铝是地壳中含量第三的元素，广泛存在于自然界，由于其优良的理化性质，也被广泛运用于人们的日常生活中，如工业铝制品、铝制炊具、铝盐净水剂、食品添加剂、含铝药物等(Shaw & Marler，2013)，人们不可避免对铝的摄入。铝并非机体所需微量元素，现有研究表明，铝可在体内蓄积并引发慢性疾病，如阿尔兹海默症(Gupta et al.，2005)、骨软化症(Malluche，2002)、贫血症(Barabasz & Albińska，2002)等。慢性铝负荷也可导致肝细胞结构损害和肝功能异常(Bogdanovi et al.，2008;Türkez et al.，2010;Viezeliene et al.，2011)，但其机制至今尚不完全清楚。

5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LO)是机体催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA)生成白三烯(leukotrienes，LTs)的关键酶，与炎症相关性疾病密切相关(刘宏等，2004)。咖啡酸是从植物药中提取的天然化合物，为5-LO的竞争性抑制剂(Koshihara et al.，1984)，具有抗氧化和抗炎症等活性。本研究采用慢性口服给铝致大鼠肝损伤模型，观察咖啡酸对肝脏的保护作用，并初步探讨其机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠28只，体质量(200±20)g，重庆医科大学实验动物中心提供［合格证书号:SCXK(渝)2010-0001］。 1.1.2 试剂与药品

D-葡萄糖酸钠、水合氯化铝(AlCl₃·6H₂O)均为国产分析纯，咖啡酸(南京青泽医药开发有限公司)，总蛋白测定试剂盒、肝功能测试试剂盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物科技研究所)，5-LO一抗(Goat polyclonal antibody，美国Santa Cruz公司)，兔血清(北京鼎国)，生物素标记二抗(Biotin-Rabbit anti-Goat IgG，美国Proteintech公司)，SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒(北京中杉金桥)。 1.1.3 仪器

低温冷冻离心机(Thermo Hybaid，德国)，荧光正置显微镜(Olympus，日本)，全自动酶标仪(Spectra MaxM2，美国)，恒温电热水浴锅(北京长风仪器公司，中国)，超纯水系统(Millipore，美国)。 1.2 方法 1.2.1 葡萄糖酸铝溶液配制

称取17.9 g AlCl₃·6H₂O和9.9 g葡萄糖酸钠，溶于去离子水，待溶液清澈后用0.1 mol·L^-1NaOH滴定溶液至pH5.0左右，最后用去离子水定容至100 mL(Al³⁺浓度为20 g·L^-1)。咖啡酸用质量浓度为5 g·L^-1的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)于研钵中配置成混悬液。 1.2.2 动物分组与模型建立

28只SD大鼠随机分为4组(n=7)，即空白对照组(990 mg·kg^-1葡萄糖酸钠+CMC-Na溶液)、铝负荷模型组(200 mg·kg^-1 Al³⁺溶液+CMC-Na溶液)、咖啡酸低剂量组(200 mg·kg^-1 Al³⁺溶液+10 mg·kg^-1咖啡酸)、咖啡酸高剂量组(200 mg·kg^-1Al³⁺溶液+30 mg·kg^-1咖啡酸)，咖啡酸与CMC-Na溶液在灌胃给予葡萄糖酸钠和葡萄糖酸铝1 h后灌胃给予，每周5 d，连续20周。 1.2.3 肝功能测定

造模完成后，乙醚麻醉各组大鼠，眼内眦静脉丛取血1~1.2 mL，37 ℃水浴1 h，低温离心机3000 r·min^-1离心10 min，取上层血清，按照试剂盒说明测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的活性。 1.2.4 MDA含量和SOD活性测定

大鼠取血后断颈处死，分离部分肝组织，用生理盐水冲洗后制备10%组织匀浆液，按照试剂盒说明测定总蛋白及MDA含量，SOD活性。 1.2.5 组织病理学观察

每组分离3只大鼠部分肝组织，固定于4%多聚甲醛48 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm切片，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察肝组织细胞形态结构变化。 1.2.6 5-LO免疫组织化学染色

肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸缓冲液抗原修复，高温至沸，保温5 min，重复4次，室温冷却，3%H₂O₂ 封闭30 min，PBS洗3次，0.1兔血清封闭30 min，1∶[KG-2mm]100 5-LO一抗封闭过夜，37 ℃复温30 min，PBS洗3次，生物素标记兔抗羊二抗封闭30 min，PBS洗3次，HRP封闭15 min，PBS洗3次，显微镜下滴加DAB至显色，流水冲洗，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，用Image-pro plus 6.0软件分析免疫组化图片10×40倍光镜下不同3个视野进行光密度分析。 1.3 数据处理

实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，实验结果用SPSS 17.0进行统计学分析，组间比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 咖啡酸对慢性铝负荷大鼠血清ALT、AST、ALP活性改变的影响

与对照组相比，铝负荷组大鼠血清中ALT、AST、ALP活性均显著升高(P<0.01);给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，ALT、AST、ALP活性均明显降低(P<0.05，P<0.01)(表 1)。

表 1 咖啡酸对慢性铝负荷大鼠血清ALT、AST、ALP活性改变的影响(x±s，n=6) Table 1 Effect of caffeic acid on changes of serum ALT，AST and ALP activity inducedby chronic aluminum overload in rats(x±s，n=6)

表选项

与空白对照组比较，铝负荷大鼠肝组织MDA含量显著升高(P<0.01);给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，MDA含量较模型组降低(P<0.05，P<0.01)。铝负荷大鼠肝组织SOD活性较空白对照组明显下降(P<0.01);给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，SOD活性显著上升(P<0.05，P<0.01)(表 2)。

表 2 咖啡酸对慢性铝负荷大鼠肝组织MDA含量和SOD活性的影响(x±s，n=6) Table 2 Effect of caffeic acid on changes of liver MDA content and SOD activity induced by aluminum overload in rats(x±s，n=6)

表选项

空白对照组大鼠肝细胞结构正常，肝索排列正常;慢性铝负荷大鼠肝组织出现空泡[KG(13x]变性、点状坏死，肝细胞排列紊乱;给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，肝细胞损伤明显减轻，肝索排列恢复正常(图版Ⅰ)。

图版Ⅰ咖啡酸对铝负荷大鼠肝组织病理学变化的影响(HE，×400) Plate Ⅰ Effect of caffeic acid on liver damage induced by chronic aluminum overload in rats(HE，×400) A. 空白对照组，B、C. 慢性铝负荷模型组，D. 咖啡酸低剂量组，E. 咖啡酸高剂量组。 A. control group，B and C. aluminum-overload group，D. caffeic acid 10 mg·kg-1 group，E. caffeic acid 30 mg·kg-1 group.

图选项

模型组大鼠肝组织血管周围肝细胞胞浆中5-LO表达明显，给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，肝细胞内5-LO表达明显减少;免疫组化图片用IPP 6.0分析各组平均光密度值可以看到，模型组大鼠肝细胞5-LO光密度值显著增加(P<0.01)，给予咖啡酸10 mg·kg^-1、30 mg·kg^-1后，光密度值较铝负荷模型组大鼠显著降低(P<0.01)(图版Ⅱ，图 1)。

图版Ⅱ大鼠肝组织5-LO蛋白表达免疫组化结果(×200，×400) Plate Ⅱ 5-LO protein expression in rat liver(×200，×400) A. 空白对照组，B. 铝负荷模型组，C. 咖啡酸低剂量组，D. 咖啡酸高剂量组; 下图同。 A. control group，B. aluminum-overload group，C. caffeic acid 10 mg·kg-1 group，D. caffeic acid 30 mg·kg-1 group; the same below.

图选项

图 1大鼠肝组织5-LO免疫组化平均光密度 fig. 1 Mean density of 5-LO protein expression in rat liver

图选项

与铁、锰、铜、锌等离子不同，铝不是机体生理功能所必须的微量元素，其在体内蓄积会破坏这些金属离子在体内的平衡(Tomljenovic，2011)。有研究指出铝干扰线粒体电子传递链，生成大量活性氧自由基和Fe³⁺，最终导致线粒体功能损害，加速细胞凋亡(Wu et al.，2012)。本研究结果显示，灌胃给予葡萄糖酸铝20周后，大鼠肝细胞出现空泡性变，点状坏死，同时肝功能出现异常，ALT、AST和ALP活性均显著升高，这些结果提示铝负荷能够引起肝细胞形态改变和肝功能异常，在日常生活中应该限制铝的摄入。铝负荷模型组大鼠肝组织MDA含量升高，SOD活性降低，提示铝对肝脏的损伤机制可能是引起肝细胞氧化应激。由于活性氧自由基的积累，细胞膜磷脂特别容易受到氧化(Tomljenovic，2011)，细胞膜磷脂在磷脂酶A₂(phospholipase A₂，PLA₂)的作用下生成AA，5-LO催化AA生成LTs，继而发生炎症反应，而炎症反应又加重氧化应激损伤，形成恶性循环。

已有研究表明，5-LO基因缺失的ApoE(-/-)小鼠的巨噬细胞浸润减少，半胱天冬酶-3(caspase-3)和核转录因子-κB(NF-κB)活性降低，血清ALT水平下降，肝脏促炎细胞因子的表达减少，减轻肝脏炎性损伤(Martínez-Clemente et al.，2010)，5-LO基因缺失能减少对乙酰氨基酚(APAP)引起的肝脏巨噬细胞浸润，细胞因子生成，减轻氧化应激和炎症反应，降低小鼠死亡率(Hohmann et al.，2013)。5-LO抑制剂能减弱肝毒性物质CCl₄引起的肝脏氧化应激和炎症反应，降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性和金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)mRNA含量，减轻肝组织纤维化(Titos et al.，2005)。本研究结果发现，口服给予5-LO抑制剂咖啡酸后，能明显减轻铝负荷引起的肝细胞形态改变，显著降低ALT、AST、ALP活性，改善肝功能，减少MDA含量，升高SOD活性，抑制5-LO表达，从而减轻铝负荷引起的炎症反应，起到保护肝组织的作用。

综上所述，咖啡酸能减轻慢性铝负荷所致肝损伤，机制可能与其抑制5-LO表达、减轻氧化应激反应损伤有关。