2019, Vol. 21
卟啉类物质是一类天然光敏剂[1-3]，在防治病虫害方面效果显著[4]，是一种高效、低毒的光活化农药[5]，其中脱镁叶绿酸a (pheophorbide a) 是其代表性化合物之一[6]。脱镁叶绿酸a是由叶绿素脱去镁离子后进一步水解而成的产物，目前已具备从天然成分中提取的技术[7-8]。研究表明，脱镁叶绿酸a具有显著的抗肿瘤[9-11]、抗菌[12-14]、抗病毒[15-17]以及杀虫活性[18]。其水溶性钠盐为脱镁叶绿酸钠 (sodium pheophorbide a)，能迅速被植物细胞吸收，抑菌效果强于脱镁叶绿酸a。目前脱镁叶绿酸钠的制备技术也较为成熟[19]。光敏剂的生物活性可受光照条件的影响。已有研究表明，不同光源照射对光敏剂的抑菌活性有影响[20]，但有关不同的光照条件对光敏剂抑菌活性的影响尚未见报道。
樟子松Pinus sylvestris var. mongolica是东北山地、水源林区主要造林树种之一。樟子松黑点针枯病是由忽视拟盘多毛孢Pestalotiopsis neglecta引起的樟子松病害，侵染传播能力很强，是一类危险性病害[21]。因此，本研究选用光活化农药脱镁叶绿酸钠为研究对象，采用菌丝生长速率法测定了其对忽视拟盘多毛孢的抑制作用，并进一步探索了光照度、波长及光照时间对其抑菌活性的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株忽视拟盘多毛孢Pestalotiopsis neglecta由黑龙江省森林保护重点实验室提供，用PDA培养基于25 ℃恒温培养。
1.1.2 主要试剂脱镁叶绿酸钠 (纯度99%) 购于浙江海宁凤鸣叶绿素有限公司，其他试剂均为分析纯，购于天津市富宇精细化工有限公司。
1.1.3 光源红色T5 LED灯管，波长620 nm；黄色T5 LED灯管，波长580 nm；绿色T5 LED灯管，波长550 nm；蓝色T5 LED灯管，波长470 nm；紫色T5 LED灯管，波长420 nm (以上灯管功率：5 W，RVILIDA有限公司，中国深圳)[22]。
培养箱内置LED灯管 (白光，功率5 W，色温5 700 K，欧普照明股份有限公司，中国广东)。
1.2 光敏抑菌活性试验以无菌水为溶剂配制脱镁叶绿酸钠质量浓度分别为1.25、2.5、5、10和20 mg/mL的药液，使用前过0.22 μm微孔滤膜。采用菌丝生长速率法[23]测定脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢菌丝生长的抑制作用。分别在光照 (照度2 000 lx，距光源28 cm) 及黑暗条件下于25 ℃恒温培养5 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。每处理设3个重复，试验重复3次。
1.3 光照条件对脱镁叶绿酸钠抑菌活性的影响 1.3.1 照度对抑菌活性的影响分别将脱镁叶绿酸钠溶液 (8.57 mg/mL) 置于不同照度——0、1 000 lx (距离光源34 cm)、2 000 lx (距离光源28 cm)、4 000 lx (距离光源21 cm)、8 000 lx (距离光源18 cm) 和16 000 lx (距离光源12 cm) 条件下照射1 h后，采用1.2节方法测定不同照度下脱镁叶绿酸钠的抑菌活性。
1.3.2 光波长对抑菌活性的影响分别将脱镁叶绿酸钠溶液 (8.57 mg/mL) 置于不同光波长的光源 (波长分别为420、470、550、580、620 nm以及白光) 且距光源21 cm (照度为4 000 lx) 的条件下照射1 h后，按1.2节方法测定抑菌活性。
1.3.3 照时间对抑菌活性的影响分别将脱镁叶绿酸钠溶液 (8.57 mg/mL) 置于培养箱内置LED灯管下距光源21 cm处 (照度4 000 lx)，照射不同时间 (0、3、6、12、24和48 h) 后，按1.2节方法测定抑菌活性。
1.3.4 数据统计分析采用Microsoft Office Excel 2013和Origin Lab Pro 9.0软件进行数据的处理与分析，SPSS 20.0软件进行Probit分析以及卡方检验。
2 结果与分析 2.1 脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢的抑菌活性菌丝生长速率法测定结果 (图1) 表明：在光照和黑暗条件下，经不同浓度脱镁叶绿酸钠处理的忽视拟盘多毛孢菌丝在PDA培养基上均有生长，其中，20 mg/mL的脱镁叶绿酸钠药液在光照及黑暗条件下对菌丝生长的抑制率分别为83.7%和77.0%。
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注：图中不同小写字母表示不同浓度间抑制作用存在显著差异 (P < 0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different concentrations (P < 0.05). 图 1 不同质量浓度脱镁叶绿酸钠在光照和黑暗条件下对忽视拟盘多毛孢菌丝生长的抑制作用 Fig. 1 Inhibitory effects of different concentrations of sodium pheophorbide a on the growth of P. neglectaunder under light and dark conditions |
利用SPSS 20.0软件进行Probit分析，分别得到脱镁叶绿酸钠在光照和黑暗条件下的毒力回归方程和EC50值，见表1。结果表明：在光照及黑暗条件下脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢菌丝生长的EC50值分别为8.57 mg/mL和10.8 mg/mL，经t检验，发现二者之间存在显著差异 (P < 0.05)，证明脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢有光敏抑制作用。
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表 1 光照和黑暗条件下脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢菌丝生长的抑制作用 Table 1 Inhibitory effects of sodium pheophorbide a on mycelial growth of P. neglecta under light and dark conditions |
2.2 光照条件对脱镁叶绿酸钠抑菌活性的影响 2.2.1 照度的影响
结果表明：经不同照度的白色光照射后，随着照度的增加，8.57 mg/L的脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢的抑制作用呈上升趋势。当照度较弱 (1 000 lx) 时，抑制率仅为17.65%，与黑暗条件下的抑制率间无显著差异 (P > 0.05)；当照度增强至4 000 lx时，抑制率显著增加，为32.35%；进一步增强照度，抑菌活性有了显著提高 ( P < 0.05)，在8 000 lx下抑制率达55.88%，而照度为16 000 lx (本试验的极限光强) 时，抑制率可达76.17%。可见，照度是使脱镁叶绿酸钠表现出抑菌活性的关键因子之一 (见 图2)。
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注：图中不同小写字母表示不同光照条件间存在显著差异 (P < 0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different light intensity (P < 0.05). 图 2 照度对脱镁叶绿酸钠(8.57 mg/L)光敏抑菌活性的影响 Fig. 2 Effect of light intensity on antifungal activity of sodium pheophorbide a (8.57 mg/L) |
2.2.2 光照波长的影响
结果(图3)表明：白光照射后忽视拟盘多毛孢的菌丝直径最小，抑菌活性最强，抑制率为33.60%；在单色光处理中，抑菌作用由大到小依次为：绿光 (550 nm) > 蓝光 (470 nm) > 黄光 (580 nm) > 紫光 (420 nm) > 红光 (620 nm)，且各处理间差异不显著 ( P > 0.05)。
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注：图中不同小写字母表示不同光照波长间存在显著差异 (P < 0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different light wavelength (P < 0.05). 图 3 光照波长对脱镁叶绿酸钠(8.57 mg/L)光敏抑菌活性的影响 Fig. 3 Effect of light wavelength on antifungal activity of sodium pheophorbide a (8.57 mg/L) |
2.2.3 光照时间的影响
经不同时间的白光 (照度为4 000 lx) 照射后，脱镁叶绿酸钠的抑制作用随光照时间的延长呈现先升高后降低的趋势，当光照24 h时，抑制作用达最大，抑制率为35.96%。光照时间为3、6、12、48 h的处理组之间差异不显著 (P > 0.05)，但均与24 h处理组差异显著 ( P < 0.05)( 图 4)。表明经4 000 lx白光处理24 h后，脱镁叶绿酸钠表现出了最优的光敏抑菌活性。
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注：图中不同小写字母表示不同光照时间之间的存在显著差异 (P < 0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different light duration (P < 0.05). 图 4 光照时间对脱镁叶绿酸钠(8.57 mg/L)光敏抑菌活性的影响 Fig. 4 Effect of light time on antifungal activity of sodium pheophorbide a (8.57 mg/L) |
3 结论与讨论
本研究结果表明，脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢的菌丝生长有显著抑制作用，在 (LED白光、照度4 000 lx条件下照射5 d，20 mg/mL的脱镁叶绿酸钠对忽视拟盘多毛孢菌丝生长的抑制率为83.7%，EC50值为8.57 mg/mL；在黑暗条件下的抑制率为77.0%，EC50值为10.8 mg/mL。
弱光条件 (1 000 lx) 对脱镁叶绿酸钠的抑菌活性无显著影响，但当光照度达到2 000 lx及以上时，药液的抑菌活性显著增加 (P < 0.05)，在光照度为8 000 lx时抑制率为55.88%，光照度为16 000 lx时，抑制率可达76.17%，但在16 000 lx条件下，药液会有一定程度的分解。这是由于光活化农药主要利用光动力杀菌原理，依靠光敏剂将光的能量传递给周围的氧气，生成活性很强的单态氧，单态氧与附近的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性，进而具有杀菌作用 [24]。因此光照度越大，单态氧的浓度越高，光动力杀菌效果越强，即脱镁叶绿酸钠的抑菌活性越强。需要注意的是，理论上光照度越强，药液的抑菌效果应越显著，但本研究表明：过强的照度 (16 000 lx) 会导致脱镁叶绿酸钠分解，反而不利于药效的发挥，但这个临界光照度尚待探索。
光波长对脱镁叶绿酸钠的抑菌活性有影响，其中白光的影响显著，单色的影响不显著，抑菌作用效果由强到弱为：白光 > 绿光 > 蓝光 > 黄光 > 紫光 > 红光。由于卟啉类光敏物质在紫外和可见光区的所有波段都有吸收 [25]，在自然环境中有光照的情况下，卟啉类物质一直能进行光敏抑菌作用。本研究结果证明：在可调控的环境中，白色光照射施药的区域药效较佳，而在其他单色光条件下，则在绿光波段下药液效果更佳。
本研究表明：在照度为4 000 lx的白光照射下，不同光照时间对脱镁叶绿酸钠的光敏抑菌活性有影响，按照抑菌活性从大到小依次为24 h > 48 h > 12 h > 6 h > 3 h > 0 h。这可能是因为随着光照时间的增加，药液作用愈加充分，累积进行的光氧化反应不断增多，从而使药液抑菌效果不断增强，但24 h之后，抑菌效果开始减弱，针对不同浓度药液的临界光照时间有待进一步筛选。
本研究结果为日后将脱镁叶绿酸钠作为光活化农药的主要有效成分来防治植物病害提供试验理论基础，为开发利用新型光活化农药提供研究基础。
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