2019, Vol. 21
2. 南京农业大学 植物保护学院，南京 210095
2. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
西草净、异丙隆、苄嘧磺隆、莎稗磷、乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵属于不同化学结构类型的水稻田常用高效低毒除草剂。虽然除草剂的直接毒性较低，但长期进食除草剂残留超标的食物，除草剂会在体内积累，对人类健康造成潜在危害[1-3]。根据中国食品中农药残留标准规定：西草净、异丙隆、乙氧氟草醚和草酮在糙米上的最大残留限量 (MRL) 为0.05 mg/kg，苄嘧磺隆在大米和糙米上的MRL值为0.05 mg/kg，莎稗磷和二甲戊灵在糙米上的MRL值为0.1 mg/kg[4]。随着对除草剂“减施增效”要求的不断提高，除草剂复配施用现象增多[5-8]，对更低剂量的多种除草剂残留同时检测提出了更高的要求。
目前，关于谷物中除草剂残留分析的方法主要有气相色谱法 (GC)[9]、高效液相色谱法 (HPLC)[10-12]、气相色谱-串联质谱法 (GC-MS)[13]和液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)[14-19]等，其中，LC-MS/MS技术结合QuEChERS (Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe) 前处理方法，简化了操作步骤，缩短了分析时间，具有灵敏度高、检出限低和准确性高等优点，已成为谷物中除草剂残留分析的重要手段。例如：Zhong等[18]采用QuEChERS和LC-MS/MS联用技术建立了玉米中双氟磺草胺、氯氟吡氧乙酸以及氯氟吡氧乙酸异辛酯的多残留检测方法；Ni等[19]采用QuEChERS联合LC-MS/MS技术分别建立了大米、玉米、小麦和大豆中乙氧嘧磺隆等4种磺酰脲类除草剂的残留检测方法。但目前尚未见有关同时测定谷物中西草净、异丙隆、苄嘧磺隆、莎稗磷、乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵7种除草剂残留的报道。此外，现已报道的有关谷物中除草剂残留的LC-MS/MS检测技术，大都采用三重四极杆质谱 (QQQ)。与之比较，四极杆飞行时间质谱 (MS/MS Triple TOF) 不仅可达到QQQ的定量灵敏度，且具有更高的分辨率、更简单的质谱条件优化方法和更快的扫描速率，可以获得具有更高准确度的质谱数据和定量限。因此，本研究采用MS/MS Triple TOF检测技术，结合QuEChERS前处理法，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS Triple TOF同时测定大米中7种稻田常用除草剂残留的分析方法。
1 材料与方法 1.1 药剂、试剂与仪器西草净 (simetryn)、异丙隆 (isoproturon)、苄嘧磺隆 (bensulfuron methyl)、莎稗磷 (anilofos)、乙氧氟草醚 (oxyfluorfen)、草酮 (oxadiazon) 和二甲戊灵 (pendimethalin) 标准品，纯度均大于97% (上海市农药研究所有限公司)，其结构式见图式 1；N-丙基乙二胺 (PSA) 吸附剂 (美国Agilent公司)；乙酸乙酯和乙腈均为色谱纯，甲酸为质谱纯 (美国Thermo Fisher Scientific公司)。
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图式1 西草净 (1)、异丙隆 (2)、苄嘧磺隆 (3)、莎稗磷 (4)、乙氧氟草醚 (5)、草酮 (6) 及二甲戊灵 (7) 结构式 Scheme1 Structural formula of simetryn (1), isoproturon (2), bensulfuron methyl (3), anilofos (4), oxyfluorfen (5), oxadiazon (6) and pendimethalin (7) |
LC-20AD高效液相色谱仪 (日本Shimadzu公司)；Triple TOF 5600飞行时间质谱仪 (美国Sciex公司)；ES125SM十万分之一电子天平 (瑞士Precisa公司)；FW135中草药粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)；T25-S1 Ultra-Turrax匀浆机 (德国IKA-Werke公司)；JN25-12D超声波清洗机 (宁波江南仪器厂)；TDL-40B离心机 (上海安亭科学仪器厂)；R-3旋转蒸发仪 (瑞士Buchi公司)；0.22 μm滤膜 (天津腾达公司)；Milli-Q超纯水系统 (美国Millipore公司)。
1.2 样品前处理方法准确称取粉碎过筛 (孔径 0.25 mm) 的大米样品10.00 g于50 mL离心管中，加入25 mL V (乙酸乙酯) : V (水) = 80 : 20的混合溶液，涡旋5 min，超声10 min；加入4.0 g氯化钠，涡旋1 min，于4 000 r/min下离心5 min；取上清液，于40 ℃旋转蒸发至近干，用乙腈定容至1 mL。经50 mg PSA净化，过0.22 μm微孔滤膜，待检测。
1.3 HPLC-MS/MS检测条件色谱条件：Phenomenex Kinetex C18色谱柱 (2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm)；柱温40 ℃；流速 0.25 mL/min；进样量1 μL；以乙腈和含体积分数0.1%甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件见表1。
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表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions |
质谱条件：采用电喷雾离子源正离子扫描模式，离子喷雾电压 5 500 V，离子源温度 550 ℃，雾化气448 kPa，辅助气448 kPa，气帘气241 kPa；质谱数据采集模式为高分辨飞行时间质谱全扫描并同时触发采集高分辨二级质谱 (TOF MS IDA MS-MS) 模式，TOF-MS扫描范围m/z 100~600，IDA MS-MS扫描范围m/z 100~600，去簇电压 80 V，MS-MS碰撞能量 35 eV，扩展碰撞能量15 eV。
1.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 1.4.1 标准储备液的配制分别准确称取一定量的7种除草剂标准品，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱保存。
1.4.2 混合标准溶液的配制分别准确移取1.0 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，配成质量浓度为10 mg/L的混合标准储备液，于4 ℃冰箱保存。准确移取适量混合标准储备液，用乙腈逐级稀释，配制成质量浓度分别为1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001 mg/L的系列混合标准溶液。
1.4.3 基质匹配混合标准溶液的配制取空白大米样品，按1.2节方法处理。向空白基质中定量添加上述混合标准溶液，分别配制成质量浓度为1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001 mg/L的系列基质匹配混合标准溶液。
取系列混合标准溶液与基质匹配混合标准溶液，分别按1.3节条件测定，通过Multiquant软件提取目标物一级母离子的峰面积进行定量分析，以质量浓度为横坐标，以一级母离子峰面积为纵坐标，绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线。
1.5 添加回收试验向大米空白样品中准确添加7种除草剂的混合标准溶液，根据已规定的MRL值，分别制备3个水平的添加样品，每个水平重复 5 次。其中，西草净、异丙隆、苄嘧磺隆和莎稗磷的添加水平均为0.001、0.01和0.05 mg/kg，乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵的添加水平均为0.01、0.05和1 mg/kg。和1.2节方法进行样品前处理和1.3节条件测定，计算平均添加回收率和相对标准偏差 (RSD)。
2 结果与讨论 2.1 色谱及质谱条件的选择通过比较ESI正/负离子检测模式下7种除草剂质谱的响应值，发现7种除草剂在ESI+ 模式下均可得到稳定的[M + H]+ 离子峰，且其响应值会明显优于负离子模式，因此本研究选择在ESI+ 模式下分析样品。乙腈-水是液相色谱-质谱分析中常用的流动相，本研究采用乙腈-0.1%甲酸水为流动相时，7种除草剂均可得到很好的色谱响应值。图1为7种除草剂 [M + H]+ 提取离子流色谱图。为获得精确二级质谱谱图，排除检测假阳性，在TOF IDA MS-MS检测时，优化检测条件，设置二级质谱的碰撞能量为35 eV、扩展碰撞能量为15 eV，使各待测目标物均获得了一张由20、35和50 eV 3种碰撞能下质谱图叠加而成的MS-MS谱图 (图2)。
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1. 西草净 simetryn; 2. 异丙隆 isoproturon; 3. 苄嘧磺隆 bensulfuron methyl; 4. 莎稗磷 anilofos; 5. 乙氧氟草醚 oxyfluorfen; 6. 草酮 oxadiazon; 7. 二甲戊灵 pendimethalin。 图 1 7种除草剂标准溶液 (0.05 mg/L) 的提取离子流色谱图 Fig. 1 Extracted chromatograms of seven herbicide standards (0.05 mg/L) |
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a. 西草净 simetryn；b. 异丙隆 isoproturon；c. 苄嘧磺隆 bensulfuron methyl；d. 莎稗磷 anilofos；e. 乙氧氟草醚 oxyfluorfen；f. 草酮 oxadiazon；g. 二甲戊灵 pendimethalin。 图 2 7种除草剂标准溶液 (0.05 mg/L) 的TOF MS-MS二级质谱图 Fig. 2 TOF MS-MS spectra of seven herbicide standards (0.05 mg/L) |
2.2 前处理方法的选择
在传统QuEChERS方法中，典型的提取溶剂为乙腈，而随着QuEChERS方法研究的不断发展，在实际研究中，研究人员会尝试不同的提取溶剂，以期获得更高的回收率[20]。本研究考察了在0.05 mg/kg添加水平下，分别以V (乙腈) : V(水) = 80 : 20和V (乙酸乙酯) : V(水) = 80 : 20的混合溶液为提取溶剂时7种除草剂的回收率情况。结果 (图3) 表明：采用2种提取溶剂，除草剂的回收率均符合残留试验要求[21]，但后者的回收率整体上优于前者，考虑到乙酸乙酯的毒性低于乙腈，因此本研究选择V (乙酸乙酯) : V(水) = 80 : 20的混合溶液作为提取溶剂。
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图 3 不同提取溶剂对7种除草剂提取效果的影响 (0.05 mg/kg, n = 3) Fig. 3 The extration efficiency by different extraction solvents (0.05 mg/kg, n = 3) |
石墨化碳黑 (GCB) 和PSA是QuEChERS方法中常用的净化剂，GCB可以去除叶绿素等大分子杂质，但会吸附某些具有环状结构的农药，PSA可以去除极性有机酸、脂类和糖类。基于稻米提取液颜色较浅，本研究选用50 mg PSA作为净化剂，结果发现，净化效果和7种除草剂的回收率均能满足残留试验要求[21]。因此，最终选择50 mg PSA作为吸附剂来净化样品。
2.3 方法的线性范围和基质效应按1.4节配制系列混合标准溶液与基质匹配混合标准溶液，按1.3节的条件测定并绘制标准曲线，结果 (表2) 表明：在一定的线性范围内，7种除草剂的质量浓度与对应的峰面积间均呈良好线性关系，相关系数均大于0.99。
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表 2 7种除草剂的线性关系、基质效应和定量限 Table 2 Linear relationships, matrix effects and LOQs of 7 herbicides |
本研究采用基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值来评价基质效应，即当比值在0.8～1.2之间时表现为弱基质效应，当比值小于0.8时为基质抑制效应，当比值大于1.2时为基质增强效应[22]。结果 (表2) 表明：乙氧氟草醚、西草净和草酮的基质效应在0.66～0.77之间，表现为基质抑制效应；异丙隆、二甲戊灵、苄嘧磺隆和莎稗磷的基质效应在0.81～0.99之间，表现为弱基质效应。因此，为消除基质效应的干扰，保证方法的灵敏度和检测结果的准确性，本研究采用基质匹配标准曲线进行定量分析。
2.4 方法的准确度、精密度和灵敏度结果 (表3) 显示：在0.001、0.01和0.05 mg/kg 3个添加水平下，西草净、异丙隆、苄嘧磺隆和莎稗磷的平均回收率在75%~108%之间，RSD在1.1%~7.0%之间；在0.01、0.05和1 mg/kg 3个添加水平下，乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵的平均回收率在81%~108%之间，RSD在2.7%~9.0%之间。以获得合格回收率和RSD的最低添加水平为定量限 (LOQ) 来衡量方法的灵敏度。结果 (表2) 表明：西草净、异丙隆、苄嘧磺隆和莎稗磷的LOQ为0.001 mg/kg，乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵的LOQ为0.01 mg/kg。本方法7种除草剂的定量限均低于中国国家标准中已规定的MRL值[4]。可见，本方法的各项指标均能满足农药残留测定的要求[21]。
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表 3 7种除草剂在大米中的平均添加回收率和相对标准偏差 (RSD) (n = 5) Table 3 The average recoveries and RSD of 7 herbicides in rice (n = 5) |
2.5 实际样品的测定
采用本研究建立的除草剂残留分析方法，对市场上随机抽取的7份大米样品进行检测。结果表明：苄嘧磺隆、莎稗磷、乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵的残留量均低于LOQ；4份样品中检出西草净，含量分别为0.003 1、0.002 7、0.007 3和0.005 1 mg/kg；2份样品中检出异丙隆，含量分别为0.001 4和0.001 6 mg/kg。两者残留量均远低于中国国家标准中规定的西草净和异丙隆在糙米上的MRL值 (0.05 mg/kg)[4]。可见，7份购自市场的大米样品中除草剂残留量均未超标。
3 结论本研究通过优化样品提取方法和液相色谱-串联质谱检测条件，建立了QuEChERS-高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱同时测定大米中西草净、异丙隆、苄嘧磺隆、莎稗磷、乙氧氟草醚、草酮和二甲戊灵残留的方法。本方法样品前处理操作简单，方法的线性范围、检测限、定量限、平均添加回收率及其相对标准偏差等指标均满足农药残留分析要求，适用于大米中常用除草剂多残留的快速、准确定性和定量分析。
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