无尾两栖类幼体变态过程往往伴随着急剧而复杂的形态和生理变化。水中栖息的无尾两栖类幼体在变态过程中会进行骨骼重构，成为适应陆生环境的四足无尾两栖类。其中无尾目幼体脊椎骨的发育和骨化为无尾两栖类的登陆提供了结构基础和物质储备。在无尾两栖类幼体发育过程中，脊椎骨首先会形成椎弓和椎体，其次是横突和关节突的形成，最后是底索和荐后椎融合形成尾杆骨等。脊椎骨发育的完善促使前后肢力量传递至中轴骨，且起到支撑躯干的作用(Pugener & Maglia，2009)。

国内外学者对无尾两栖类骨骼的发育和骨化做了大量的研究工作，包括豹蛙Rana pipiens(Kemp & Hoyt，1969)、苏里南角蛙Ceratophrys cornuta(Wild，1997)、史氏蟾蜍Pseudis platensis(Fabrezi & Goldberg，2009)、北蝗蛙Acris crepitans(Pugener & Maglia，2009)、中华大蟾蜍Bufo gargarizans(桑洲娴等，2014)等。隆肛蛙Feirana quadranus隶属两栖纲无尾目Anura蛙科Ranidae隆肛蛙属Feirana(费梁，2005)，其蝌蚪幼体时间长，完成幼体变态需要2~3年(陈晓虹，江建平，2004)。隆肛蛙骨骼系统的形态结构描述仅见成体的研究(祝传贵等，2008)，迄今未见隆肛蛙幼体骨骼发育的研究报道。本研究拟以隆肛蛙幼体不同发育阶段的蝌蚪为材料，对其脊椎骨骼进行双染色，来探究其脊椎在变态时期的发育特征和骨化次序，旨在推演无尾两栖类由水生到陆栖变态过程中脊椎骨的结构变化和生理适应。 1 材料与方法

隆肛蛙采自陕西秦岭北坡西安市长安区大峪水库附近的小水潭(地理坐标34°01′00″N，109°06′52″E，海拔700~730 m)。样本发育时期划分采用Gosner(1960)对无尾目蝌蚪发育分期的方法进行。取隆肛蛙蝌蚪各时期(Gosner 26期~Gosner 46期)各3尾样本进行骨骼染色。蝌蚪骨骼染色采用改良后Taylor和van Dyke(1985)的方法进行骨骼双染色——茜素红(Alizarin red)和阿利新蓝(Alcian blue)染色，再经甘油透明，硬骨呈紫红色，软骨呈蓝色。用Zeiss Discovery V12型体视显微镜观察，佳能7D数码相机进行图像采集。本实验中脊椎骨骼名称均采用Pugener和Moglia(2009)的骨骼术语进行描述。 2 结果

隆肛蛙蝌蚪Gosner 26期是取材的最早时期。荐前椎Ⅰ~Ⅷ椎体与椎弓连接处最先发生骨化，然后向腹中线处延伸；椎弓根与椎板的连接处也发生了骨化，其骨化程度从头至尾逐渐降低(图版Ⅰ：a)。在荐椎后出现荐后椎Ⅰ；身体后腹侧面出现底索，其为长杆状软骨，位于脊索腹侧并且平行于脊索。荐椎、荐后椎Ⅰ和底索均为软骨，未骨化。此外荐前椎Ⅲ~Ⅷ和荐椎均出现前关节突，而且前关节突与椎板连接的基部出现不同程度的骨化(图版Ⅰ：a)。同时荐前椎Ⅱ和Ⅲ出现横突，荐前椎Ⅱ横突靠近椎弓的基部发生骨化，荐前椎Ⅲ横突呈完全软骨状态(图版Ⅱ：a)。

图版 Ⅰ 隆肛蛙幼体发育过程中脊椎骨的发育侧面观 Plate. Ⅰ Skeletal morphogenesis of the vertebrae of Feirana quadranus larva，lateral views 注: a. Gosner 26期，b. Gosner 30期，c. Gosner 33期，d. Gosner 34期，e. Gosner 35期，f. Gosner 37期，g. Gosner 38期，h. Gosner 40期，i. Gosner 41期，j. Gosner 42期，k. Gosner 44期，l. Gosner 46期;蓝色表示软骨，红色表示硬骨;下图同。 Notes: a. Gosner stage 26，b. Gosner stage 30，c. Gosner stage 33，d. Gosner stage 34，e. Gosner stage 35，f. Gosner stage 37，g. Gosner stage 38，h. Gosner stage 40，i. Gosner stage 41，j. Gosner stage 42，k. Gosner stage 44，l. Gosner stage 46; blue was cartilage，red was bone; the same below.

图选项

图版 Ⅱ 隆肛蛙幼体发育过程中脊椎骨的发育背面观 Plate. Ⅱ Skeletal morphogenesis of the vertebrae of Feirana quadranus larva，dorsal views

图选项

Gosner 30期荐前椎Ⅰ~Ⅷ的椎板与椎弓连接处继续向背中线处骨化，椎体也向腹部进一步骨化，荐前椎Ⅰ~Ⅳ椎板末梢和椎弓根、椎板连接部位仍有少量软骨，而荐前椎Ⅴ~Ⅷ已经完全骨化。荐椎和荐后椎Ⅰ也已骨化完全。另外，荐前椎Ⅲ~Ⅷ和荐椎的前关节突继续发育，基部变宽，而且这些前关节突已经完成骨化。此外，荐前椎Ⅲ横突开始骨化(图版Ⅰ：b，图版Ⅱ：b)。

Gosner 33期荐前椎Ⅲ~Ⅷ和荐椎的前关节突继续生长，基部和末梢逐渐变宽(图版Ⅰ：c)。荐前椎Ⅲ横突骨化继续向末端延伸，此时荐前椎Ⅲ的横突长度约为荐前椎Ⅱ的一半；荐前椎Ⅳ出现针尖样的软骨横突(图版Ⅱ：c)。

Gosner 34期荐前椎Ⅰ~Ⅷ和荐椎的椎板向椎板中线处发育增长，增长部分仍为软骨(图版Ⅱ：d)。另外，荐前椎Ⅱ出现前关节突，其基部已经骨化，末梢仍是软骨；荐前椎Ⅲ~Ⅷ的前关节突末梢出现软骨样生长(图版Ⅰ：d)。荐前椎Ⅲ横突与荐前椎Ⅱ横突基本等长；同时，在荐前椎Ⅴ~Ⅷ和荐椎出现瘤状的软骨横突。

Gosner 35期荐后椎Ⅰ的椎弓继续发育，并且在其后侧出现完全骨化的荐后椎Ⅱ(图版Ⅰ：e，f)。荐前椎Ⅲ横突的长度超过荐前椎Ⅱ。

Gosner 37期荐前椎Ⅳ和Ⅴ的横突继续发育并且荐前椎Ⅳ横突基部开始骨化(图版Ⅱ：e，f)。

Gosner 38期各椎骨的前关节突逐渐向前一个椎骨的椎板靠近。荐前椎Ⅱ~Ⅳ横突继续向末端骨化(图版Ⅱ：g)。

Gosner 40期脊椎骨发生明显变化。荐前椎Ⅰ~Ⅲ椎板中线处仍为软骨，未完全骨化(图版Ⅱ：h)。荐后椎Ⅲ出现，底索前部开始骨化，荐后椎Ⅰ和Ⅱ后侧也出现2对比较明显的后踝骨，这意味着尾杆骨的主要组成部分已经完全形成(图版Ⅰ：h)。另外，荐前椎Ⅰ~Ⅷ均出现后骨突，但是较小且已经完全骨化；荐椎出现1对后骨突。荐前椎Ⅲ~Ⅴ横突末端软骨继续发育；荐前椎Ⅴ~Ⅷ和荐椎横突基部开始骨化(图版Ⅱ：h)。

Gosner 41期荐前椎Ⅰ~Ⅷ后关节突清晰可见，此期前后关节突最明显，但是并没有形成关节；荐椎的1对后骨突继续生长，与荐后椎Ⅰ的距离逐渐缩小。荐后椎Ⅰ和Ⅱ2对后踝骨继续生长，荐后椎Ⅱ椎弓逐渐接近荐后椎Ⅰ；底索前部骨化接近50%，并且向荐椎的腹侧椎体靠近(图版Ⅰ：i)。

Gosner 42期荐后椎Ⅰ和Ⅱ发生融合，在两者连接处出现椭圆形的卵圆孔Ⅰ，荐后椎Ⅲ与荐后椎Ⅱ分离；底索70%已经完成骨化，其前端继续向荐椎椎体靠近(图版Ⅰ：g)。同时，荐前椎Ⅰ~Ⅷ前后关节突融合，荐椎也通过2个后踝骨与荐后椎Ⅰ发生融合，此时前后关节突已模糊不可辨别。此外，荐前椎Ⅲ~Ⅷ横突末端继续伸长，荐前椎Ⅲ横突末端向后侧方向弯曲；荐椎的横关节突变长变宽，长度超过荐前椎Ⅴ~Ⅷ的横突(图版Ⅱ：g)。

Gosner 44期荐后椎Ⅱ和Ⅲ发生融合，在其交接处形成卵圆孔Ⅱ；底索基本完成骨化，与荐椎之间的角度继续缩小(图版Ⅰ：k)。荐前椎Ⅲ的横突末端方向由Gosner 42期的后侧倒钩状弯曲转变为向前弯曲，荐前椎Ⅳ~Ⅷ和荐椎横突末端继续发育和骨化。

Gosner 46期底索与荐后椎基本愈合形成尾杆骨。各椎骨由关节连接紧密，前后关节突基本不能分辨。各椎骨的横突完全骨化，荐前椎Ⅱ、Ⅲ横突指向前腹侧，荐前椎Ⅳ~Ⅷ横突指向后背侧(图版Ⅱ：l)。但是，此期椎体腹侧逐渐变透明。在Gosner 46期隆肛蛙脊椎椎骨发育结束，骨化完全(图版Ⅰ：l)。

综上所述，荐后椎Ⅰ在Gosner 26期已经出现；荐后椎Ⅱ在Gosner 35期出现；荐后椎Ⅲ在Gosner 40期出现。荐后椎Ⅰ和Ⅱ融合发生在Gosner 42期；荐后椎Ⅱ和Ⅲ融合发生在44期。同时，底索也在Gosner 44期完成骨化。在Gosner 46期，荐后椎和底索愈合形成尾杆骨(表 1)。此外，前关节突出现在Gosner 26期，后关节突在Gosner 41期最明显，前后关节突在Gosner 42期愈合形成关节。荐前椎Ⅱ和Ⅲ横突出现在Gosner 26期；而Ⅳ~Ⅷ横突出现在Gosner 34期。

近年来研究发现，不同种属无尾两栖类脊椎骨骨化起始的发育时期差异明显。北蝗蛙脊椎骨的骨开起始于Gosner 34期，寰椎的椎弓与椎体连接处先骨化，随后荐前椎Ⅱ~Ⅳ的椎弓和椎体骨化(Pugener & Maglia，2009)。非洲牛蛙Pyxicephalus adspersus骨化发生于Gosner 35期，荐前椎和荐后椎的椎弓先骨化(Shell et al.，1999)。与二者比较，中华大蟾蜍椎骨骨化最晚，在Gosner 42期，荐前椎Ⅰ~Ⅷ和荐椎的椎体和椎弓才开始骨化(桑洲娴等，2014)。

本研究表明，隆肛蛙荐前椎Ⅰ~Ⅷ的椎弓及椎体和荐前椎Ⅱ的横突在Gosner 26期已经开始骨化。隆肛蛙骨化开始时间明显早于北蝗蛙(Gosner 34期)、非洲牛蛙(Gosner 35期)和中华大蟾蜍(Gosner 42期)。综上可见，与其他无尾目比较，隆肛蛙蝌蚪骨化起始发育时期明显提前。隆肛蛙幼体阶段长达2~3年，而中华大蟾蜍从蝌蚪到成体的变态过程仅需2个月。幼体发育持续时间越长，骨化起始的发育时期越早；反之，幼体发育持续时间越短，骨化起始的发育时期越晚。

无尾两栖类脊椎骨的骨化次序具有极大的保守性，其骨化次序一般由头至尾，由内侧至外侧。但在不同无尾两栖类种属之间，椎骨的骨化次序仍呈现出较大差异。如中华大蟾蜍荐前椎、荐椎的椎弓和椎体开始骨化，随后荐前椎Ⅱ~Ⅷ和荐椎的横突、底索和荐后椎Ⅰ发生骨化，最后骨化的是荐后椎Ⅱ(桑洲娴等，2014)。非洲牛蛙荐前椎Ⅰ~Ⅷ和荐椎的椎弓首先骨化，其次是荐前椎Ⅰ~Ⅷ椎体，随之是荐椎椎体和荐后椎Ⅰ，底索和荐后椎Ⅱ最晚骨化(Haas，1999)。非洲牛蛙骨化首先发生在荐前椎和荐后椎的椎弓上，其次发生在荐前椎和荐后椎的椎体、荐前椎Ⅱ~Ⅷ横突，最后发生在底索(Shell，1999)。北蝗蛙最先骨化的是荐前椎Ⅰ~Ⅳ的椎体和椎弓，随后骨化的是荐前椎Ⅴ~Ⅷ和荐椎的椎体和椎弓、荐前椎Ⅱ~Ⅳ的横突和荐后椎Ⅰ，最后骨化的是荐前椎Ⅴ~Ⅷ和荐椎的横突、底索、荐后椎Ⅱ和Ⅲ(Pugener & Maglia，2009)。本研究结果显示，隆肛蛙的骨化顺序为荐前椎Ⅰ~Ⅷ的椎弓、椎体和荐前椎Ⅱ的横突开始骨化，随后荐椎和荐后椎Ⅰ的椎弓、椎体和荐前椎Ⅲ的横突、荐后椎Ⅱ的椎弓和椎体发生骨化，最后底索、荐后椎Ⅲ、荐前椎Ⅳ~Ⅷ横突和荐椎的横关节突发生骨化。综上比较可见，隆肛蛙在横突未全部骨化之前，荐后椎Ⅰ和Ⅱ已经完成了骨化，表现出软骨初步发育形成就立即骨化的特征。

此外，脊椎骨中前后关节突的出现是无尾两栖类栖息陆地的结构基础。依据本实验结果可见，隆肛蛙蝌蚪在Gosner 26期椎骨就出现了前关节突；而在Gosner 40期后关节突出现，在Gosner 41期时，后关节突最为明显；在Gosner 42期，前后关节突相互接触形成关节。在中华大蟾蜍蝌蚪中，前关节突出现在Gosner 39期，后关节突出现在Gosner 42期，前后关节突融合发生在Gosner 43期(桑洲娴等，2014)。以上比较可见，虽然隆肛蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪前关节突出现的发育时期差异明显，但前后关节突形成关节都发生在变态后期(Gosner 42期或Gosner 43期)。因此，我们推测前后关节的形成能使脊柱的各椎骨连接成整体，有利于加强无尾两栖类前后肢运动的协调性，为其登陆做结构准备。

无尾两栖类蝌蚪脊椎骨横突的长度具有种属特异性。在Gosner 34期之前，隆肛蛙蝌蚪荐前椎Ⅱ横突的长度最长，Gosner 35期之后，荐前椎Ⅲ横突的长度最长，且在末端有膨大的软骨。而豹蛙(Cannatella & Trueb，1988a)、树蛙(da Silva，1998)、角蛙(Wild，1997)和细趾蟾蜍(Vera & Ponssa，2014)荐前椎Ⅳ的横突最长。另外，横突的出现与无尾两栖类成体登陆密切相关。在Gosner 42期，隆肛蛙蝌蚪的横突完成骨化；中华大蟾蜍脊椎骨横突完成骨化发生在Gosner 46期(桑洲娴等，2014)。无尾两栖类幼体栖息于水中，其躯体重量则由水的浮力承担；成体登陆后水体浮力的作用完全消失。横突的出现和发育完善，有助于无尾两栖类在陆地负担身体的重量。

荐后椎与底索的愈合形成尾杆骨是无尾两栖类的基本特征。隆肛蛙蝌蚪的底索骨化开始于Gosner 40期，在Gosner 44期骨化完全，在Gosner 46期与荐后椎完全愈合形成尾杆骨。相比较而言，负子蟾Pipidae在Gosner 46期时，底索骨化完全但是与荐后椎并没有完全愈合(Rocková & Roek，2005)。无尾目底索与荐后椎愈合形成尾杆骨时，常常伴随着尾部的退化。此时后肢发育完善，依靠肌肉连接于尾杆骨上，标志着无尾目由水栖转变为陆栖。

此外，荐后椎与底索的愈合也是无尾目进化开始背离三叠纪的原蛙类，逐渐演变成现代蛙类的重要一步。三叠蛙Triadobatrachus，是生活于三叠纪的原蛙类，有短的尾，荐后椎有6对(Pugener & Maglia，2009)。角蟾属Megophrys幼体荐后椎数目变化较大，其中小臂蟾属Leptobrachella有30对，而掌突蟾属Leptolalax只有5对，但是这种多样性只存在于蛙幼体，幼体为了适应水生生活长出的额外的荐后椎会随着变态逐渐退化，最后只保留成体的荐后椎和底索，变态完成后形成尾杆骨(H and rigan et al.，2007)。非洲牛蛙和北蝗蛙有3对荐后椎。本研究结果表明，隆肛蛙蝌蚪有3对荐后椎。中华大蟾蜍有2对荐后椎(桑洲娴等，2014)。以上比较可见，无尾两栖类幼体的荐后椎数目差异显著，说明无尾两栖类幼体发育中荐后椎数目可能反映其系统演化的趋势。