随着国内水果消费结构升级和消费偏好多样性发展，对进口水果的需求和消费越来越大，不断推动水果进口量的增加^[1-2]，而进口水果质量安全问题引起了研究者的关注。2006年天津出入境检验检疫局公布了进口水果质量安全存在7大问题，其中就包括农药残留和二氧化硫超标^[3]；2011年山东检验检疫局检出进境冷冻水果多菌灵超标^[4]；2017年深圳检验检疫局检出进口水果多菌灵和二氧化硫超标^[5]。中国农业农村部农产品质量安全监管局在2017年开展的果品质量安全风险评估专项中也包括进口水果的风险评估。美国是世界第五大水果生产国，也是世界主要水果出口国^[6]。中国水果进口量的增长很大一部分来自美国。鉴于美国与中国在地理环境及气候方面差异，水果栽培管理和农药使用种类及水平有很大不同，因此，监测和评估美国水果的质量应重点关注美国本土使用频次高、风险较大的农药种类。在美国农业部发布的2008—2017年农药数据项目 (Pesticide Data Program，PDP) 报告^[7]中指出，近些年美国农药残留量超标的水果有草莓、桃、蓝莓、西瓜、苹果和梨等，涉及15种农药及助剂，包括咯菌腈、啶酰菌胺、增效醚、甲氧虫酰肼、环酰菌胺、啶虫脒、毒死蜱、腈菌唑、四氟醚唑、乙酰甲胺磷、噻虫嗪、噻菌灵、嘧霉胺、西玛津和灭多威。鉴于此，中国在对美国进口水果质量安全风险监测中也应重点关注该15种高风险化合物。关于这15种化合物残留的检测涉及3个中国国家标准中的3种检测方法及检测器^[8-10]，且每种方法的样品前处理各不相同，分析效率低。此外，环酰菌胺尚无标准检测方法。鉴于此，本研究建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定美国进口水果中15种农药及助剂的残留，有针对性地监测美国进口水果中的高风险农药，为进一步了解从美国进口水果中的农药残留动态和潜在风险，建立中国进口食品技术性贸易措施，保障中国进口水果质量和消费者安全提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

LC-MS 8040 液相色谱-串联质谱仪 (日本岛津公司)；SK-1 快速混匀器 (常州国华电器有限公司)；UMV-1 多管旋涡混匀器 (青云仪器设备有限公司)；HX-PB965 奥克斯破壁营养料理机 (佛山市海迅电器有限公司)；BL610 电子分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Milli-Q超纯水系统 (德国默克集团)。

甲酸 (色谱纯) 购于上海阿拉丁试剂有限公司；乙酸铵 (优级纯) 购于天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇 (质谱纯) 购于上海安谱实验科技股份有限公司。甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、啶虫脒(acetamiprid)、毒死蜱(chlorpyrifos)、腈菌唑(myclobutanil)、乙酰甲胺磷(acephate)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻菌灵(thiabendazole)、嘧霉胺(pyrimethanil)、西玛津(simazine)和灭多威(methomyl)10种农药标准溶液(100 mg/L)购于农业农村部环境保护科研监测所；增效醚(piperonyl butoxide，100 mg/L)和四氟醚唑(tetraconazole，100 mg/L)购于美国o2si标准品公司；环酰菌胺(fenhexamid，纯度98.7%)、咯菌腈(fludioxonil，纯度99.2%)和啶酰菌胺(boscalid，纯度98.9%)购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。氨基固相萃取柱 (500 mg/6 mL) 购于美国安捷伦公司；QuChERS净化管购于青云实验耗材有限公司。

1.2 标准溶液配制

标准工作溶液：准确称取适量的环酰菌胺、咯菌腈和啶酰菌胺标准品，用甲醇溶解，配成100 mg/L的标准储备液。分别准确吸取0.5 mL甲氧虫酰肼等12种标准溶液和环酰菌胺等3种标准储备液，用甲醇稀释并定容至10 mL，得到质量浓度为5.0 mg/L的15种化合物的混合标准储备液。将上述混合标准储备液，用甲醇逐级稀释成0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001 mg/L的系列混合标准工作液。

基质匹配标准溶液：用经提取、净化后获得的梨、葡萄和苹果空白基质溶液，分别将5.0 mg/L混合标准储备液稀释，配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1和0.5 mg/L的系列基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理

提取：将样品切碎，四分法缩分后用料理机匀浆破壁。称取经破壁后的样品10.00 g于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈，漩涡提取10 min；加入5~7 g氯化钠，涡旋提取2 min，于3 000 r/min下离心5 min；吸取5 mL上清液于100 mL烧杯中，置于80 ℃水浴锅中加热，并缓慢通入氮气流，蒸发至近干；加入2 mL V (二氯甲烷) : V (甲醇) = 95 : 5，待净化。

净化：将氨基固相萃取柱用4.0 mL V (二氯甲烷) : V (甲醇) = 95 : 5预淋洗活化后，加入待净化液，用10.0 mL V (二氯甲烷) : V (甲醇) = 95 : 5 分2次洗脱；收集全部洗脱液，于50 ℃氮吹蒸发至近干；加入 2.5 mL V (甲醇) : V (水) = 4 : 1 溶解，过0.22 μm尼龙滤膜，待测。

1.4 检测条件

色谱条件：Shim-pack XR-ODS色谱柱 (75 mm × 2.0 mm，1.6 μm)；柱温40 ℃；进样量1 μL。流动相A相为含2 mmol/L乙酸铵和体积分数0.05%的甲酸水溶液，B相为甲醇；流速0.4 mL/min。梯度洗脱程序：10% B，保持1.0 min；5.0 min内调整为60% B；5 min内调整为95% B，保持 3 min；1.5 min内调整为10% B，保持2 min。

质谱条件：ESI源；正/负离子全扫描；多反应监测 (MRM) 模式；DL管温度250 ℃；加热模块温度400 ℃；干燥气流速15 L/min；碰撞气压力230 kPa。优化的离子对、碰撞能量等信息详见表1。

1.5 基质效应

采用公式M_E = B/A × 100%评价基质效应。其中：A和B分别表示纯溶剂配制标准溶液曲线和基质匹配标准溶液曲线的斜率。当M_E在80%~120%之间表明基质效应不明显，当M_E在50%~80%和120%~150%之间时，需要考虑消除基质效应^[11]。本研究使用0.16 μm粒径超高效液相色谱柱，通过减缓流动相变化梯度 (见1.4节) 和进样1 μL的方式，分别考察15种化合物在梨、葡萄和苹果3种基质中的基质效应。

2 结果与讨论 2.1 色谱与质谱条件优化

在m/z 50~500范围内，采用正/负离子全扫描，单针进样，通过质荷比和各化合物的相对分子质量确定15种化合物的前体离子为：除了咯菌腈和增效醚前体离子峰为[M − H] ^－ 和[M + NH₄]⁺外，其余化合物的前体离子峰均为[M + H]⁺。在子离子扫描模式下，对前体离子进行打碎扫描，找到2个响应值较强的子离子作为定量离子和定性离子。在多反应监测 (MRM) 模式下，以确定的前体离子、定量子离子和定性子离子为基础，优化Q1电压、碰撞能和Q3电压，优化结果见表1。

15种化合物中除咯菌腈是在负离子模式下采集外，其余14种均在正离子模式下采集，因此，首选甲醇和甲酸水体系。由于甲酸浓度太高会降低咯菌腈的灵敏度，故选用体积分数为0.05%的低浓度甲酸水溶液。此外，增效醚的前体离子峰为[M + NH₄]⁺，在流动相中加入实验室常用的2 mmol/L乙酸铵，可使增效醚产生稳定持续的加氨峰，同时有利于其他化合物的电离。利用实验室常用的柱效较高的Shim-pack XR-ODS色谱柱，在上述色谱条件下梯度洗脱，15种化合物在11 min内可有效分离，同时具有较好的灵敏度。

2.2 净化方法的确定

液相色谱-串联质谱法测定农药残留常用QuChERS和氨基固相萃取2种前处理净化方式。其中，QuChERS法简便、快速，而氨基固相萃取则在GB/T 20769中推荐使用。两者均是实验室常用的净化方式。因此，对比了这2种处理对15种化合物回收率的影响。结果显示：使用QuChERS净化管后，噻菌灵的回收率仅为10%，远低于氨基固相萃取柱的回收率，这主要与QuChERS净化管中的石墨化碳黑 (GCB) 的吸附有关。QuChERS法净化常存在基质效应^[12-16]，需要使用基质匹配标准溶液来校准消除，而实际检测过程需要根据产品的种类分别配制不同的基质匹配标准溶液，该过程操作繁琐，效率低。采用氨基固相萃取柱的净化效果和回收率均优于QuChERS前处理，因此选用氨基固相萃取柱作为净化方法。通过优化洗脱体积，确定较佳的洗脱体积为12 mL (2 mL + 5 mL + 5 mL)，分3次洗脱。不同洗脱体积下15种化合物回收率见图1。

2.3 基质效应和线性范围

从表2可知：15种化合物在3种水果中的M_E为80%~105%，基质效应不明显，可以忽略。

以化合物的质量浓度 (x，mg/L) 为横坐标，峰面积 (y) 为纵坐标得到线性方程。在0.001~0.5 mg/L范围内15种化合物的线性关系良好，R ² ≥ 0.999 5 (表2)。

2.4 方法的准确度、精密度和定量限

选取不含目标化合物的葡萄、梨和苹果空白样品，通过添加回收试验考察了方法的准确度和精密度 (n = 5)。结果 (表3) 表明：环酰菌胺在0.01、0.05和0.5 mg/kg添加水平下，其余化合物在0.005、0.05和0.5 mg/kg添加水平下，其平均回收率在80%~115%之间，相对标准偏差在5.5%~16%之间，可以满足农药残留分析的要求^[17]。根据添加回收试验确定环酰菌胺的定量限 (LOQ) 为0.01 mg/kg，其余化合物的LOQ为0.005 mg/kg。

2.5 实际样品测定

采用本研究建立的方法，对采自超市中标有美国进口字样的20份水果 (包括美国姬娜苹果、美国红蛇果、美国红皮梨和美国红提) 进行了这15种化合物残留的分析。结果显示：有5份样品检出咯菌腈、嘧霉胺、噻菌灵、啶酰菌胺和环酰菌胺 (表4)，但其残留量均未超过中国^[18]和美国^[19]制定的的最大残留限量 (MRL) 标准。由于中国尚未制定咯菌腈和环酰菌胺在苹果和梨上的MRL值，从保护消费者安全和制定技术性贸易措施的角度，中国应尽快制定这些农药的MRL值。另外，本研究中虽然仅列出了15种高风险农药及助剂，但在后续的研究和风险评估中需要将高风险化合物的代谢物一并考虑，如乙酰甲胺磷代谢物甲胺磷、毒死蜱代谢物甲基毒死蜱等。

3 结论

对美国近10年来发布的农药数据项目报告进行分析和研判，根据农药残留超标情况和检出率，筛选出需重点关注的15种高风险农药及助剂。通过优化色谱-质谱检测条件及样品前处理方法，建立了SPE-UPLC-MS/MS法测定美国进口水果中15种高风险化合物残留。该方法采用了净化效果较好的氨基固相萃取柱，确定了较佳的洗脱梯度，减少了进样体积，降低了基质效应，避免了繁杂的基质匹配标准溶液过程。该方法简便、快速，灵敏度高，准确度和精密度均能达到农药残留检测的要求，可用于水果中该15种农药及助剂残留的批量检测。