农药学学报  2019, Vol. 21 Issue (4): 431-436   PDF    
引用本文
蔡刘体, 汪汉成, 陈乾丽, 谭清群, 杨学辉, 马骏. 烟草米根霉对6种杀菌剂的敏感性及菌株保存条件筛选[J]. 农药学学报, 2019, 21(4): 431-436, doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0075   
CAI Liuti, WANG Hancheng, CHEN Qianli, TAN Qingqun, YANG Xuehui, MA Jun. Sensitivity of Rhizopus oryzae to six fungicides and the screening of its preservation conditions [J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2019, 21(4): 431-436, doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0075   
烟草米根霉对6种杀菌剂的敏感性及菌株保存条件筛选
蔡刘体1, 汪汉成1, 陈乾丽2, 谭清群3, 杨学辉3, 马骏4     
1. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081;
2. 贵州大学 农学院，贵阳 550025;
3. 贵州省植物保护研究所，贵阳 550006;
4. 贵州省烟草公司 黔西南州分公司，贵州 兴义 562400
收稿日期: 2019-01-16    录用日期: 2019-05-06
基金项目: 贵州省科技支撑计划 (黔科合支撑[2018]2356)；贵州省烟草公司黔西南州公司科技项目 (201703)；贵州省科技厅优秀青年人才培养计划 (黔科合平台人才[2017]5619)；中国烟草总公司贵州省公司科技项目 (201711，201714)
作者简介: 蔡刘体，男，博士，副研究员，主要从事植物保护研究，E-mail：cailiuti01@163.com.
汪汉成，通信作者 (Author for correspondence)，男，博士，研究员，主要从事植物保护及烟草微生物学研究，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com; 马骏，共同通信作者 (Co-author for correspondence)，男，硕士，农艺师，主要从事烟草植物保护研究，E-mail：25858147@qq.com.
摘要: 采用孢子萌发法测定了烟草上米根霉Rhizopus oryzae对6种杀菌剂 (代森锰锌、多菌灵、嘧霉胺、嘧菌酯、啶酰菌胺及氟啶胺) 的敏感性，并就其适宜的保存条件进行了筛选，同时采用离体叶片法测定了上述6种杀菌剂对烟叶霉烂病的防治效果。结果表明：6种杀菌剂对米根霉孢子萌发和烟叶霉烂病均表现出了不同的抑制活性。其中，抑制孢子萌发活性最为明显的是氟啶胺和啶酰菌胺，其EC90值分别为0.67 和1.53 mg/L；其次为代森锰锌和嘧菌酯，15.16和17.66 mg/L；最弱为嘧霉胺和多菌灵，71.87和81.96 mg/L。对烟叶霉烂病防效最好的为嘧菌酯，50 mg/L处理的防效为85%；其次为啶酰菌胺，200 mg/L处理时防效为83%；氟啶胺的防效较差，1 000 mg/L处理时仅为48%；而代森锰锌、多菌灵和嘧霉胺在最高使用剂量 (分别为4 000、800和800 mg/L) 时防效均低于20%。病原菌保存方法筛选结果表明，保存后米根霉的孢子萌发率均发生了不同程度降低。其中，4 ℃保存于20%甘油组的孢子悬浮液萌发率为60%；4 ℃保存的孢子干样萌发率为36%；4 ℃保存的孢子悬浮液和 –20 ℃保存于20%甘油的孢子悬浮液萌发率均低于20%；20 ℃保存的孢子干样萌发率为11%；–20 ℃保存的孢子悬浮液萌发率为6%。研究结果可为烘烤期烟叶霉烂病防治和米根霉孢子的保存提供参考依据。
关键词: 烟叶霉烂病     米根霉     杀菌剂     嘧菌酯     啶酰菌胺     敏感性    
Sensitivity of Rhizopus oryzae to six fungicides and the screening of its preservation conditions
CAI Liuti1, WANG Hancheng1, CHEN Qianli2, TAN Qingqun3, YANG Xuehui3, MA Jun4     
1. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China;
2. College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Guizhou Institute of Plant Protection, Guiyang 550006, China;
4. Qianxinan Tobacco Company of Guizhou Tobacco Company, Xingyi 562400, Guizhou Province, China
Abstract: The sensitivity of Rhizopus oryzae to six fungicides (mancozeb, carbendazim, pyrimethanil, azoxystrobin, boscalid, fluazinam) and the preservation conditions of this pathogen were determined using the conidia germination method. Efficacy of these fungicides against tobacco pole rot disease was also evaluated on the detached leaves. Results showed that all the six fungicides presented different inhibitory activities against both conidia germination and pole rot. For the conidia germination, the highest inhibitions were found in the cases with fluazinam and boscalid, with EC90 values of 0.67 mg/L and 1.53 mg/L, respectively. Lower inhibition rates were detected in the cases with mancozeb and azoxystrobin (15.16 and 17.66 mg/L). And the lowest inhibition rates were observed in the cases with pyrimethanil and carbendazim (71.87 and 81.96 mg/L). For the disease control efficacy, the highest inhibition rate was observed in the group treated by azoxystrobin at 50 mg/L with the efficacy of 85%. Lower inhibition rate was detected after the boscalid treatment, which showed 83% efficacy at 200 mg/L, while a poor inhibition rate (48%) was observed by fluazinam treatment at the concentration of 1 000 mg/L. And mancozeb, carbendazim, pyrimethanil all exhibited efficacy of < 20% at their respectively highest dosages of 4 000, 800 and 800 mg/L. The screening results of six different pathogen preservation conditions showed that conidia germination ratio of R. oryzae decreased variously by using different methods. The conidia germination ratio of the conidial suspension in 20% glycerol was 60% at 4 ℃, and, for dry conidia samples, that was 36% at 4 ℃. In terms of the conidial suspension stored at 4 ℃ and the conidial suspension stored at –20 ℃, the germination ratios in 20% glycerol were both < 20%. With regard to the dry conidia samples stored at –20 ℃, the conidia germination ratio was 11%, and, for the conidial suspension stored at –20 ℃, that was 6%. Results of this study have provided reference and basis for both the chemical control of tobacco pole rot and the storage of R. oryzae.
Key words: tobacco pole rot      Rhizopus oryzae      fungicide      azoxystrobin      boscalid      sensitivity     

由米根霉Rhizopus oryzae Went et Pr. Geerl.引起的烟叶霉烂病 (tobacco pole rot) 是烟草烘烤期较易出现的真菌性病害[1-2]，主要发生于烟叶变黄期，通常在茎基部出现白色菌丝，很快产生黑色孢子并进一步扩散为害[3]。在烟叶烘烤过程中，密集烤房由于空间小、温度高、湿度大以及空气流动快，尤其有利于该病害的发生与流行。烟叶霉烂病具有爆发性和危害性强的特点，严重时发病率高达100%，常导致烤后烟叶质量下降、产量降低，烟农利益受损[4]。

由于米根霉在生长过程中会产生大量孢囊孢子，其孢囊孢子在烟叶烘烤过程中极易扩散至周边烤房而引起烟叶霉烂病的流行[3]，因此，抑制病原菌孢子的萌发是预防烟叶霉烂病的关键措施之一。目前，关于烘烤过程中烟叶霉烂病的防治，除在烤房中采用三氯异氰脲酸烟熏剂消毒外，还未见有效防治药剂的报道，但该技术烘烤时易产生药害。生产上，农药经销商经常会推荐灰霉病的防治药剂给烟农用于烟叶霉烂病的防治，但防效甚微。笔者等前期测定了米根霉菌丝生长对多菌灵、异菌脲、咪鲜胺、氟硅唑、丙环唑、苯醚甲环唑及嘧菌酯的敏感性[5]，然而，抑制病原菌菌丝生长仅是限制其扩展为害的一个方面，抑制孢子萌发更能从源头预防该病害的流行。因此，寻找能够高效抑制米根霉孢子萌发的杀菌剂，并将其用于烟叶霉烂病的防治，将是解决该病害最为经济且有效的手段之一。

同时，笔者等前期研究发现，除了可导致烟叶霉烂病之外，米根霉还是一种重要的食品和工业微生物，可用于肥料发酵和酿制甜米酒，以及生产富马酸和乳酸等产品，具有较好的食品和工业应用前景[6-7]，因此，有必要对高效的米根霉菌株进行长期保存，以便于进行相关研究和利用。常见的真菌保存方法主要有：低温保存、甘油低温保存以及利用不同载体进行保存等[8-9]。米根霉孢囊孢子易获得，且数量大，适合用作菌株保存材料，科学保存其孢囊孢子是该菌应用的基础，但目前有关保存条件对米根霉孢囊孢子活力的影响尚不清楚。

为了筛选烟叶霉烂病的高效防治措施以及米根霉菌株的长期保存条件，笔者测定了代森锰锌、多菌灵、嘧霉胺、嘧菌酯、啶酰菌胺及氟啶胺6种主要抑制孢子萌发的杀菌剂对米根霉孢囊孢子萌发的毒力，并测定了其对烟叶霉烂病的防治效果，同时考查了保存条件对其孢子萌发活力的影响。

1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 菌株及其培养

米根霉Rhizopus oryzae菌株Y5 (CCTCC M 2015720)，贵州省烟草科学研究院微生物实验室提供，采用真菌培养基 (AEA) [10] (酵母粉5 g/L，KH2PO4 6 g/L，NaNO3 6 g/L，KCl 0.50 g/L，MgSO4 0.25 g/L，甘油20 mL/L，琼脂粉20 g/L，加去离子水定容至1 L，灭菌待用) 培养，于4 ℃下、AEA培养基斜面上保存。

1.1.2 供试植物

烟草品种为云烟87，属烟草主栽品种，易感病。于烟叶成熟季节采集未施用过任何药剂的中部成熟叶片，洗净、晾干后用于活体防效测定。

1.1.3 药剂 1.1.3.1 原药

85%代森锰锌 (mancozeb)，杜邦中国集团有限公司；80%多菌灵 (carbendazim)，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；96%嘧霉胺 (pyrimethanil)，江苏耕耘化工有限公司；98%嘧菌酯 (azoxystrobin)，湖北津乐达化工有限公司；99.90%啶酰菌胺 (boscalid)，Sigma-Aldrich有限公司；96%氟啶胺 (fluazinam)，淄博德樽生物科技有限公司。除代森锰锌用无菌水、多菌灵用0.20 mol/L的稀盐酸配制外，其余药剂均溶于甲醇中，分别配成1.0 × 104 mg/L的母液，于4 ℃黑暗条件下保存，备用。试验时将上述药剂母液加至无菌水中，制成系列质量浓度的药液，其中盐酸或甲醇的体积分数均小于0.25% (此浓度的盐酸或甲醇均不影响烟草米根霉孢子的萌发)。以在空白无菌水中加入相同体积分数稀盐酸或甲醇的处理作为空白对照。

1.1.3.2 制剂

85%代森锰锌可湿性粉剂 (WP)，杜邦中国集团有限公司；50%多菌灵WP，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；40%嘧霉胺WP，北京中农绿洲生物科技有限公司；250 g/L嘧菌酯悬浮剂 (SC，阿米西达)，先正达 (中国) 投资有限公司；50%啶酰菌胺水分散粒剂 (WDG，凯泽)，巴斯夫 (中国) 投资有限公司；500 g/L氟啶胺悬浮剂 (SC，福帅得)，日本石原产业株式会社。

1.2 试验方法 1.2.1 孢子萌发对杀菌剂的敏感性

采用孢子萌发法[11]测定。将米根霉菌株在AEA培养基上培养5 d后，菌丝表面产生大量黑色孢子，向培养皿中加入10 mL无菌水，用无菌纱布过滤并收集孢子，制得每毫升含1 × 106个孢子的悬浮液。分别吸取50 mL各浓度药液，与50 mL孢子悬浮液混合，制得孢子混合液；以相同体积的无菌水和孢子悬浮液混合后作为空白对照。孢子混合液中代森锰锌的最终测定质量浓度为0、3.13、6.25、12.5、25和 50 mg/L；多菌灵和嘧霉胺均为0、12.5、25、50和 100 mg/L；嘧菌酯为0、3.13、6.25、12.5、25和 50 mg/L；啶酰菌胺和氟啶胺均为0、0.13、0.25、0.50、1 和 2 mg/L。分别吸取20 μL孢子混合液至载玻片上，于保湿培养皿中、30 ℃、黑暗条件下培养，每处理3次重复。12 h后随机镜检孢子的萌发情况，当萌发芽管长度超过孢子半径时视为萌发，计算各杀菌剂各浓度处理对病原菌孢子萌发的抑制率[12]。

1.2.2 杀菌剂对烟叶霉烂病的防治效果

将米根霉菌株在AEA平板上培养5 d后，在菌落边缘打取直径5 mm的菌碟。采用无菌水配制系列质量浓度的各制剂药液，其中，代森锰锌最终质量浓度 (有效成分) 分别为0、160、800和4 000 mg/L，多菌灵和嘧霉胺为0、50、200和800 mg/L，嘧菌酯为0、12.5、50和250 mg/L，啶酰菌胺为0、37.5、125和200 mg/L，氟啶胺为0、200、500和1 000 mg/L。采用手动喷雾器 (1.5 L，浙江涛桲喷雾器有限公司) 向离体叶片正面均匀喷雾各浓度药液，直至药液开始滴落，对照喷施同体积的无菌水。施药24 h后，用接种针在叶片主脉同一部位制造相同尺寸伤口，接种直径5 mm的菌碟，每处理6片烟叶，3次重复。接菌后用脱脂棉包裹叶片茎基部保湿，置于37 ℃、相对湿度大于95%的培养箱中培养，48 h后测量叶脉病斑长度，计算各杀菌剂各浓度处理对烟叶霉烂病的防效[13]。

1.2.3 孢子萌发对保存条件的敏感性

按1.2.1节方法制备每毫升含1 × 106个孢子的悬浮液，分别采用以下方法进行保存：1) 4 ℃保存；2) –20 ℃保存；3) 5 000 r/min下离心5 min获得孢子湿样，于30 ℃烘干，孢子干样于4 ℃保存；4) 同上制备孢子干样，于 –20 ℃保存；5) 将孢子悬浮液置于20%甘油溶液中，于4 ℃保存；6) 将孢子悬浮液置于20%甘油溶液中，–20 ℃保存。60 d后，从各保存样品中吸取少量样品，用无菌水分别配制成浓度为每毫升含1 × 106个孢子的悬浮液，参照1.2.1节的方法培育孢子，12 h后调查孢子的萌发情况，统计各保存方法下米根霉孢子的萌发率，以其新成熟孢子的萌发率为对照，评价保存条件对孢子萌发的影响。

1.3 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010软件处理，以药剂质量浓度对数值为横坐标、抑制率几率值为纵坐标绘制毒力回归曲线，计算毒力回归方程及有效抑制浓度 (EC50、EC90) 值。采用DPS (7.05) 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析 2.1 杀菌剂对孢子萌发的影响

结果如表1所示。在测试质量浓度范围内，供试6种杀菌剂对烟草米根霉孢子萌发均表现出了不同程度的抑制作用，其中，抑制活性最强的是氟啶胺和啶酰菌胺，其EC90值分别为0.67和1.53 mg/L；其次为代森锰锌和嘧菌酯，最弱的为嘧霉胺和多菌灵。

表 1 供试6种杀菌剂对米根霉孢子萌发的抑制作用 Table 1 Inhibitory effects of six fungicides against conidia germination of R. oryzae

2.2 杀菌剂对烟叶霉烂病的防治效果

测定结果表明，代森锰锌、多菌灵、嘧霉胺、嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺6种杀菌剂对烟叶霉烂病的防治效果差异显著 (P < 0.05)。施药24 h后接种米根霉，代森锰锌、多菌灵和嘧霉胺各浓度处理组烟叶均有发病，3种药剂在最高质量浓度 (4 000、800和800 mg/L) 下的防效均低于20% (具体数据略)；嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺各浓度处理均能抑制烟叶霉烂病的发生，且随着药剂质量浓度升高，防治效果均逐渐增强。其中嘧菌酯的防效最好，50 mg/L处理时可达85%；其次为啶酰菌胺，200 mg/L处理的防效为83%；氟啶胺的防效相对较差，1 000 mg/L处理时仅为48% ( 表2)。

表 2 供试6种杀菌剂对烟叶霉烂病的防治效果 Table 2 Efficacy of six fungicides against tobacco pole rot

2.3 保存条件对孢子萌发的影响

保存前测得米根霉孢子12 h后的萌发率达89%，经过6种方法保存60 d后，萌发率均显著下降。其中，萌发率最高 (60%) 的为4 ℃保存于20%甘油中的孢子悬浮液；其次分别为4 ℃保存的孢子干样、4 ℃保存的孢子悬浮液及 –20 ℃保存于20%甘油中的孢子悬浮液；而 –20 ℃保存的孢子干样和 –20 ℃保存的孢子悬浮液萌发率均较低 (表3)。

表 3 保存条件对米根霉孢子萌发的影响 Table 3 Effect of storage conditions to the conidia germination of R. oryzae

3 讨论与结论

作为重要的食品和工业微生物，米根霉的保存方法已有诸多报道[14]，然而，有关不同保存条件对其孢子萌发的影响鲜有报道。本研究测定了米根霉在不同保存条件下存放60 d后孢子的萌发活力，发现各种低温保存方法均不同程度地降低了孢子的萌发率。后续还将考查更多种保存条件及不同保存时间等对米根霉孢子活力的影响。

烟叶烘烤过程中变黄期的温度和湿度尤其有利于米根霉的侵染和产孢，同时由于烤房强力排湿的需要，空气流动速度高，十分有利于病原菌的扩散，因此在烟叶烘烤过程中米根霉可造成多次侵染循环[15]。但有关该病害的防治技术鲜有研究报道，目前也没有登记相关防治药剂。笔者前期调研发现，农药经销商推荐给烟农防治烟叶霉烂病的药剂有多菌灵、嘧霉胺和代森锰锌等，这些药剂是否具有防治效果尚不清楚。

李润根等[16]测定了源自龙牙百合的米根霉对申嗪霉素 (phenazine-1-carboxylic acid) 和己唑醇 (hexaconazole) 的敏感性，发现己唑醇对其的抑制活性最强。刘艳祥研究发现，己唑醇对引起红枣软腐病的米根霉的抑制活性最强[17]。笔者等前期研究也发现，氟硅唑、苯醚甲环唑和丙环唑对米根霉菌丝生长具有一定的抑制作用[5]。上述研究均是以抑制病原菌菌丝生长为对象的，而米根霉孢子的萌发才是其侵染烟叶和造成烟叶霉烂病流行的关键，但目前尚未见有关药剂对其孢子萌发抑制活性的研究报道。本研究测定了6种杀菌剂对米根霉孢子萌发的毒力，并评价了其在离体叶片上的防治效果，发现啶酰菌胺、氟啶胺和嘧菌酯对米根霉孢子萌发均具有较强的抑制作用，而代森锰锌、多菌灵和嘧霉胺的抑制作用较弱，此结果与这些药剂对其他作物病原菌孢子萌发的活性间存在差异[11, 13]，其原因可能与米根霉 (无性型真菌) 的分类地位不同有关，米根霉对多菌灵等常规防治药剂的敏感性可能与半知菌类及子囊菌门的病原菌不同，因此，代森锰锌、多菌灵和嘧霉胺等常规药剂并不宜作为烘烤期烟叶霉烂病的防治用药，烟农在病害防治药剂的选择上应慎重考虑农药经销商的推荐意见。

由于烘烤期间难以对烤房内烟叶采取处理措施，因此烟叶霉烂病的防治宜选用具有保护作用的药剂，在烘烤前对烟叶进行处理。本研究发现，采用啶酰菌胺和嘧菌酯处理烟草离体叶片时，能显著抑制霉烂病，具有较强的保护作用，因此这2种药剂可作为烟叶霉烂病防治的备选药剂。此外，生产上发现，烟叶霉烂病主要集中在叶柄处为害，为保障烟叶质量安全，可采取保护性施药措施，定向向叶柄处施药。

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