四川动物  2015, Vol. 34(2) 200-207

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严磊, 赵婷婷, 王会娟, 李小松, 黄爱龙, 谭毅, 赖国旗
YAN Lei, ZHAO Tingting, WANG Huijuan, LI Xiaosong, HUANG Ailong, TAN Yi, LAI Guoqi
利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型
Establishment of Hepatitis B Virus Chronic Infection Mouse Model Induced by HBV cccDNA
四川动物, 2015, 34(2): 200-207
Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(2): 200-207
10.3969/j.issn.1000-7083.2015.02.007

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收稿日期:2014-06-23
接受日期:2014-11-03
利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型
严磊, 赵婷婷, 王会娟, 李小松, 黄爱龙, 谭毅, 赖国旗     
1. 重庆医科大学实验动物中心, 重庆 400016;
2. 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室, 重庆 400016
摘要目的 通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV) 共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法 取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果 实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBcAg的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论 利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。
关键词乙型肝炎病毒     HBV共价闭合环状DNA     水动力法     小鼠模型    
Establishment of Hepatitis B Virus Chronic Infection Mouse Model Induced by HBV cccDNA
YAN Lei, ZHAO Tingting, WANG Huijuan, LI Xiaosong, HUANG Ailong, TAN Yi, LAI Guoqi     
1. Laboratory Animal Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. Key Laboratory of Molecular Biology on Infection Diseases and Institute for Viral Hepatitis, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Abstract:Objective To establish the mouse model of chronic viral hepatitis by hydrodynamic injection of HBV cccDNA in C57BL/6 mice. Methods A total of 29 C57BL/6 mice were divided into experimental group, control group and blank group, and injected with HBV cccDNA, pAAV-HBV1.2 and isotonic saline by hydrodynamic method, respectively. The serum samples and liver tissues were collected at different time points after injection. Radioimmunoassay was used to examine the levels of HBsAg and HBeAg. Real time PCR was used to determine the copy numbers of HBV DNA in serum and the liver. Immunohistochemistry was used to examine the levels of HBsAg and HBcAg in liver. HE staining was used to check the pathological changes of liver. SPSS software (version 17.0) was used to analyze the experimental data. Results The expression level of HBsAg in the experimental group showed a pattern of 4 peaks at day 3 and week 3, week 7 and week 9. A similar 4-peak expression pattern was detected in HBeAg at day 1 and week 1, week 4 and week 10. In the control groups, only 2 peaks at day 3 and week 8 were found in the expression pattern of HbsAg, and the peak value of HBeAg was observed at day 1, week 3, and week 10. No expression of HBsAg and HBeAg was detected in the blank group. As determined by real time PCR, although the levels of HBV DNA decreased with time, the copy numbers were significantly higher in the experimental group than those of control (P<0.01). Moreover, the copy numbers of HBV DNA in mice liver were significantly higher than those in the serum (P<0.01) at all time points. Positive expression of HBsAg and HBeAg in liver was revealed by immunohistochemistry in the experimental and control groups. The result of HE staining confirmed the symptoms of inflammation, fibrosis and necrosis in mice liver tissues. Conclusion HBV chronic infection model in C57BL/6 mice was successfully established by in vivo transduction with HBV cccDNA. The expression of HBV in the experimental groups was higher than that of control. This study provided a basic model for further understanding the mechanism of HBV infection and liver injury.
Key words: hepatitis B virus     HBV cccDNA     hydrodynamic     mouse model    

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,有较强的种属特异性,自然条件下只感染人和非人灵长类动物(如黑猩猩等),主要通过血液及体液传播感染(Guidotti & Chisari,2006)。HBV感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎,而且还与肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinom,HCC)的发生、发展密切相关。全世界共有约3.5亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)慢性携带者,其中3/4在亚洲。HBV感染导致全球每年有50万~120万人死亡,其中死于HCC的约占半数。我国是HBV感染的高发区,约60%的人群感染过HBV,10%的人群为携带者。我国现有乙型肝炎患者约1200万,年发病率为158/10万,HBV感染不仅严重威胁到人们的生命健康,同时也给整个国家带来了沉重的经济和社会负担(Ganem et al.,1996;Jung & Pape,2002;Persico & Iolascon,2010;Lesmana et al.,2012;Nascimento et al.,2012;Wong et al.,2012)。

虽然通过HBsAg疫苗接种对HBV感染有较好的预防作用,但有部分接种者对此无反应。临床上,患者通过长期服用抗病毒药物控制乙型肝炎病毒的复制,但长期服药面临各种耐药性和不良反应等问题。至今仍无治疗HBV的有效方法,而出现这种情况的重要原因之一就在于没有能反映临床乙肝发生、发展过程的理想动物模型,难以全面、深入认识HBV感染的致病机制和肝脏病变的发展及转归机制(Mailliard & Gollan,2006;程亮,王盛典,2010)。本研究采用从病人血清中获取的HBV为模板,PCR扩增后,制备乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA),利用水动力法注入小鼠体内,同时以pAAV-HBV1.2为对照,构建可持续表达HBV抗原的慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠,体质量20 g±2 g,购于重庆医科大学动物实验中心,实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-0001。实验于屏障系统进行,实验动物使用许可证号:SYXK(渝)2012-0001。 1.1.2 试剂与仪器

pAAV-HBV1.2质粒由重庆医科大学肝炎病毒研究所殷文伟博士馈赠;pUC-536207质粒由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室蔡雪飞博士馈赠;乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒和乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自北京北方生物技术研究所;SYBR-Green Master mix购自美国罗氏公司;鼠抗HBsAg和鼠抗乙肝核心抗原(HBcAg)购自北京博奥森公司;小鼠SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司;小量DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司;引物由上海英骏生物科技有限公司合成;GC-911型γ放射免疫计数器购自安徽中科生物科技有限公司;iQ5型荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。 1.2 方法 1.2.1 动物实验

C57BL/6小鼠观察饲养1周,无异常。将小鼠分为实验组12只、对照组12只、空白组5只。实验组采用水动力法注射HBV cccDNA,每只2 μg/2 mL;对照组注射pAAV-HBV1.2,每只5 μg/2 mL;空白组注射等渗盐水,2 mL/只。分别于注射后第1天、第3天、第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周经尾静脉采血,样本经离心分离后取血清,-20 ℃保存。分别于第1周、第3周、第6周、第10周经颈椎脱臼处死实验组3只、对照组3只、空白组1只,取肝组织,并进行石蜡包埋和HBV DNA提取。 1.2.2 HBV cccDNA制备

PCR扩增HBV全基因质粒pUC-536207,电泳PCR产物,选取3.2 kb处的凝胶条带进行胶回收,经BspQⅠ酶切后进行回收纯化,用T4 DNA连接酶连接回收的3.2 kb的线性 HBV DNA片段,产物进行纯化后即为HBV cccDNA(杜茜等,2013)。 1.2.3 放射免疫法检测血清样本中HBsAg和乙型肝炎e抗原(HBeAg)浓度

根据HBsAg诊断试剂盒和HBeAg诊断试剂盒说明处理血清样本,检测血清中的HBsAg和HBeAg的浓度。 1.2.4 荧光定量PCR法检测血清样本和肝组织中HBV DNA拷贝数

根据病毒基因组DNA提取试剂盒说明,提取血清样本和肝组织中基因组DNA。上游引物F402为:5-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3;下游引物R718为:5-AACTGAAAGCCAAAAGTG-3,标准品HBV DNA拷贝数为:2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108。PCR反应条件:95 ℃,3 min;94 ℃,20 s,50 ℃,30 s,40个循环;72 ℃,30 s。 1.2.5 免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和HBcAg的表达

肝组织经固定、脱水、包埋后进行切片。取处理好的切片,分别于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脱蜡20 min,依次按100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸馏水次序进行复水;滴加0.125%胰酶,37 ℃抗原修复1 h;滴加3%H2O2溶液,室温放置1 h,以消除内源性过氧化酶;HBsAg和HBcAg抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜。再根据鼠免疫组化SP法检测试剂盒说明操作。二氨基联苯胺(DAB)显色,显微镜下观察。苏木精染色5 min,脱水封片。 1.2.6 苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化

取处理好的切片,分别于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脱蜡20 min,依次按100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸馏水次序进行复水;苏木精5 min,伊红20 s,脱水封片。 1.2.7 统计学方法 使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。 2 结果 2.1 放射免疫检测结果

放射免疫法检测各组注射后采集的第1天、第3天、第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周血清中HBsAg和HBeAg的表达水平(图 1图 2表 1表 2)。放射免疫法检测结果显示,实验组注射HBV cccDNA后,从第1天到第10周均检测出HBsAg和HBeAg。其中HBsAg和HBeAg表达均呈现4个峰:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组注射pAAV-HBV1.2后,从第1天至第10周均检测出HBsAg和HBeAg。其中HBsAg和HBeAg均呈现2个明显的峰:HBsAg是第3天和第8周;HBeAg是第1天和第3周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。结果显示,实验组与对照组HBsAg和HBeAg的表达差异有高度统计学意义(P<0.01)。与实验组比较,对照组HBsAg表达水平在第1天、第3天、第1周、第8周均较高(P<0.01);对照组HBeAg表达水平在第1天和第3天较高(P<0.01)。而其他时间点,实验组HBsAg和HBeAg的表达高于对照组:HBsAg在第3周、第4周、第5周、第7周、第9周高于对照组(P<0.01);HBeAg在第1周、第2周、第3周、第4周、第7周、第8周、第9周、第10周高于对照组(P<0.01)。

图 1 小鼠血清中HBsAg表达检测结果 Fig. 1 The expression of HBsAg by radioimmunoassay in the serum of mouse 实验组. HBV cccDNA,2 μg/2 mL/只; 对照组. pAAV-HBV1.2,5 μg/2 mL/只; 空白组.等渗盐水,2 mL/只; 下图同。
Experimental group. HBV cccDNA,2 μg/2 mL/mice; Control group. pAAV-HBV1.2,5 μg/2 mL/mice; Blank group: isotonic saline,2 mL/mice; the same below.

图 2 小鼠血清中HBeAg 表达检测结果 Fig. 2 The expression of HBeAg by radioimmunoassay in serum of mouse

表 1 血清中HBsAg 表达情况(x±s, ng·mL-1 ) Table 1 The expression of HBsAg in serum (x±s, ng·mL-1 )

表 2 血清中HBeAg 表达情况(x±s, ng·mL-1 ) Table 2 The expression of HBeAg in serum (x±s, ng·mL-1 )
2.2 荧光定量PCR检测结果

荧光定量PCR检测HBV DNA拷贝数(图 3表 3)。同组别中肝组织中的HBV DNA拷贝数明显要高于血清样本中的HBV DNA拷贝数(P<0.001),而且实验组中肝组织和血清中的HBV DNA拷贝数均大于对照组(P<0.001)。同时发现肝组织和血清中的HBV DNA拷贝数随HBV感染时间的增加而递减(P<0.001)。

图 3 荧光定量PCR检测小鼠血清及肝组织中HBV DNA拷贝数结果 Fig. 3 The copies of HBV DNA in serum and liver of mouse by real time PCR

表 3 荧光定量PCR 检测血清和肝组织中HBV DNA 拷贝数(x±s) Table 3 The copies of HBV DNA in serum and liver by real time PCR (x±s)
2.3 免疫组织化学法检测结果

免疫组织化学法检测第3周与第10周的小鼠肝脏组织,结果如图版Ⅰ中箭头所示,实验组和对照组小鼠的肝组织中均能检测到HBsAg和HBcAg表达。与对照组比较,实验组HBsAg表达于肝组织汇管区,HBcAg表达于肝小叶细胞胞浆和胞核中。证明HBV在小鼠肝组织中的持续表达。

图版Ⅰ 免疫组织化学检测肝脏组织中HBsAg和HBcAg的表达(400×) PlateⅠ The results of the expression of HBsAg and HBcAg in the liver tissue by immunohistochemistry(400×) A、B、C. 空白组、对照组、实验组小鼠肝组织中HBsAg表达的免疫组织化学; D、E、F. 空白组、对照组、实验组小鼠肝组织中HBcAg表达的免疫组织化学。
A,B,C represent the results of the expression of HBsAg of the blank group,the control group and the experimental group in the liver tissue of mouse by immunohistochemistry,respectively; D,E,F represent the results of the expression of HBcAg of the blank group,control group and the experimental group in the liver tissue of mouse by immunohistochemistry,respectively.
2.4 HE染色肝组织病理分析结果

取第3周和第10周肝组织切片,HE染色后进行病理分析(图版Ⅱ)。实验组在第3周出现病理变化,肝组织出现轻度肿胀,淋巴细胞浸润,第10周的肝组织出现重度肿胀,伴有大量空泡样变性,肝细胞坏死,个别区域出现肝组织纤维化。而对照组也出现了肝组织病变,但肝组织损伤程度轻于实验组。实验表明HBV感染引起了肝组织损伤。

图版Ⅱ 小鼠肝脏HE染色(400×) PlateⅡ The result of the liver tissue of mice by HE staining(400×) A、B、C. 空白组、对照组、实验组小鼠肝组织第3周肝组织; D、E、F. 空白组、对照组、实验组小鼠肝组织第10周肝组织。
A,B,C. represent the result of the blank group,the control group and the experimental group in the liver tissue of mouse after 3 weeks; D,E,F represent the result of the blank group,the control group and the experimental group in the liver tissue of mouse after 10 weeks.
3 讨论

中国及东南亚一带HBV是引起病毒性肝炎的主要病原之一,仅在中国HBV携带的患者有1.2亿。HBV感染的患者半数以上将会发展为慢性乙型肝炎、肝硬化,甚至肝细胞癌,而这也被称之为HBV感染患者的"慢性肝病三步曲"(Chen et al.,2003)。HBV感染已成为严重影响人类健康的公共卫生疾病。针对HBV感染的致病机制、临床治疗等研究一直是研究热点。

近年来有关HBV的研究取得了一些可喜成果的同时,也面临更多的困难与问题。对于乙型肝炎病人肝脏损伤的机制,多数学者认为是机体对HBV表达产物的免疫反应机制所致,而非病毒在肝内复制的直接结果(Mohamed et al.,2004)。但是导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明,病毒性肝炎肝细胞坏死的分子基础仍不明确,亦无确切有效的治疗方法。制约研究进程的关键是无理想的实验动物模型,建立适用于基础研究及应用于临床治疗药物筛选的感染乙型肝炎病毒的动物模型对于HBV相关研究具有重要意义。

目前,有关HBV感染的动物模型包括黑猩猩模型、树鼩模型、鸭、旱獭模型、转基因小鼠模型、人-鼠肝脏嵌合体小鼠模型、人源化小鼠模型等(程亮,王盛典,2010)。这些动物模型对早期HBV研究提供了重要基础,但也存在很多局限性,例如采用黑猩猩就受到伦理限制,也难以应用于肝硬化、肝癌研究;转基因小鼠产生的免疫耐受;人源化小鼠存在的建模条件和技术要求条件高等。

无论是非人灵长类实验动物模型还是简单易得的其他动物模型作为有实验价值的HBV感染动物模型都须满足2个条件:一是高水平的HBV基因表达及复制;二是伴有持续性病毒复制和基因表达的慢性HBV感染(孙晓峰,2004)。董小岩等(2010)采用水动力注射含1.3拷贝HBV基因组的重组8型腺相关病毒的方法在C57BL/6小鼠体内成功建立HBV持续感染模型,但是并未引起HBV特异性的体液免疫反应,也未引起足够的肝组织病理变化。赵婷婷等(2014)采用水动力法注射HBV cccDNA的方法在裸鼠体内建立HBV持续感染模型,但是裸小鼠先天无胸腺,不能执行T淋巴细胞免疫,存在应用上的局限性。

HBV的复制过程最突出的特点是:HBV作为DNA病毒,HBV进行复制的模板不是DNA,而是将DNA转录RNA中间体(RNA intermediate)或称前基因组RNA,再逆转录成DNA进行复制。而HBV cccDNA是HBV复制mRNA和合成前基因组RNA的模板,HBV cccDNA既能转录产生前基因组mRNA,又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的病毒蛋白,是HBV复制水平最特异的指标,在HBV复制的过程中扮演了重要的角色(李才,2008;Locarnini & Zoulin,2010;李春霞,曾庆磊,2011;杨彩娥等,2013)。

本研究以具有正常免疫功能C57BL/6小鼠为实验载体,利用生物分子学方法将来源于HBV患者血清中的HBV进行扩增,酶切,环化为HBV cccDNA,水动力法转导至小鼠体内,建立一种模拟HBV患者感染的小鼠HBV慢性感染模型。同时水动力法转导pAAV-HBV1.2至小鼠体内做对照。采用水动力法转导有利于HBV在肝组织的高表达,同时研究结果也证明水动力法转导携带HBV基因的腺病毒载体和质粒是一种简便、迅速、高效转染的技术方法(郭艳菊等,2010)。

放射免疫法检测结果显示,利用HBV cccDNA所构建的HBV模型(即实验组),与pAAV-HBV1.2所建模型(即对照组)比较,在10周内检测血清均有HBsAg和HBeAg的持续表达。在第1周内出现对照组HBsAg和HBeAg的表达高于实验组,可能与腺病毒载体更易引起应激性免疫反应有关。第1周至第10周期间,除了在第8周出现对照组HBsAg表达高于对照组外,实验组HBsAg和HBeAg的表达均高于对照组,这可能由于实验组注射HBV cccDNA后HBV的复制水平高于对照组。而整个实验过程中,后期HBsAg和HBeAg表达减少可能是因为激发小鼠免疫系统,对转导至小鼠体内的病毒产生了清除作用(杜茜等,2013)。

实验中实验组和对照组HBsAg和HBeAg有多个峰表达,但为避免实验开始一周内小鼠可能的应激反应影响实验结果,同时根据实验中不同样本的取样时间,在荧光定量PCR检测、免疫组化检测和病理分析中采用了HBsAg和HBeAg表达高峰值的第3周的样本与第10周进行比较分析HBV的感染进程。

荧光定量PCR检测结果发现,实验组肝组织和血清中的HBV DNA拷贝数均高于对照组,而比较第3周和第10周2组HBV DNA拷贝数,发现在肝组织和血清中的HBV DNA拷贝数均呈递减趋势,尤其在血清中HBV DNA拷贝数均由105降至104。HBV DNA拷贝数的递减可能由于HBV cccDNA的自然衰亡,也可能由于激发了HBV特异的体液免疫应答导致HBV表达减弱(刘志红等,2012)。而对照组还可能存在由于pAAV-HBV1.2为腺病毒易诱导免疫耐受有关的可能(Ziegler et al.,2007)。

免疫组化及HE染色病理分析发现,随着HBV感染时间的增加,肝组织中的HBsAg和HBcAg表达均有增加,而病理分析发现小鼠肝组织第3周出现肝细胞肿胀、淋巴细胞浸润,到第10周还出现肝细胞死亡、肝组织纤维化等肝组织损伤,这与相关HBV感染患者的病理进程相似,肝组织损伤与血清中HBsAg和HBeAg阳性表达、HBV DNA定量水平无关,与肝组织HBcAg表达呈正相关(耿晓霞等,2009;钮志林等,2010;高杲等,2013)。而实验组与对照组HBcAg表达和肝损伤程度也说明了这一点。

本研究克服了其他HBV动物模型适用范围窄、与临床情况存在显著差异等局限性,建立了具有HBV持续表达,与临床HBV感染肝病理变化相似的HBV慢性感染的小鼠模型,可用于HBV感染致病机制研究、临床治疗药物筛选等,尤其对于研究HBV感染与肝组织损伤之间的相关联系提供了实用性基础模型。

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