作为药食同源植物，枸杞在中国栽培历史悠久，也是甘肃省“十大陇药”之一，为甘肃省传统道地药材^[1-2]。2015年甘肃省枸杞种植面积已发展到4.79万hm^{2 [2]}，但随着栽培区连片种植面积的迅速扩大，特别是种植年限、密度与浇灌水平的提高，导致枸杞炭疽病连续大面积爆发流行^[3-4]，使得枸杞果品及产量严重受损，制约了产业的可持续发展。

枸杞炭疽病又称黑果病，是枸杞生产上的一种毁灭性病害，其病原菌有2种：胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz. ^[5]和尖孢炭疽菌C. acutatum Simmons^[6] 。该病不仅危害枸杞青果，同时对成熟果实也会造成严重损失，一般病果率在30%左右，严重时可高达60%以上^[7]。目前对炭疽病仍以化学防治为主，其中，甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂 (DMIs) 以其优异的防治效果而被广泛应用于炭疽病的防治中^[8-12]。苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑是DMIs中的三唑类杀菌剂，不仅具有高效、广谱、低残留、持效期长及内吸性强的特点,而且兼有保护和治疗作用，是目前农业生产中应用最广泛的药剂^[13]。尽管DMIs杀菌剂已被国际杀菌剂抗性行动委员会 (FRAC) 列为低抗性风险药剂^[14-15]，但仍有研究报道表明，炭疽病菌对该类杀菌剂已出现敏感性下降的群体，个别菌株甚至已产生抗药性^[8,10,16-20]。而有关枸杞炭疽病菌对DMIs药剂的敏感性研究与抗药性监测均尚未见报道。为此，本研究采用菌丝生长速率法测定了采自甘肃省不同地区的枸杞炭疽病菌对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑4种DMIs 杀菌剂的敏感性，分析了不同年份及不同地区间枸杞炭疽病菌对上述4种药剂的敏感性差异，以期为 DMIs杀菌剂在枸杞炭疽病防治中的科学使用及抗药性管理提供依据。

2016—2017年从甘肃省枸杞主栽区靖远县五合镇、北滩镇、东湾镇及景泰县草窝滩镇、漫水滩乡、寺滩乡采集枸杞炭疽病病害样本，在室内采用常规组织分离法进行病原菌分离。取发病和健康交界处组织，用1.5%的次氯酸钠溶液表面消毒1~2 min，以无菌水冲洗3次，于无菌滤纸上吸干水分后，置于常规 PDA 培养基上培养，进行病原菌的分离和单孢纯化，根据培养性状、形态学特征以及ITS序列分析，共获得46株胶孢炭疽复合种和56株尖孢炭疽复合种 (表1)，均于 4 ℃斜面上保存。

表 1 (Table 1)

表 1 供试枸杞炭疽病菌菌株及其来源 Table 1 Isolates and sources of Colletotrichum spp. from wolfberry 采样点 Collection location 2016 年菌株数 Number of isolates in 2016 2017 年菌株数 Number of isolates in 2017 胶孢炭疽复合种 C. gloeosporioides species complex 尖孢炭疽复合种 C. acutatum species complex 胶孢炭疽复合种 C. gloeosporioides species complex 尖孢炭疽复合种 C. acutatum species complex 景泰县草窝滩镇 Caowotan, Jingtai 3 2 4 5 景泰县漫水滩乡 Manshuitan, Jingtai 3 2 4 3 景泰县寺滩乡 Sitan, Jingtai 4 2 4 3 靖远县东湾镇 Dongwan, Jingyuan 4 3 6 4 靖远县五合镇 Wuhe, Jingyuan 3 7 4 11 靖远县北滩镇 Beitan, Jingyuan 4 7 3 7 合计 Total 21 23 25 33

表 1 供试枸杞炭疽病菌菌株及其来源 Table 1 Isolates and sources of Colletotrichum spp. from wolfberry

96%苯醚甲环唑 (difenoconazole) ，青岛泰生化工有限公司；95%戊唑醇 (tebuconazole) ，江苏宝灵化工有限公司；97%丙环唑 (proriconazole) ，江苏七洲绿色化工有限公司；95%氟硅唑 (flusilazole) ，山东潍坊润丰化工股份有限公司。上述原药均用丙酮溶解并配制成1 × 10⁴ μg/mL的母液，备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂1 g、蒸馏水1 000 mL。

取苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑母液，分别用体积分数为0.05%的吐温-80水溶液稀释(稀释液中丙酮的体积分数控制在0.1%以下)，将药剂与加热后冷却至50 ℃左右的培养基按照质量比1 : 9混合均匀，配成不同系列质量浓度的含药培养基：苯醚甲环唑0.1、0.2、0.3、0.6、1.0、2.0和2.5 μg/mL，戊唑醇0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5和5.0 μg/mL，丙环唑0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 μg/mL，氟硅唑0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μg/mL。

采用菌丝生长速率法^[21]。将枸杞炭疽病菌菌株接种至PDA平板中央，于28 ℃避光培养5 d后，沿菌落边缘截取直径5 mm的菌丝块，分别接入各含药PDA平板中央，每处理设4次重复，以添加相同浓度吐温-80和丙酮溶液的PDA平板为空白对照。将接种后的平板置于 28 ℃黑暗条件下培养5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，按 (1) 式计算各处理对菌丝生长的抑制率 (I，%)，并建立毒力回归方程，求出有效抑制中浓度 (EC₅₀) 值。

式中：D₀为空白对照菌落增长直径；D_t为药剂处理菌落增长直径。

采用 DPS 7.05软件分析46株胶孢炭疽复合种和56株尖孢炭疽复合种的敏感性频率分布，以 EC₅₀值为x轴，相应的频率 (%) 为y轴，绘制敏感性频率分布图，就不同地区及不同年份枸杞炭疽病菌对不同药剂的敏感性进行单因素方差分析，采用最小显著差异法 (LSD法) 进行检验。

苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑对供试 46 株枸杞胶孢炭疽复合种的EC₅₀值分别介于0.28~1.20、0.11~2.98、0.32~2.84和0.35~3.85 μg/mL之间，最小和最大 EC₅₀值相差 4.29、27.85、8.82和 11.10 倍，平均 EC₅₀值分别为 (0.69 ± 0.19)、(0.83 ± 0.65)、(0.84 ± 0.57) 和 (1.23 ± 0.86) μg/mL。从其敏感性频率分布 (图1) 可看出，供试 46 株胶孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性基本呈连续性分布，其中，苯醚甲环唑 (图1A) 有95.7%的菌株 (44/46)、戊唑醇 (图1B) 有97.8%的菌株 (45/46)、丙环唑 (图1C) 有97.8%的菌株 (45/46)、氟硅唑 (图1D) 有93.5%的菌株 (43/46) 分别集中位于相应的主峰范围内，其敏感性频率分布为连续单峰曲线，说明供试菌株整体对4种药剂主要表现为敏感，但也存在少数敏感性较低的菌株。

图 1 Fig. 1

图 1 供试46株枸杞胶孢炭疽复合种对苯醚甲环唑 (A)、戊唑醇 (B)、丙环唑 (C) 和氟硅唑 (D) 的敏感性频率分布 Fig. 1 Frequency distribution of EC50 values of 46 C. gloeosporioides species complex isolates to difenoconazole (A), tebuconazole (B), proriconazole(C) and flusilazole(D)

苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑对供试 56 株枸杞尖孢炭疽复合种的 EC₅₀值分别介于0.61~1.63、0.35~3.80、0.32~6.21和 0.58~4.74 μg/mL之间，最小和最大 EC₅₀值相差 2.65、10.73、19.35和 8.16倍，平均 EC₅₀值分别为 (0.93 ± 0.20)、(0.83 ± 0.97)、(1.82 ± 1.26) 和 (2.21 ± 1.22) μg/mL。从敏感性频率分布图 (图2) 可看出，供试56株枸杞尖孢炭疽复合种对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑的敏感性频率分布呈多峰曲线，表明供其敏感性均已出现不同程度的分化，部分菌株疑似出现了敏感性下降的现象，但因样品基数较少，也缺乏枸杞炭疽病菌不同菌种对4种药剂的敏感性基线资料，因此是否已存在抗药性菌株还有待进一步研究。

图 2 Fig. 2

图 2 供试56株枸杞尖孢炭疽复合种对苯醚甲环唑 (A)、戊唑醇 (B)、丙环唑 (C) 和氟硅唑 (D) 的敏感性频率分布 Fig. 2 Frequency distribution of EC50 values of 56 C. acutatum species complex isolates to difenoconazole (A),tebuconazole (B),proriconazole(C) and flusilazole(D)

结果 (图3和图4) 表明：2016年的胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑的敏感性与2017年的菌株间均存在显著差异，其中2016年的菌株敏感性相对更高。比较平均EC₅₀值可看出：2016年胶孢炭疽复合种对戊唑醇较敏感，对氟硅唑不敏感，2017年的菌株则对苯醚甲环唑较为敏感，对氟硅唑仍不敏感；2016年与2017年的尖孢炭疽复合种均对苯醚甲环唑较敏感，对氟硅唑则不敏感。就不同病原菌而言，同一年份间尖孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性均低于胶孢炭疽复合种。

图 3 Fig. 3

图 3 不同年份胶孢炭疽复合种对4种DMIS杀菌剂的敏感性比较 Fig. 3 Comparison of sensitivities of C. gloeosporioides species complexes collected in different years to four DMIs fungicides

图 4 Fig. 4

图 4 不同年份尖孢炭疽复合种对4种DMIS杀菌剂的敏感性比较 Fig. 4 Comparison of the sensitivities of C. acutatum species complexes collected in different years to four DMIs fungicides

比较甘肃省景泰县及靖远县6个地区胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种对4种DMIs杀菌剂的敏感性 (表2) 发现：同一县区的胶孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性不存在显著差异，不同县区菌株间则存在一定差异，其中景泰县草窝滩镇的菌株对苯醚甲环唑和丙环唑最敏感，寺滩乡的菌株对戊唑醇和氟硅唑最敏感，而靖远县五合镇的菌株则对4种药剂均最不敏感，但其平均EC₅₀值也并不高，仅在0.79~1.74 μg/mL之间；不同地区间尖孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性则均无显著差异。

表 2 (Table 2)

表 2 甘肃省不同地区2种枸杞炭疽病菌对4种DMIS杀菌剂的敏感性 (EC50，μg/mL) Table 2 Sensitivities of two kinds of Colletotrichum spp. isolates collected from different areas in Gansu Province to four DMIS fungicides(EC50，μg/mL) 菌株采集地 Location 胶孢炭疽复合种 C. gloesporioides species complex 尖孢炭疽复合种 C. acutatum species complex 菌株数 No. of isolate 苯醚甲环唑 difenoconazole 戊唑醇 tebuconazole 丙环唑 proriconazole 氟硅唑 flusilazole 菌株数 No. of isoalate 苯醚甲环唑 difenoconazole 戊唑醇 tebuconazole 丙环唑 proriconazole 氟硅唑 flusilazole 景泰县草窝滩镇 Caowotan, Jingtai 7 0.28 ± 0.10 c 0.45 ± 0.15 b 0.46 ± 0.10 b 0.74 ± 0.42 b 7 0.76 ± 0.14 a 1.09 ± 0.87 a 1.09 ± 0.57 a 1.31 ± 1.00 a 景泰县漫水滩乡 Manshuitan, Jingtai 7 0.45 ± 0.17 bc 0.52 ± 0.03 b 0.51 ± 0.08 b 0.66 ± 0.08 b 5 0.82 ± 0.04 a 0.85 ± 0.27 a 0.85 ± 0.15 a 1.15 ± 0.44 a 景泰县寺滩乡 Sitan, Jingtai 8 0.48 ± 0.13 bc 0.42 ± 0.16 b 0.48 ± 0.10 b 0.65 ± 0.09 b 5 0.89 ± 0.17 a 1.29 ± 1.06 a 1.27 ± 1.00 a 1.58 ± 1.06 a 靖远县东湾镇 Dongwan, Jingyuan 10 0.69 ± 0.11 ab 0.94 ± 0.40 ab 0.94 ± 0.03 ab 1.03 ± 0.49 ab 7 0.89 ± 0.10 a 1.25 ± 0.53 a 1.29 ± 0.53 a 1.66 ± 0.52 a 靖远县五合镇 Wuhe, Jingyuan 7 0.79 ± 0.12 a 1.28 ± 0.87 a 1.39 ± 1.05 a 1.74 ± 1.04 a 18 1.17 ± 0.28 a 1.58 ± 1.14 a 1.76 ± 1.06 a 1.97 ± 1.45 a 靖远县北滩镇 Beitan, Jingyuan 7 0.79 ± 0.35 a 1.15 ± 0.23 ab 1.05 ± 0.59 ab 1.42 ± 0.93 ab 14 0.90 ± 0.12 a 1.39 ± 0.780 a 1.38 ± 0.74 a 1.72 ± 0.92 a 注：表中同列数据后不同字母表示经最小显著差异法 (LSD法) 检验在 P < 0.05 水平差异显著。Note: The different letters in the same column indicated significant difference at P < 0.05 by the least significant difference(LSD) test.

表 2 甘肃省不同地区2种枸杞炭疽病菌对4种DMIS杀菌剂的敏感性 (EC50，μg/mL) Table 2 Sensitivities of two kinds of Colletotrichum spp. isolates collected from different areas in Gansu Province to four DMIS fungicides(EC50，μg/mL)

苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑均属于甾醇脱甲基抑制剂类 (DMI_S)^[22]，该类杀菌剂在低浓度下即对真菌病害具有较高的保护和治疗作用，但不同病原真菌对该类药剂的敏感性也有所不同^[23-24]。本研究发现，供试46株枸杞胶孢炭疽复合种整体对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑表现为敏感，但也存在敏感性较低的菌株，而供试56株枸杞尖孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性则出现了不同程度的分化，部分菌株疑似已出现敏感性下降的现象，是否已产生抗药性菌株还有待进一步研究，但低敏感性菌株的出现，说明病原菌对该类杀菌剂存在一定的抗性风险。因此，为防止枸杞炭疽病原菌群体对DMIs杀菌剂的敏感性进一步下降，在枸杞生产过程中，不仅要继续加强病原菌对该类杀菌剂敏感性的田间监测，同时还应考虑与其他不同作用机理的杀菌剂轮换或交替使用。

有研究表明，不同年份、不同地区间病原菌对DMIs杀菌剂的敏感性与药剂使用年限、施药频次、用量及药剂类型等均有一定关系^{[19, 25-26]}。本研究发现，枸杞胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种对该类药剂的敏感性在2016与2017年间也均存在显著差异，其中2016年的菌株相对2017年的更为敏感。这可能是由于2017年该地区夏季降雨量增加^[27]，而降水量的多少是影响枸杞炭疽病发生及流行的关键气象因子之一，田间为防止炭疽病大发生而增加了施药次数，进而导致了2017年菌株敏感性降低。

不同地区枸杞炭疽病菌对供试DMIs杀菌剂的敏感性测定结果表明，不同地区尖孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性不存在差异性，而胶孢炭疽复合种则存在地区间差异，这可能与采集地菌株数量偏少有关，也可能与不同县区间用药水平及菌株自身的基因突变或群体组成的多样性^[22,28]等因素有关，具体还需待增加菌株数量后进一步研究确认。

DMIs类杀菌剂种类颇多，共包括了三唑类、咪唑类、嘧啶类、吡啶类和哌嗪类^[28]，本研究仅就枸杞炭疽病菌对其中4种三唑类药剂的敏感性进行了初步研究，而要更有效、合理地使用该类药剂，还应进一步研究枸杞炭疽病菌对其他种类药剂的敏感性及交互抗性关系等，根据不同地区菌株对药剂的敏感性水平及抗性发展动态，选择合适的药剂进行田间枸杞炭疽病的防控。