2019, Vol. 21
2. 陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西 杨凌 712100;
3. 陕西省植物化学重点实验室，陕西 宝鸡 721000
2. Shaanxi Province Key Laboratory Research & Development on Botanical Pesticides, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China;
3. Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry, Baoji 721000, Shaanxi Province, China
扁茎黄芪Astragalus complanatus R. Brown为豆科蝶形花亚科黄芪属多年生草本植物，广泛分布于河南、陕西、宁夏、甘肃、江苏、四川、山西、辽宁、吉林、河北及内蒙古等地[1-2]，其干燥成熟种子是名贵中药材沙苑子。当前对沙苑子的化学成分及其药理活性的研究已较为深入，其化学成分主要包括有机酸类、甾醇、三萜类、黄酮类、酚类、鞣质及氨基酸、多肽、蛋白质、微量元素等，具有保肝补肾、固精明目、降压抗炎等功效[3-6]。陕西渭南是中国扁茎黄芪的主产地之一，采种后的茎秆多年来都处于废弃状态，对其化学成分的研究也未见任何报道。为了更好地开发应用扁茎黄芪这一植物资源，笔者对扁茎黄芪植株的化学成分进行了初步的分离及鉴定，并初步研究了所分离化合物对植物细菌的抑菌活性。现将结果报道如下。
1 材料与方法 1.1 植物材料供试植物于2017年10月采自陕西省大荔县，经西北农林科技大学李玉平教授鉴定为扁茎黄芪Astragalus complanatus，标本存于西北农林科技大学植物保护学院农药研究所。
1.2 供试菌株蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白菜软腐病菌Erwinia carotovora、魔芋软腐病菌Erwinia carotovora subsp. carotovora、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae和烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum，均由西北农林科技大学农药研究所提供。
1.3 仪器与药剂Bruker RPX 500MHz核磁共振波谱仪 (以TMS为内标)；Thermo LCQ Advantage MAX质谱仪；薄层色谱用硅胶板 (GF 254)，柱层析硅胶45~75 μm和40~45 μm (青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20 (美国通用电气公司)；WRR熔点仪 (熔点未校正，上海精科仪器有限公司)；微量移液枪 (Eppendorf)；双圈定性滤纸片 (通州电气生物科技有限公司)；MP200A型电子天平 (上海第二天平仪器厂)；LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器 (江阴滨江医疗设备厂)；SW.CJ.IBV型超净工作台 (苏净集团安泰空气技术有限公司)；UV-1800紫外分光光度计 (日本岛津有限公司)；HH.1311.420型电热恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂)。
硫酸链霉素原药 (纯度98%，山东鲁抗医药集团有限公司)。其余所用试剂均为市购分析纯产品。
1.4 扁茎黄芪植株中化学成分的提取与分离取晾干、粉碎的扁茎黄芪植株 (7.3 kg)，用甲醇 (物料比10: 1) 超声浸提3次后用布氏漏斗抽滤，合并提取液，减压浓缩，得到甲醇浸膏 (402 g)。用45~75 μm (200~300目) 柱层析硅胶将甲醇浸膏拌样后于通风橱吹干，研磨成粉后再用同等细度的硅胶湿法装柱，干法上样，流动相依次用石油醚，V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 10: 1、10: 3、10: 5、10: 7、10: 9、1: 1，乙酸乙酯，V (乙酸乙酯) : V (甲醇) = 10: 1、10: 3、10: 5、10: 7、10: 9、1: 1和甲醇梯度洗脱，浓缩后合并相同组分，分别得到F1 (30.97 g)、F2 (9.09 g)、F3 (5.47 g)、F4 (15.82 g)、F5 (21.18 g)、F6 (10.58 g)、F7 (16.37 g)、F8 (24.01 g)、F9 (178.29 g) 和F10 (72.75 g) 共10个组分。取F1 (30.97 g) 用石油醚溶解，加入40~45 μm柱层析硅胶拌样，晾干后研磨成粉，湿法装柱，干法上样，硅胶柱依次用石油醚，V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 50: 1、40: 1、30: 1、20: 1、10: 1、5: 1、1: 1，乙酸乙酯，V (乙酸乙酯) : V (甲醇) = 50: 1、40: 1、30: 1、20: 1、10: 1、5: 1、1: 1和纯甲醇梯度洗脱，收集馏分，减压浓缩，经薄层色谱(TLC)检测后合并相同组分，分别得到F1-1 (2.24 g)、F1-2 (3.42 g)、F1-3 (3.86 g)、F1-4 (5.18 g)、F1-5 (4.66 g)、F1-6 (4.19 g) 和F1-7 (4.45 g) 共7个组分。F1-4继续经硅胶柱纯化[V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 10: 1]得到化合物1 (269.7 mg)。取F2 (9.09 g) 用乙酸乙酯溶解后拌样装柱，流动相依次用石油醚，V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 20: 1、15: 1、10: 1、5: 1、1: 1和乙酸乙酯梯度洗脱，在V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 5: 1极性段分别得到化合物2 (15.2 mg)、3 (296.4 mg) 和4 (9.6 mg)。取F3 (5.47 g) 用乙酸乙酯溶解后拌样装柱，依次用石油醚，V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 10: 1、8: 1、6: 1、4: 1、2: 1、1: 1和乙酸乙酯反复经硅胶柱层析梯度洗脱，在V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 2: 1极性段得到化合物5 (22.5 mg)。取F7 (16.37 g) 用甲醇溶解，依次用石油醚，V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 10: 1、5: 1、2: 1、1: 1，乙酸乙酯和甲醇经硅胶柱层析梯度洗脱和LH-20葡聚糖凝胶柱层析后，用甲醇重结晶得到化合物6 (988.5 mg)。取F8 (21.01 g) 用甲醇溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇反复经硅胶柱层析梯度洗脱，用甲醇重结晶得到化合物7 (20.5 mg)。
1.5 抑菌活性测定 1.5.1 滤纸片法采用滤纸片法[7-9]测定7个化合物的抑菌活性。用移液枪吸取定量的药液于直径为6 mm的滤纸片上，保证每片滤纸上化合物的载样量为50 μg。待溶剂挥发后，将其置于细菌生测皿内并轻轻按压，于4 ℃冰箱中放置1~2 h使药物充分扩散，再移至37 ℃恒温培养箱中培养，于8 h后当细菌均匀地铺满培养皿形成雾面状且阳性对照的抑菌圈可见时观察结果。每处理设3个重复，同时以硫酸链霉素 (0.25 μg/片) 作阳性对照，并设溶剂对照。
1.5.2 最低抑制浓度 (MIC) 的测定采用微量肉汤稀释法 (酶标板)[10]测定化合物5对供试细菌的MIC值。将活化好的供试细菌用Muller-Hinton培养基配制成浓度为106~107个/mL的菌悬液 (OD600 = 0.08~0.1)，根据2倍稀释法将第1~9列设为样品测试列，样品最终质量浓度分别为 600.0、300.0、150.0、75.0、37.5、18.8、9.4、4.7和2.3 μg/mL，第10列为空白培养基对照，第11列为溶剂对照，第12列为阳性对照。每组重复3次。将混合液置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，观察试验现象。最终呈透明澄清状态的处理组所对应化合物的最低浓度即为细菌的MIC值。
2 结果与分析 2.1 化合物结构鉴定采用1H NMR、13C NMR和ESI-MS对化合物1~7的结构进行了鉴定，经与相关文献值分析比对，确定其化学结构为如图式1所示，其中1~4为甾体类，6为肌醇类，5和7为黄酮类。
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图式1 化合物1~7的化学结构 Scheme1 Structural formula of compounds 1-7 |
化合物1：无色针状晶体；m.p. 135~137 ℃ (文献值[11] 134~136 ℃)；ESI MS: m/z 415 [M + H]+；分子式为C29H50O；其 1HNMR谱和 13C NMR谱数据与文献[11]报道一致，故鉴定该化合物为β-谷甾醇。
化合物2：无色针状晶体；m.p. 96~98 ℃ (文献值[12] 98~99 ℃)；ESI MS: m/z 413 [M + H]+；分子式为C29H48O；其 1HNMR谱和 13C NMR谱数据与文献[12]报道的数据一致，故鉴定该化合物为β-sitostenone。
化合物3：白色无定形粉末；m.p. 105~107 ℃ (文献值[13]106~107℃)；ESI MS: m/z 431 [M + H]+；分子式为C29H50O2；其1HNMR谱和13C NMR谱数据与文献[13]的报道一致，故鉴定该化合物为lawsaritol A。
化合物4：白色针状晶体；m.p.177~179 ℃ (文献值[14-15] 176~179 ℃)；ESI MS: m/z 429 [M + H]+；分子式为C28H44O3；其 1HNMR谱和 13C NMR谱数据与文献[14-15]报道的数据一致，故鉴定该化合物为3β-羟基-5α,8α-桥二氧麦角甾-6,22-二烯。
化合物5：乳黄色针状晶体；m.p.151~153 ℃ (文献值[16] 152~153 ℃)；ESI MS: m/z 303 [M + H]+；分子式为C17H18O5；其 1HNMR谱和 13C NMR谱数据与文献[16]报道的数据一致，故鉴定该化合物为3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷。
化合物6：白色颗粒状结晶；m.p.197~199 ℃ (文献值[17] 196~198 ℃)；ESI MS: m/z 195 [M + H]+；分子式为C7H14O6；其1HNMR谱和13C NMR谱数据与文献[17]报道的数据一致，故鉴定该化合物为D-1-O-甲基肌醇。
化合物7：黄色粉末；m.p.277~279 ℃ (文献值[18-19] 279~280 ℃)；ESI MS: m/z 625 [M + H]+；分子式为C28H32O16；其 1HNMR谱和 13C NMR谱数据与文献[18-19]报道的数据一致，故鉴定该化合物为沙苑子苷。
2.2 化合物的抑菌活性滤纸片法测定结果表明：当滤纸片载药量为50.00 μg时，除化合物5和7外，其余5个化合物对8种供试细菌均无明显活性；化合物7只对烟草青枯病菌表现出微弱的活性，其抑菌圈直径为8.50 mm；而化合物5对蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白菜软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌和烟草青枯病菌这7种细菌均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌和烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别达到了18.50 mm和17.50 mm，且抑菌圈透明，说明化合物5对这2种菌的抑制活性较强；对蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和猕猴桃溃疡病菌的抑制活性相当；对枯草芽孢杆菌和白菜软腐病菌的抑制活性相对较差；对魔芋软腐病菌则无明显活性 (表1)。
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表 1 化合物5和7的抑菌活性测定结果 Table 1 Determination of antibacterial activities of compounds 5 and 7 |
对于初筛活性较好的化合物5，又测定了其对8种细菌的MIC值。结果 (表2) 表明：化合物5对蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性均低于阳性对照硫酸链霉素，但对白菜软腐病菌的抑制活性则与硫酸链霉素相当，对猕猴桃溃疡病菌和烟草青枯病菌的抑制活性却高于阳性对照硫酸链霉素。
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表 2 化合物5的MIC值 Table 2 Minimum inhibitory concentrations of compound 5 |
3 结论与讨论
采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶层析，从扁茎黄芪植株中分离得到了7个化合物，分别为β-谷甾醇 (1)、β-sitostenone (2)、lawsaritol A (3)、3β-羟基-5α,8α-桥二氧麦角甾-6,22-二烯 (4)、3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷 (5)、D-1-O-甲基肌醇 (6) 和沙苑子苷 (7)。所有化合物均为首次从该植物的植株中分离得到；抑菌活性测定结果表明，异黄酮类化合物5对蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白菜软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌和烟草青枯病菌这7种细菌均有较好的抑制作用，而沙苑子苷7仅对烟草青枯病菌有微弱活性。
通过与已报道的沙苑子的化学成分[20-21]对比可以发现，β-谷甾醇 (1) 和沙苑子苷 (7) 除了存在于沙苑子中外，在扁茎黄芪的植株中也有分布；此外，本次分离还得到了3个甾体类、1个异黄酮类和1个肌醇类化合物。与文献报道的沙苑子总黄酮的降压降脂、保肝、抑制血小板聚集作用[3-4]不同，本研究首次发现了异黄酮类化合物5的农用抑菌活性。另外，根据化合物5和7结构与生物活性的差异，可以初步推测异黄酮类化合物相对于黄酮苷而言有更好和更广泛的抑菌活性。
总的来说，异黄酮类和甾体类[22]化合物是扁茎黄芪的重要活性成分，这些化合物与其新活性的发现，在一定程度上为扁茎黄芪药用部位以外植株部分的使用价值奠定了化学物质基础，也为扁茎黄芪废弃秸秆的合理利用提供了研究基础。
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