小肠是动物消化吸收营养物质的主要场所，肠道黏膜的组织结构与动物的消化吸收功能密切相关。黏膜上皮细胞及其连接结构是肠黏膜机械屏障的重要组成部分，黏膜的完整性、小肠绒毛的高度、隐窝深度是评价肠道吸收功能的重要指标；绒毛高度/隐窝深度比值(V/C)是衡量黏膜完整性的重要指标，同时，V/C可以综合反映小肠功能状况，其比值下降，预示黏膜功能受损；比值升高，黏膜功能改善(乔宏宇等，1994；王长文等，1998)。回肠淋巴集结是黏膜免疫反应的诱导部位，淋巴集结内含有大量免疫细胞，主要是B淋巴细胞和T淋巴细胞，其中B细胞主要分布在淋巴滤泡区，当淋巴滤泡受到抗原刺激便形成生发中心(杨淑静，2001)。抗原入侵时，回肠黏膜中的淋巴集结可将抗原物质转移到淋巴集结中的巨噬细胞，巨噬细胞对抗原进行加工后将其转移给辅助性T细胞，辅助性T细胞激活B细胞，B细胞分化后产生大量分泌型IgA(SIgA)，SIgA是黏膜免疫的重要效应因子，可以通过非炎性反应途径清除病毒感染，其主要作用有抗感染、抗菌、抗过敏、抗肿瘤以及抗过敏。目前为止，有关益生菌影响SIgA分泌、黏膜免疫相关因子(IL-2、IL-4、IFN-γ等)的研究较多，但其是否会影响黏膜免疫反应的诱导部位——回肠淋巴集结？这方面的研究很少。

牦牛肠源嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus L3是本课题组从牦牛肠道分离得到的益生菌，其是否影响牦牛小肠绒毛高度、隐窝深度及V/C？是否通过改善肠道黏膜结构增强肠道的吸收功能？本研究主要通过组织学、显微测量学方法探讨牦牛肠源L. acidophilus L3对牦牛小肠黏膜结构以及对回肠淋巴集结厚度的影响，探讨其是否通过改善牦牛肠道黏膜组织结构增强牦牛肠道的吸收功能及黏膜免疫功能。1 材料与方法1.1 试验动物

将10头健康牦牛(2~2.5岁)随机分为2组，分别为益生菌组和空白对照组，益生菌组在饲料中添加2×10⁹ CFU·kg^-1 L. acidophilus L3(牦牛肠源)。空白对照组采用普通饲料饲喂，饲喂28 d。所有牦牛均来自甘肃省天祝县石门镇。1.2 组织样品采集

在28 d试验结束时，将牦牛颈动脉放血处死，取其十二指肠、空肠、回肠。组织用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后放入3.7%多聚甲醛溶液中固定。组织固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片(5 μm)、苏木精-伊红(HE)染色。1.3 仪器设备及重要试剂

莱卡组织切片机(RM2235)，生物组织摊烤片机(KD-T)，显微镜(Nikon Inverted Microscope ECLIPSE TE2000-U)，Image-Pro Plus显微测量软件，伊红(北京鼎国)，苏木精(北京鼎国)，阳离子防脱玻片(北京鼎国)。1.4 组织学观察与测量1.4.1 观察并测量肠绒毛长度、隐窝深度

光学显微镜下用Image-Pro Plus显微测量软件测量益生菌组和对照组十二指肠、空肠、回肠绒毛高度、隐窝深度。每个肠段取5张切片，每个切片选取10个视野进行测量。1.4.2 观察并测量回肠淋巴集结厚度

光学显微镜下用Image-Pro Plus显微测量软件测量益生菌组和空白对照组回肠黏膜下层淋巴集结的厚度。每组选择15张HE染色切片(回肠的前段、中段、后段各5张)，低倍镜下观察并测量，每个视野测量10个数据。1.5 统计分析

试验数据用SPSS 12.0统计软件进行单因素组间方差分析，结果以“Mean±SD”表示。P<0.05时差异有统计学意义。2 结果2.1 饲用L. acidophilus L3对牦牛肠道黏膜形态结构的影响

由表 1可知，饲料中添加2×10⁹ CFU·kg^-1 L. acidophilus L3饲喂28 d后，益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠绒毛高度均较空白对照组显著增加，两组差异有统计学意义(P<0.05)；此外，益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均较空白对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；比较发现，益生菌组牦牛十二指肠、空肠、V/C均较空白对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)。

由表 2可以看出，饲料中添加2×10⁹ CFU·kg^-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后，益生菌组牦牛回肠淋巴集结的平均厚度均较空白对照组显著增加(P<0.05)。

组织学观察显示，益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠绒毛高度较空白对照组明显增加，益生菌组回肠淋巴集结较空白对照组发达，淋巴小结的数量较对照组多，淋巴集结的厚度也较空白对照组显著增加。Image-Pro Plus显微测量软件测量空白的对照组(图 1：E)淋巴集结的厚度最大处为620.45 μm，益生菌组(图 1：F)淋巴集结的厚度最大处为1020.19 μm。

图 1 空白对照组和益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠 Fig. 1 Yak ileum of the control and probiotic group A. 空白对照组十二指肠(HE，100×)，B. 益生菌组十二指肠(HE，100×)，C. 空白对照组空肠(HE，100×)，D. 益生菌组空肠(HE，100×)，E. 空白对照组回肠，F. 益生菌组回肠； 图中箭头所示为隐窝，V所示为肠绒毛，LN所示为淋巴集结。 A. the duodenum in the control group(HE，100×)，B. the duodenum in the probiotic group(HE，100×)，C. the jejunum in the control group(HE，100×)，D. the jejunum in the probiotic group(HE，100×)，E. the ileum in the control group，F. the ileum in the probiotic group; the arrows in the diagram show the crypt; V shows the intestinal villi，LN shows the Peyer's patches.

图选项

小肠绒毛高度、隐窝深度、V/C以及绒毛总表面积是衡量小肠消化吸收功能的重要指标。肠绒毛高度与细胞数量显著相关，在指状绒毛中，绒毛的长度与其肠上皮细胞数量有关，当绒毛变长时，肠上皮细胞数量增多，绒毛变短时，成熟的绒毛细胞减少，对养分的吸收能力低。隐窝深度则反映了细胞的生成率，细胞不断从隐窝基部向绒毛端部迁移、分化，以补充绒毛上皮的正常脱落。如果此过程减慢，基部的细胞生成率降低，使隐窝变浅，表明肠上皮细胞成熟率上升，吸收功能增强。因此，隐窝可被视为绒毛的加工厂，隐窝变深说明组织代谢加快，这意味着所需维持营养增加，动物生产效率下降。V/C反映了小肠的功能状态，比值上升，则黏膜改善，消化吸收功能增强，生长发育加快；比值下降，表明消化吸收功能下降，黏膜受损，消化吸收功能降低。很多研究证实益生菌能够维持并改善小肠绒毛的结构和功能，从而促进营养物质的吸收与利用。乔宏宇等(1994)用产酸型活菌制剂饲喂新生仔猪，发现饲喂活菌制剂的仔猪各肠段绒毛发育普遍好于对照组，绒毛高度增高，隐窝深度较对照组降低。王长文等(1998)在对犊牛的研究中也得到了类似结果。郭元晟等(2011)的研究发现肉鸡饲料中添加发酵乳酸杆菌(L. fermentum F-6)可显著增高其小肠绒毛，降低隐窝深度，提高V/C，表明L. fermentum F-6能够促进肉鸡小肠绒毛的生长发育，改善小肠的黏膜结构，提高生产性能。Willing和Van Kessel(2007)的研究发现用含发酵乳杆菌的饲料饲喂SPF猪后其肠绒毛高度较对照组增加。此外，给大鼠饲喂低、中、高不同浓度的青春双歧杆菌BBMN23和BBMN68，28 d后发现益生菌组(低、中、高剂量组)大鼠小肠绒毛高度均较对照组显著增加(Yang et al.，2009)，在对鸟类的研究中也发现益生菌可增加鸟类小肠绒毛的高度(Samli et al.，2007；Awad et al.，2009)。

我们的研究证实牦牛饲料中添加2×10⁹ CFU·kg^-1 L. acidophilus L3，饲喂28 d后益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠绒毛高度均较空白对照组显著增加，两组差异有统计学意义(P<0.05)；益生菌组牦牛十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均较空白对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，肠道绒毛高度的增加和隐窝深度的降低增强了牦牛肠道对营养物质的吸收效率，增强了其生产性能。3.2 L.acidophilus L3对牦牛回肠淋巴集结厚度的影响

肠道不仅是消化、吸收的主要场所，同时也是机体最大的细菌和内毒素库。肠道黏膜免疫系统包括肠相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissues，GALT)和黏膜免疫细胞、分子等成分，如上皮内淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞、抗体等。肠道相关淋巴组织由肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，IEL)、固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocyte，LPL)、微皱褶细胞(M细胞)和回肠淋巴集结(Payer's patches，PP)等构成(Macpherson et al.，2005)，可以通过非炎性反应途径清除病毒感染，其主要作用有抗感染、抗菌、抗过敏、抗肿瘤和抗过敏(Mowat，2003；Fagarasan & Honjo，2003)。

益生菌对黏膜免疫相关抗体——SIgA、IFN-γ等的影响已有报道(Tufano et al.，1991)，2012年我们研究了粪肠球菌SF-68对肠道黏膜免疫相关细胞(上皮内淋巴细胞、杯状细胞等)的影响(Zheng et al.，2012)。然而益生菌对回肠淋巴集结的影响还尚未报道，我们的研究发现L. acidophilus L3可增加回肠淋巴集结的厚度，益生菌组饲喂2×10⁹ CFU·kg^-1 L. acidophilus L3，28 d后回肠淋巴集结的厚度均较空白对照组高，回肠淋巴集结厚度的变化可有效增加其在黏膜免疫反应中的功能，增强牦牛肠道黏膜免疫功能。4 结论

小肠绒毛高度增加、肠隐窝深度降低、V/C增加表明L. acidophilus L3可有效改善肠道黏膜结构，增强其吸收功能；回肠淋巴集结厚度的增加表明L. acidophilus L3可增强肠道黏膜免疫效应部位的免疫功能。2×10⁹ CFU·kg^-1牦牛肠源L. acidophilus L3饲喂28 d可有效提高牦牛小肠黏膜结构及黏膜免疫效应部位的免疫功能。