四川动物  2015, Vol. 34 Issue (4): 489-493

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闫国栋, 刘颂蕊, 侯蓉, 高彤彤, 王爽, 代鹏飞, 邓林, 林居纯
YAN Guodong, LIU Songrui, HOU Rong, GAO Tongtong, WANG Shuang, DAI Pengfei, DENG Lin, LIN Juchun
大熊猫粪源大肠杆菌耐药性及整合子研究
Antimicrobial Resistance and Integrons of Escherichia coli Isolates from Giant Pandas Feces
四川动物, 2015, 34(4): 489-493
Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(4): 489-493
10.11984/j.issn.1000-7083.2015.04.002

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收稿日期：2014-11-22;接受日期：2015-02-04
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闫国栋, 刘颂蕊, 侯蓉, 高彤彤, 王爽, 代鹏飞, 邓林, 林居纯. 大熊猫粪源大肠杆菌耐药性及整合子研究[J]. 四川动物, 2015, 34(4): 489-493.
YAN Guodong, LIU Songrui, HOU Rong, GAO Tongtong, WANG Shuang, DAI Pengfei, DENG Lin, LIN Juchun. Antimicrobial Resistance and Integrons of Escherichia coli Isolates from Giant Pandas Feces[J]. Sichuan Journal of Zoology, 2015, 34(4): 489-493.
大熊猫粪源大肠杆菌耐药性及整合子研究
闫国栋1,2, 刘颂蕊2, 侯蓉2, 高彤彤1, 王爽1, 代鹏飞1, 邓林1, 林居纯1     
1. 四川农业大学动物医学院, 四川雅安 625014;
2. 成都大熊猫繁育研究基地, 成都 610081
收稿日期:2014-11-22;接受日期：2015-02-0
基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAC01B06).
作者简介: 闫国栋(1988—),男,硕士研究生,主要从事细菌耐药性及耐药机制研究,E-mail:guodong0973@163.com
通信作者：林居纯,教授,博士,硕士研究生导师,主要从事兽医药理及毒理学研究,E-mail:juchunlin@126.com
摘要：为了解大熊猫粪源大肠杆菌的耐药性、整合子-基因盒的分布特性,分析整合子对细菌耐药性的影响,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行了50株大肠杆菌对13种抗菌药物的药物敏感性试验;PCR-测序法检测了1、2、3型整合酶基因,进一步对阳性菌株可变区的基因盒序列鉴定分析。结果显示,菌株对13种抗菌药物表现出不同的耐药性,其中对氨苄西林、头孢唑林、四环素和复方新诺明表现出较高耐药性(耐药率为30%~68%),对其余药物耐药性较低(耐药率低于14%);50株菌中有15株(30%)含有1型整合子,未发现2型和3型整合子;15株1型整合子阳性菌中,有6株(40%)扩增出1200~2000 bp的基因盒,主要介导氨基糖苷类和磺胺-甲氧苄啶耐药的aadA和dfrA基因家族。以dfrA27+aadA2为主(检出率83.33%),1株为aacA4+aadA1+catB2。以上说明本次检测的大熊猫粪源大肠杆菌对多种抗菌药物呈低水平耐药;1型整合子在大肠杆菌中广泛分布,整合子-基因盒是造成整合子阳性菌株耐氨基糖苷类、磺胺-甲氧苄啶类、氯霉素的主要原因。
关键词： 大熊猫     粪源大肠杆菌     耐药性     整合子-基因盒    
Antimicrobial Resistance and Integrons of Escherichia coli Isolates from Giant Pandas Feces
YAN Guodong1,2, LIU Songrui2, HOU Rong2, GAO Tongtong1, WANG Shuang1, DAI Pengfei1, DENG Lin1, LIN Juchun1     
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan Province, 625014, China;
2. Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding, Chengdu 610081, China
Abstract:To investigate the antimicrobial resistance, distribution of integron-gene cassettes of Escherichia coli that isolated from the feces of giant pandas, as well as determine the correlation between resistance and integron-gene cassette, Kirby-Bauer method was used to test the susceptibility of 50 E. coli isolates against 13 antimicrobial agents. PCR-sequencing was established to detect the integrons (class 1, 2, 3) and gene cassettes that were harbored in E. coli isolates. The results showed that the isolates had different resistant levels to the 13 tested antimicrobials: high resistant level was observed in ampicillin, cefazolin, tetracycline and SMZ-TMP (resistant rates ranged from 30% to 68%); 30% of the isolates were found to harbor the class 1 integron, and no class 2 or class 3 integron was detected; gene cassettes with length of 1200-2000 bp were amplified from 40% of the 15 intI1-positive isolates, and the main resistant gens were identified as encoding aminoglycoside adenyltransferase (aadA) and dihydrofolate reductase (dfrA). The main arrays of gene cassettes were dfrA27+aadA2 (detection rate was 83.33%), moreover, 1 isolate was found to harbor the gene cassettes aacA4+aadA1+catB2 discovered. In conclusion, the E. coli isolates from the feces of giant pandas were sensitive to majority of the tested antimicrobial agents. Class l integron was widely distributed in E. coli strains from giant pandas, and integron-gene cassettes were responsible for resistant to aminoglycosides, sulfonamides-TMP and chloramphenicol.
Key words: giant panda     fecal Escherichia coli     resistance     integron-gene cassette    

大熊猫Ailuropoda melanoleuca属食肉目Carnivora熊科Ursidae熊猫亚科Ailuropodinae大熊猫属Ailuropoda，数量十分稀少，是我国特有珍稀濒危物种，国家Ⅰ级保护动物(朱靖，1974)。大肠杆菌Escherichia coli是人和动物肠道中的一种共栖菌，在特定条件下可致病，并能随粪便污染环境(伍清林等，2011)。由于大肠杆菌承受着多种抗菌药物的诱导和选择压力，造成其耐药性十分强，形成了多种耐药基因的储库和耐药基因交换的重要场所。加强对大肠杆菌耐药性检测及耐药机制的研究，可以了解耐药性流行规律，为缓解耐药性产生措施的实施提供科学依据(熊焰等，2000；刘书亮等，2011)。

整合子(Integron)是一个能通过自身编码的整合酶(IntI)来捕获外源基因并使之表达的遗传元件系统。根据整合酶基因的不同，将整合子分为6型，其中1~3型整合子与细菌耐药性有关。到目前为止，已在肠杆菌科、假单胞菌等革兰氏阴性菌中发现整合子，其可变区插入的基因盒基本上都是耐药基因盒，介导几乎所有抗生素的耐药性(冯银等，2013)。整合子-基因盒系统对于细菌耐药性获得、细菌基因组进化方面起重要作用。闫国栋等：大熊猫粪源大肠杆菌耐药性及整合子研究

本研究首次对圈养大熊猫粪源大肠杆菌耐药性和整合子-基因盒系统进行了检测和研究，旨在了解大熊猫粪源大肠杆菌的耐药性流行特点，以及整合子-基因盒与菌株耐药性之间的关系。 1 材料与方法 1.1 菌株

50株大肠杆菌是四川农业大学动物医学院于2013年在成都大熊猫繁育研究基地采集的大熊猫粪便样本经常规分离、纯化和鉴定的菌株；药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所；整合子阳性菌株，由本试验中心保存提供。 1.2 药敏纸片

氨苄西林(AMP，10 μg/片)、头孢唑林(CEZ，30 μg/片)、头孢噻肟(CTX，30 μg/片)、头孢曲松(CRO，30 μg/片)、氨曲南(AZM，30 μg/片)、四环素(TE，30 μg/片)、氟苯尼考(FFC，30 μg/片)、链霉素(STR，10 μg /片)、阿米卡星(AMK，30 μg/片)、复方新诺明(SXT，25 μg/片)、诺氟沙星(NOR，10 μg/片)、环丙沙星(CIP，5 μg/片)、左氧氟沙星(LVF，5 μg/片)，以上药敏纸片均购自英国Oxid公司。 1.3 主要试剂

水解酪蛋白(M-H)肉汤、M-H琼脂、营养琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×Taq PCR MasteMix，DNA marker Ⅲ购自天根生物试剂有限公司；pMD18-T vector购自TaKaRa公司。 1.4 药敏实验

参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer，K-B)(Clinical and Laboratory St and ards Institute，2011)，以大肠杆菌ATCC25922质控菌，药敏结果依据CLSI标准判定。 1.5 细菌DNA模板的制备

采用水煮沸法提取大肠杆菌基因组DNA模板。 1.6 PCR引物序列及合成

扩增3类整合子，1型整合子可变区(基因盒)引物序列见表 1(张发苏等，2006)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表 1 3类整合子-基因盒引物序列 Table 1 The sequences of primer for 3 integron-gene cassettes
引物名称
Primer
name		基因
Gene		序列Sequence(5’-3’)PCR
产物大小
PCR
product
size/bp		GenBank
登录号
GenBank
ID
IntΙ1-FPintΙ1ACGAGCGCAAGGTTTCGGT565AF550415
IntΙ1-RPGAAAGGTCTGGTCATACATG
IntΙ2-FPintΙ2GTGCAACGCATTTTGCAGG371AP002527
IntΙ2-RPCAACGGAGTCATGCAGATG
IntΙ3-FPintΙ3CATTTGTGTTGTGGACGGC714AY219651
IntΙ3-RPGACAGATACGTGTTTGGCA
In1-FP1型可变区TCATGGCTTGTTATGACTGTvariableAF550415
In1-RPGTAGGGCTTATTATGCACGC
表选项
1.7 1型、2型和3型整合子PCR检测

整合子PCR扩增体系：2×Taq PCR MasteMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol)各1 μL，DNA模板2.5 μL，灭菌双蒸水8 μL，共25 μL体系；PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增30个循环后，72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。 1.8 菌株整合子-基因盒检测

菌株整合子PCR检测结果显示，本次菌株只检出1型整合子，故设计扩增1型整合子-基因盒引物(表 1)。1型整合子-基因盒PCR扩增体系：2×Taq PCR MasteMix 25 μL，上、下游引物(10 pmol)各1.5 μL，DNA模板5 μL，灭菌双蒸水17 μL，共50 μL体系。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，扩增36个循环后，72 ℃延伸5 min。1型整合子可变区扩增PCR产物经电泳分离及胶回收纯化后，与pMD18-T vector连接，转化到DH5α感受态细胞中，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果与GenBank相关序列进行比对(BLAST)，分析其基因盒特征。 1.9 数据分析及处理

根据整合子检测结果，将菌株分为整合子阳性组和阴性组。采用SAS 9.0软件FREQ程序和χ2检验对2组菌耐药率进行分析。 2 结果与分析 2.1 药敏结果

药敏试验结果显示，50株大肠杆菌对13种抗菌药物呈不同水平的耐药性，其中对氨苄西林、头孢唑林、四环素和复方新诺明耐药性较严重(R≥30%)，耐药率分别为68%、58%、36%和30%；对其他药物呈低水平耐药(R≤14%)(表 2)。

表 2 大肠杆菌菌株对13种抗菌药物的药敏结果 Table 2 Susceptility results of Escherichia coli strains to 13 antimicrobial agents
抗菌药物
Antimicrobial agent		总菌株数
Total strains(n=50)		耐药率
Resistant rate/%
R/%I/%S/%整合子
阴性菌
IntI1-
negative
strains
(n=35)		整合子
阳性菌
IntI1-
positive
strains
(n=15)
氨苄西林Ampicillin58.0010.0032.0040.00100.00**
头孢唑林Cefazolin68.0012.0020.0054.29100.00**
头孢曲松Ceftriaxone4.006.0090.005.710.00
氨曲南Aztreonam6.0014.0080.005.716.67
头孢噻肟Cefotaxime8.004.0088.0011.430.00
链霉素Streptomycin14.008.0078.005.7133.33**
阿米卡星Amikacin4.008.0088.000.0013.33*
诺氟沙星Norfloxacin8.008.0084.008.576.67
环丙沙星Ciprofloxacin6.0012.0082.005.716.67
左氧氟沙星Levofloxacin6.002.0092.008.570.00
氟苯尼考Florfenicol12.0010.0078.002.8633.33**
四环素Tetracycline36.008.0056.0037.1433.33
复方新诺明
Sulphame-thoxazole
and trimethoprim		30.008.0062.0031.4326.67
注: R. 耐药率，I. 中介率，S. 敏感率; * 0.01＜P＜0.5，** P＜0.01
Notes: R. Resistant rate，I. Intermediate rate，S. Susceptive rate; * 0.01＜P＜0.5，** P＜0.01.
表选项
2.2 菌株整合子PCR检测结果

50株大熊猫粪源大肠杆菌共检出intI1阳性菌15株，检出率30%，未检测到intI2和intI3阳性菌。

2.3 1型整合子可变区相关耐药基因盒PCR-测序结果

在15株intI1阳性菌株中，有6株扩增获得1200~2000 bp目的片段(图 1)。对获得目的片段测序结果显示，基因盒有dfrA27(介导磺胺类-甲氧苄啶耐药)，aadA1、aadA2和aacA4(介导氨基糖苷类耐药)，catB2(介导氯霉素耐药)。基因盒排列组合分为2类(表 3)，其中以dfrA27+aadA2为主，占83.33%，其次是aacA4+aadA1+catB2。

图 1 1型整合子可变区PCR产物电泳图 Fig. 1 Electrophogram of PCR products for the variable in intI1 注: M. DNA marker Ⅲ; 1. 阴性对照，3. 阳性对照，4~9. 1型整合子基因盒。
Notes: M. DNA marker Ⅲ; 1. negative control，3. positive control，4~9. gene cassettes in intI1.
图选项

表 3 大肠杆菌耐药性及整合子基因盒相关性 Table 3 The correlation between resistance of Escherichia coli and integron-gene cassettes
耐药谱型

Resistance spectrum

菌株数

Number of

isolates/株

多重耐药性

Multi-drug

resistance

整合子

Integron

基因盒

Gene

cassettes

AMP/CEZ31重——
AMP/CTX21重——
CEZ/CTX11重——
LVF/CIP/NOR21重——
AMP/TE52重——
CEZ/TE42重——
CEZ/SXT62重——
CEZ/FFC12重——
CEZ/LVF12重——
AMP/SXT22重——
CEZ/STR22重——
SXT/TE32重——
TE/CTX/CEZ12重——
AMP/CRO/AZM22重——
AMP/CEZ/STR12重IntI1—
AMP/CEZ/CIP12重IntI1—
AMP/CEZ/TE22重IntI1—
AMP/CEZ/FFC22重IntI1—
AMP/CEZ/NOR12重IntI1—
AMP/CEZ/AZM12重IntI1—
AMP/CEZ/FFC/STR13重IntI1dfrA27+

aadA2

AMP/CEZ/FFC/TE13重IntI1—
AMP/CEZ/SXT/AMK13重IntI1dfrA27+

aadA2

AMP/CEZ/STR/TE13重IntI1dfrA27+

aadA2

AMP/CEZ/AMK/SXT13重IntI1dfrA27+

aadA2

AMP/CEZ/SXT/FFC/STR14重IntI1aacA4+

aadA1+

catB2

AMP/CEZ/SXT/STR/TE14重IntI1dfrA27+

aadA2

表选项
2.4 整合子-基因盒与菌株耐药性的相关性

intI1型阳性菌株组对氨苄西林、头孢唑林、链霉素、阿米卡星、氟苯尼考耐药率与阴性组的差异有统计学意义或高度统计学意义(0.01＜P＜0.05或P＜0.01)，而2组菌株对其他药物耐药率的差异无统计学意义(P＞0.05)(表 2)。对基因盒特征研究发现，本次检测整合子携带基因盒是dfrA27、aadA1、aadA2、aacA4和catB2，而且含有整合子-基因盒的菌株耐药谱型更广，均为3耐及以上的多重耐药菌株(表 3)。说明整合子-基因盒系统的存在对于菌株耐药性和多重耐药性的产生具有意义。 3 讨论与结论

本次对50株大熊猫粪源大肠杆菌药敏检测显示，菌株对氨苄西林、头孢唑林、四环素和复方新诺明耐药率超过30%，高于其他检测结果(Zhang et al.，2009；Wang et al.，2013)，对头孢曲松等其余药物耐药率低于或接近其他检测结果(张安云等，2006；李蓓等，2012)，这可能与菌株来源不同有关。本次检测结果均远远低于食品动物源大肠杆菌的耐药性(林居纯等，2011；魏秀丽等，2013)，这与成都大熊猫繁育研究基地严格控制抗生素使用和制定合理的用药原则有关。

本研究首次对大熊猫粪源大肠杆菌不同型整合子(intI1、intI2、intI3)检测发现，30%的菌株携带有1型整合子，与国外报道分离自鸟类大肠杆菌整合子检出率接近(Sacristán et al.，2014)，尚未检出2型、3型整合子，这表明1型整合子不仅在食品动物源大肠杆菌中广泛分布(邹立扣等，2012；林居纯等，2014)，而且在大熊猫等动物源菌株中也存在，为耐药基因的水平传播和交换提供了可能，应加强对整合子的检测。

IntI1阳性菌株耐药基因盒检测发现，60%菌株尚未检出基因盒。出现这一现象可能原因：本次扩增基因盒是根据整合子-基因盒3’，5’保守序列设计的，可能对3’序列有变异的菌株造成漏检；基因盒片段太大，超出rTaq酶扩增范围；这些菌株是未携带基因盒的空整合子(陆思静等，2010)。其余40%菌株携带基因盒特征显示，本次检出的基因盒主要以介导磺胺类-甲氧苄啶耐药的dfrA27基因，以及介导氨基糖苷类耐药的aadA2、aadA1、aacA4为主，有1株中还检出了介导氯霉素耐药的catB2基因。在基因盒排列中以dfrA27+aadA2排列为主，占83.33%，与食品动物源菌株中该基因排列高检出率(57.14%)一致(岳磊等，2012)，说明了dfrA27+aadA2在整合子系统中已获得稳固的传播能力。本次还在一株菌中检出aacA4+aadA1+catB2基因盒排列，其中aacA4介导卡那霉素、妥布霉素耐药，aadA1介导链霉素、大观霉素耐药，catB2介导氯霉素耐药。尽管该基因排列的检出率低，但由于曾在肠炎沙门氏菌中检出(Villa et al.，2002)，且介导多重耐药性，故应加强对其检测。

整合子-基因盒与菌株耐药性的相关性分析可见，整合子-基因盒系统参与了菌株对氨基糖苷类、磺胺-甲氧苄啶类、氯霉素耐药性表达，但整合子-基因盒不能完全解释菌株的所有耐药表型，如菌株对氨苄西林、头孢唑林、四环素表现出较高的耐药率，而并没有在整合子系统中检出介导β-内酰胺类、四环素类耐药基因。这一现象在国内其他报道中也曾出现(陆思静等，2010；岳磊等，2012；林居纯等，2014)，可能说明整合子-基因盒系统在介导β-内酰胺类、四环素类不起主要作用。

综上所述，本次检测的大熊猫粪源大肠杆菌对多种抗菌药物呈低水平耐药，但临床上还是应该加强对其耐药性的检测。1型整合子已广泛分布于大熊猫粪源大肠杆菌中，整合子携带的耐药基因盒是整合子阳性菌株对氨基糖苷类、磺胺-甲氧苄啶类、氯霉素耐药的主要原因。

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