卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，IVM)是指将生发泡(germinal vesicle，GV)期或GV前期的卵母细胞在体外培养，达到第二次减数分裂中期(MⅡ期)次级卵母细胞的发育阶段，能够正常受精、发育和着床，培养方式主要为卵丘复合体培养。卵母细胞体外成熟是现代胚胎工程中的主要技术环节，其目地是充分利用废弃卵巢上丰富的卵母细胞资源用于体外受精、体细胞克隆和转基因动物制备，以及发育生物学机理研究等。

家畜动物活体采卵存在技术难度大、供体母羊损伤严重等问题，且此方法获得成熟卵母细胞的潜力有限，不能满足当前科研和生产的需要。主要的解决手段是采集屠宰场卵巢，获取大量未成熟的卵母细胞，然后体外培养成熟后应用。

影响山羊卵母细胞体外成熟的因素较多。屈雷等(2012)和孙新明等(2010)研究表明，卵巢运输温度接近室温25 ℃时卵母细胞成熟率显著高于运输温度接近体温37 ℃时的卵母细胞成熟率；刘海军等(2012)研究表明卵丘颗粒细胞对卵母细胞体外成熟具有显著影响，卵丘颗粒细胞层数在3层以上的卵母细胞成熟率最好；叶华虎等(2008)发现直径小于1.5 mm卵泡内的卵母细胞仅有个别能完成成熟和卵裂，大于1.5 mm卵泡内的卵母细胞具有核成熟能力，直径大于2.5 mm卵泡内的卵母细胞能较好地支持胚胎继续发育；Kordan等(2003)研究表明，促卵泡素和促黄体素联合应用能明显提高山羊卵母细胞成熟率和受精后胚胎的发育率；王艾平等(2005)研究表明，表皮生长因子对卵母细胞复合体的体外成熟和卵裂发育具有明显的促进作用；王超和郝泽东(2007)分别对山羊卵母细胞进行18 h、20 h、24 h、26 h的体外成熟培养，结果发现培养24 h和26 h的卵母细胞体外成熟率极显著高于其他组；许杰和马恒东(2008)研究表明，繁殖季节卵母细胞的成熟率明显高于非繁殖季节。由此可见，山羊卵母细胞体外成熟不但受到卵巢本身性质的影响，也受到温度、培养条件和小分子化合物的影响。

屠宰场采集的山羊卵巢大小各异，可能与山羊年龄、生理状态和营养水平等因素有关。卵巢大小是否影响卵母细胞的体外成熟和后期的胚胎发育尚不清楚，也未见相关研究报道。因此本实验分析了不同质量卵巢来源的卵母细胞体外成熟情况、孤雌激活发育能力和克隆胚发育能力，旨在探讨卵巢大小对山羊卵母细胞体外成熟的影响，为山羊体细胞克隆、转基因山羊及其他胚胎工程研究提供参考。1 材料与方法1.1 实验试剂

本实验所用试剂如无特殊说明均购自Sigma公司。1.2 实验方法1.2.1 卵巢分组

自当地屠宰场采集山羊卵巢，立即放入无菌的生理盐水(含青霉素和硫酸链霉素各100 IU·mL^-1中，于3 h内运送至实验室，卵巢到达实验室的温度在23~28 ℃间。将卵巢用28 ℃的灭菌生理盐水(含硫酸庆大霉素100 IU·mL^-1反复冲洗3次，剪去输卵管等附属组织，再用生理盐水反复清洗干净，然后用灭菌的吸水纸吸干卵巢表面的水分，置于电子天平上称量。共称量100个卵巢，确定质量的最大值和最小值，对最大值与最小值的差值进行三等分，最终确定<0.95 g的卵巢为Ⅰ组，0.95~1.7 g之间的为Ⅱ组，>1.7 g的为Ⅲ组。1.2.2 卵母细胞的体外成熟培养

将称重分组的卵巢置于加有捡卵液的平皿中，用手术刀片切割2~6 mm卵泡，使得卵母细胞随卵泡液进入捡卵液，最后在体视显微镜下收集卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocytes complexs，COCs)。捡卵液为TCM199培养液(GIBCO公司)。

将挑选的COCs用37 ℃预热2 h的卵母细胞体外成熟液洗3次，转移到含2 mL成熟培养液的培养皿中，在38.5 ℃、5%(V/V)CO₂和最大饱和湿度中培养22 h。卵母细胞体外基础成熟液为TCM199培养液内添加0.22 mg/L丙酮酸钠、10 μg·mL^-1卵泡刺激素(FSH)(宁波第二激素厂)、20 μg·mL^-1黄体生成素(LH)(宁波第二激素厂)、1 μg·mL^-1 17β-E2、10%胎牛血清(GIBCO)，同时添加1%(体积分数)的转铁蛋白-胰岛素-亚硒酸钠(ITS)、表皮细胞生长因子(EGF)(10 μg·mL^-1)。1.2.3 卵母细胞体外成熟率的统计

卵母细胞成熟培养22 h后，将COCs移入浓度为3 g·L^-1的透明质酸酶溶液中，移液枪反复吹打卵母细胞，以去除外周颗粒细胞，然后用操作液洗3次，操作液为TCM199内添加20%的胎牛血清，最后于显微镜下挑选具有第一极体的卵母细胞，具有极体的细胞与培养细胞的比值即为成熟率。1.2.4 手工克隆胚的构建

山羊手工克隆胚的构建参照于鸿浩等(2013)方法。利用手工去核技术对不同重量卵巢来源的体外成熟卵母细胞进行去核。40日龄陕北白绒山羊胎儿成纤维细胞为供核细胞，以去核的卵母细胞为受体，经电融合后构建克隆胚，经过离子霉素(ionomycin)和N6，N6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)联合激活后进行培养。1.2.5 克隆胚的培养

将激活的克隆胚胎移入G1胚胎培养液(购自上海内湖公司)中进行体外培养。48 h后检查卵裂情况，将形态良好的分裂卵移入G2培养液(购自上海内湖公司)中，继续培养至第6 d，检查胚胎发育情况。克隆胚培养条件为38.5 ℃、5%(V/V)CO₂和最大饱和湿度。1.2.6 成熟卵母细胞孤雌激活

将挑选的成熟卵母细胞转移到含5 μmol·L^-1 ionomycin的TCM199培养液中激活5 min，再用操作液洗3次，最后转移到2.5 mmol·L^-1 6-甲基氨基嘌呤培养液中，在38.5 ℃、5%CO₂和最大饱和湿度的培养箱中作用4 h。然后按照克隆胚培养方法进行培养。1.3 数据处理

本实验重复5次，结果采用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P<0.05时差异有统计学意义。2 结果2.1 不同大小卵巢来源的卵母细胞体外成熟率

Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组卵巢来源的卵母细胞体外成熟率分别为62.25%、43.58%和40.7%。统计分析结果表明，Ⅰ组卵母细胞体外成熟率极显著高于Ⅱ组(P=0.009)，也极显著高于Ⅲ组(P=0.004);Ⅱ组和Ⅲ组之间的成熟率差异无统计学意义(表 1)。

对具有第一极体的成熟卵母细胞进行孤雌激活，孤雌激活胚经过体外培养后48 h观察卵裂情况。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组孤雌激活胚的卵裂率分别为83.77%、82.92%和79.73%。3组之间差异无统计学意义(表 1)。2.3 不同大小卵巢来源的卵母细胞孤雌激活囊胚率

孤雌激活胚培养至第6 d时观察囊胚发育情况。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组孤雌激活囊胚发育率分别为19.51%、18.9%和18.78%。3组之间差异无统计学意义(表 1)。2.4 克隆胚卵裂率

不同大小卵巢来源的成熟卵母细胞经手工克隆技术制备成体细胞克隆胚，克隆胚培养48 h后，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组卵裂率分别为67.36%、65.97%和66.33%。3组之间差异无统计学意义(表 1)。2.5 克隆胚囊胚发育率

克隆胚培养至第6 d时观察发育情况。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组克隆胚囊胚发育率分别为11.63%、13.41%和12.29%。3组之间差异无统计学意义(表 1)。3 讨论

哺乳动物卵母细胞成熟是一个非常复杂的过程，主要包括卵母细胞核成熟和胞质成熟。卵母细胞核减数分裂过程主要表现为生发泡破裂、第一次减数分裂期(MⅠ期)赤道板的形成、同源染色体分离、MⅡ期纺锤体的形成、第一极体排出、受精之后第二极体的排出。在卵母细胞体外成熟过程中生发泡破裂代表卵母细胞减数分裂的启动，第一极体排出标志着卵母细胞体外成熟，可以受精。与核成熟相比，胞质成熟较为复杂，主要包括卵母细胞内部各细胞器形态改变和功能建立，以及供减数分裂与早期胚胎发育相关的mRNA转录、翻译与修饰(Eppig et al.，1994；Wang & Sun，2007；Goto et al.，2013)，卵母细胞只有核与胞质都充分成熟时才能成功受精和支持胚胎发育。

在卵母细胞成熟发育过程中，细胞核的功能是逐渐被激活的(Fair et al.，1997)。从单层扁平颗粒细胞包围的卵母细胞到早期有腔卵泡阶段的卵母细胞，其核仁是由染色质丝不规则缠绕而形成的网状结构，其间有许多空泡核仁的致密化伴随着rRNA合成的急剧下降，使核仁由RNA的合成场所转变为RNA的贮存场所(Fair et al.，1996)。此外，核孔越来越明显，密度增加，而核周隙越来越难以分辨。电镜结果显示，生发泡期卵母细胞的核仁由颗粒性纤维成分、空泡及纤维中心组成，染色质高度疏松，有明显的核膜和核仁，核仁正在致密化或已发生致密化。只有核仁完全致密化，核仁周围有染色质相伴分布时，卵母细胞才获得恢复减数分裂的能力(Fair et al.，1996；Miao et al.，2009)。在卵母细胞培养开始后不久，核膜先是有轻微的打折，核膜孔消失；与核膜分解行为同步，染色体扩散，显著凝集在核膜内缘；然后发生核膜破裂，直至完全解散，加入内质网池，核内物质与核质混合，此过程即为生发泡破裂(Rajikin et al.，1994)。卵母细胞发生生发泡破裂，完成第一次减数分裂后，形成次级卵母细胞进行至MⅡ期，并排出第一极体。本研究以排出的第一极体为标准判断卵母细胞核是否成熟，结果表明大小不同卵巢来源的卵母细胞核体外成熟明显不同，小卵巢来源的卵母细胞体外成熟第一极体排出率显著高于大卵巢来源的卵母细胞，卵巢大小显著影响卵母细胞的核成熟。以孤雌激活胚和体细胞克隆胚的卵裂率、囊胚发育率判断大小不同卵巢来源的卵母细胞胞质成熟情况，结果表明不同来源的体外成熟卵母细胞支持孤雌激活胚、体细胞克隆胚发育的能力是相同的。因此，研究认为卵巢大小仅影响卵母细胞的核成熟率。关于卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响国内外尚未见报道，本研究首次发现了卵巢大小对卵母细胞体外成熟影响显著。高志花等(2004)研究表明牛卵巢大小对卵泡数量和卵巢黄体有显著影响，推测卵巢大小与动物个体激素水平有关。此外，卵巢大小通常也与动物个体的年龄有关。因此应以细胞核变化为切入点，以动物个体激素水平和个体年龄为影响因素深入研究卵巢大小对核成熟的影响机制。

本研究发现了山羊卵巢大小对卵母细胞体外成熟率的影响，小卵巢来源的卵母细胞体外成熟率较高。因此建议山羊体细胞克隆、转基因动物制备和体外受精等胚胎工程研究时选择收集小卵巢中的卵母细胞作为实验材料。