌落和取2.5 μL菌液作为模板。其他PCR反应体系不变,进行PCR扩增,产物经电泳鉴定。 2 结果 2.1 鮰爱德华氏菌GPY菌株的porin N基因的克隆及序列比对分析
以GPY和ATCC标准菌株基因组DNA为模板,扩增porin N基因序列,经琼脂糖电泳结果显示扩增出大小为381 bp的目的条带(图 1)。测序结果经BLASTN比对,显示其与已知鮰爱德华氏菌93~146基因组DNA基因序列同源性达99%(图 2)。
2.2 PCR反应条件的优化
8个退火温度中,56.2 ℃在381 bp处出现了清晰的目的条带,而其他几个退火温度扩增的目的条带亮度较弱,故选择56.2 ℃为PCR反应体系的退火温度(图 3)。
2.3 PCR方法的特异性试验用建立的PCR反应体系对鮰爱德华氏菌标准菌株(ATCC33202)、鮰爱德华氏菌GPY、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、不动杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、拟态弧菌基因组DNA分别进行PCR扩增,只有标准菌株和鮰爱德华氏菌GPY扩增出381 bp基因片段,而其他菌均未见任何条带(图 4)。
2.4 PCR方法的敏感性试验梯度稀释的基因组DNA的扩增结果见图 5。基因组起始浓度为93.5 ng·μL-1。模板基因组DNA在100~10-4稀释时均于381 bp处扩增出目的条带,因此建立的PCR方法最小检出量为9.35×10-3 ng·μL-1。
2.5 检测材料选择试验以菌液DNA、病鱼肝脏组织总DNA、菌液、菌落4种材料为模板,用确定的最佳反应体系和反应程序进行PCR扩增并电泳,结果表明均能扩增出381 bp的特异性目的条带(图 6)。
2.6 临床分离株的PCR检测通过对来自四川眉山、乐山、汉源、雅安、湖北、河南、广西等地的不同来源分离株基因组DNA进行扩增,在381 bp处均扩增出清晰的目的条带(图 7),PCR检测结果与16S rRNA分离鉴定结果一致。
3 讨论斑点叉尾鮰是鮰爱德华氏菌最易感鱼种,该菌易引起斑点叉尾鮰患ESC,在我国南方大部分地区如广东、湖北、湖南、四川、重庆等地均有发生,该病发病率和死亡率高,现已成为斑点叉尾鮰养殖业危害最大的传染病之一(Schneider et al.,2003)。近年来由于集约化养殖的发展以及抗生素的滥用,致使斑点叉尾鮰ESC病害愈发严重。有学者指出,控制该病最有效的方法是快速而准确的病原检测(Bader et al.,2003)。病原分离和生化实验为传统病原检测和鉴定方法,但耗时较长,至少需要4~6 d,待确诊后该病早已蔓延,不利于疾病的控制(Klesius,1994;Bilodeau et al.,2003)。本研究建立的PCR诊断方法具有检测速度快、特异性好、敏感性高等优点,在早期疾病诊断中具有良好的应用前景。
本实验通过对GPY菌株的外膜porin N基因进行扩增后发现该基因的存在,且序列对比分析显示,该基因与已经报道的鮰爱德华氏菌(CP001600.2)的同源性达99%,利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物,从患病斑点叉尾鮰体内分离得到的鮰爱德华氏菌为阳性株,成功扩增出了一个长度381 bp左右的基因片段。在所选的15种常见鱼类病原菌中只有鮰爱德华氏菌GPY扩增出381 bp的基因片段,揭示该方法在这15种菌中具有较高特异性,可用于鮰爱德华氏菌的鉴定。建立的PCR诊断方法对鮰爱德华氏菌DNA的最低检出量为9.35×10-3 ng·μL-1,灵敏度较高。同时用此方法对人工感染的病料组织总DNA、菌液基因组DNA、菌落及菌液进行检测,结果均为阳性,与细菌16S rRNA分离鉴定的结果一致。证实本试验建立的PCR快速检测方法不仅特异性高,敏感性好,缩短了检测时间,简化了操作步骤,而且成本低,同时对采样和病料的保存也降低了要求。应用该PCR方法进行临床检测时,可以根据实际情况选择不同的检测材料,并根据病情的实际情况进行合理选材,相互验证试验结果的准确性。[JP2]为进一步验证所建立的方法的准确性,本研究还对临床分离到的7株细菌进行了PCR、16S rRNA基因测序2种方法的比较。结果显示该PCR方法诊断结果与基于细菌16S rRNA基因序列进行的分类结果一致。表明所建立的PCR方法可以用于鮰爱德华氏菌的鉴定和分子流行病学调查,丰富了鮰爱德华氏菌的检测手段,为鮰爱德华氏菌的快速鉴定提供了新方法,为后续研究奠定了理论基础。
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