中国是世界上荔枝Litchi chinensis Sonn. 栽培面积最广和产量最大的国家，主要集中在海南、广东、广西、福建、四川和云南 6 个省、区^[1]。有机酸是指含有羧基、磺酸基及亚磺酸基等基团的酸性有机化合物。植物体内含有多种机酸，如酒石酸、苹果酸、莽草酸及抗坏血酸等，具有软化血管、促进微量元素吸收、帮助胃液消化等功能^[2]，是衡量果实口感和风味等内在品质的重要指标之一，也是判断果实加工特性、成熟特性及贮藏特性等的重要指标。有机酸易溶于水，难溶于有机溶剂^[3]。目前已有采用高效液相色谱技术检测南山荔枝及荔枝酒中有机酸含量的报道^[4-9]，而不同地域、不同种类及不同新鲜程度的荔枝中有机酸的组分和含量分布均有可能不同。此外，已有报道表明，农药的使用及残留可能会影响果实的品质，如：嘧菌酯可提高人参果中糖的含量^[10]；阿维菌素和联苯菊酯可增加柑橘中可滴定酸含量，同时降低有机酸中抗坏血酸的含量^[11]；丁氟螨酯会对苹果的风味物质产生影响^[12]等。

目前关于有机酸含量的分析方法主要有分光光度法^[13]、气相色谱法 (GC)^[14-15]、高效液相色谱法 (HPLC)^[15-22]、离子色谱法^[23]、离子色谱-质谱联用法^[3]和液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)^[24-25]等。采用分光光度计检测有机酸不能准确定量且检出限较高 (> 1 mg/L)，不适用于微量有机酸 (检出限 < 1 μg/L) 的分析；GC法在分析前需采用硫酸和三氯甲烷等将有机酸进行衍生化，所用试剂的毒性及危险性均较高，且步骤繁琐，不适于批量样品的分析；采用HPLC和离子色谱法分析时，多种不同有机酸之间不能达到良好的分离效果，且易受基质干扰，导致定性和定量结果均不准确，且可分析的有机酸种类较少。HPLC-MS/MS方法是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的分析方法，具有基质干扰少、方法灵敏度高的特点，综合运用保留时间、母离子、子离子和多反应监测模式等仪器条件，能够确保目标分析物定性及定量结果的准确性，是目前公认的高效检测技术^[26-28]。但目前尚未见采用HPLC-MS/MS法测定荔枝中有机酸含量的报道。

本研究采用HPLC-MS/MS技术，建立了同时测定鲜荔枝果肉中10种有机酸含量的分析方法，样品采用超纯水提取，在7 min内能够完成10种有机酸的快速分析，且各有机酸的灵敏度和准确度均较高，峰形对称，可极大地提高样品的分析效率。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

Agilent LC-1200高效液相色谱-AB SCIEX 4000Q TRAP串联质谱仪，配电喷雾离子 (ESI^–) 源；Milii-Q超纯水机 (美国Millipore公司)；XW-80A涡旋仪 (上海精密科学仪器有限公司)。

试剂乙腈、甲醇及甲酸为色谱纯。10种有机酸标准品：富马酸 (fumaric acid，≥ 98%)、柠檬酸 (citric acid，≥ 98%)、草酸 (oxalic acid，≥ 99%)、苹果酸 (malic acid，≥ 98%)、酒石酸 (tartaric acid，≥ 98%)、乳酸 (lactic acid，≥ 98%)、琥珀酸 (amber acid，≥ 98%)、莽草酸 (shikimic acid，≥ 98%)、丙酮酸 (pyruvic acid，≥ 98%) 及抗坏血酸 (ascorbic acid，≥ 99%) 均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 标准溶液配制

准确称取适量各有机酸标准品，用体积分数为50%的甲醇水溶液稀释，配制成1 000 mg/L的标准储备液；分别准确吸取1 mL各标准储备液，用含体积分数为0.1%甲酸的乙腈溶液定容至10 mL，配制成100 mg/L的混合标准工作溶液，于 –20 ℃避光保存。

1.3 样品前处理方法

取用高速组织捣碎机捣碎并经3层纱布过滤后的鲜荔枝汁2 mL，加入8 mL超纯水，混匀，超声2 min，于10 000 r/min下离心5 min；根据目标物含量再将上述溶液分别用超纯水稀释10、100和500倍，过0.22 μm水系滤膜后，按照稀释倍数从大到小的顺序进行HPLC-MS/MS测定。

1.4 色谱-质谱检测条件

Poroshell-120 EC-C₁₈色谱柱 (100 mm × 3.0 mm，2.7 μm)；柱温40 ℃；流动相：V(0.1%甲酸水溶液): V(乙腈) = 95: 5，等度洗脱，流速0.5 mL/min；进样量10 μL；分析时间7 min。

ESI离子源，负离子扫描；多反应离子监测模式；离子源温度350 ℃；气帘气压力0.12 MPa；毛细管电压 –4 500 V；雾化气压力0.35 MPa；加热辅助气压力0.35 MPa。其他质谱参数见 表1。

2 结果与讨论 2.1 前处理方法优化

分别考察了乙酸乙酯、丙酮和超纯水作为提取溶液时目标分析物的回收率。结果显示：因有机酸易溶于水，难溶于有机溶剂，因此以超纯水作为提取溶剂能够将10种有机酸完全提取，具有良好的提取效率，故选择超纯水作为提取溶剂 (图1)。

2.2 仪器方法优化 2.2.1 流动相选择

待测10种有机酸均为弱酸，需调节流动相系统为弱酸条件以防止有机酸解离。10种有机酸的pKa值在4.0~6.5之间，当pH值与pKa值相近时，流动相中的中性分子和离子型分子浓度相同，组分处于相对稳定的状态，适于定性及定量分析。因此本研究通过向流动相水相中加入体积分数为0.1%的甲酸，可以促成丰度较高的[M–H]^– 脱氢准分子离子峰的形成，以[M–H]^– 作为母离子能够获得高强度的离子碎片，增强目标化合物的响应值，进而提高仪器检测的灵敏度。分别考察了以甲醇-水和乙腈-水作为流动相时对目标化合物分离度和响应值的影响。结果显示：由于甲醇的黏度较大易引起柱压升高^[29]，容易损坏色谱柱及相关仪器配件，而乙腈-水对目标化合物的分离度和响应性均较好，是ESI^– 模式下优先选择的流动相组成 (相关谱图见图2)。

2.2.2 流速选择

考察了0.5、1.0及1.25 mL/min 3 种流速下目标化合物的出峰时间、峰形、仪器压力及分离度等情况。结果显示：当流速为0.5 mL/min时，仪器的压力较小，分析物峰宽较大，且保留时间较长，响应值不高，灵敏度差；当流速为1.25 mL/min时，液相系统压力高，对色谱柱影响较大；当流速为1.0 mL/min时，压力适中，响应值高，灵敏度好，总出峰时间缩短至7min。综合考虑各种因素，最终选择流速为1.0 mL/min。

2.2.3 质谱条件优化

采用单针自动进样分析目标化合物标准溶液 (100 μg/L)，以优化质谱参数；选择响应值最高且干扰最少的2个碎片离子为定性和定量离子，进行碰撞能量的优化。结果表明：采用电喷雾离子源负离子 (ESI^－) 及多反应离子监测模式，能够实现10种有机酸的定量分析。虽然采用单级质谱也可以进行分析，但由于荔枝基质的干扰相对较大，仪器灵敏度相对较差。

2.3 方法学评价 2.3.1 线性范围和检出限

在0.1~10 mg/L范围内，10种有机酸的峰面积 (y) 与对应质量浓度 (x，mg/L) 间呈良好线性关系，相关系数均大于0.99(表2)。以3倍和10倍信噪比 (S/N) 分别确定得方法的检出限 (LOD，0.1~0.8 μg/kg) 和定量限 (LOQ，0.2~2.5 μg/kg)，发现其均远远低于离子色谱-质谱法的LOD(0.2~0.5 mg/kg) 和LOQ(0.5~1.0 mg/kg) 值^[3]。

2.3.2 添加回收率及相对标准偏差

在已知有机酸含量的鲜荔枝样品中分别添加不同浓度的有机酸标准工作溶液 (分别相当于有机酸原浓度的0.5倍和检测样品浓度中的最高值)，重复5次，结果取平均值，计算相对标准偏差。结果表明：在不同添加水平下，待测10种有机酸在荔枝中的平均添加回收率为91%~99%，相对标准偏差 (RSD) 为1.9%~7.9% (表3)。

2.4 方法实际应用

采用所建立的方法，对采自广东省不同地区、不同品种的鲜荔枝果肉样品进行了检测，结果 (表4) 显示：不同地区及不同品种鲜荔枝果肉中有机酸的含量不同，表明不同地域的气候特征、环境条件及品种等因素会导致荔枝果肉中有机酸含量的差异，从而影响荔枝的风味及品质。

3 结论

本研究建立了采用高效液相色谱-串联质谱仪分析鲜荔枝果肉中10种有机酸含量的方法，并考察了提取溶剂、流动相组成及流速等条件参数对目标化合物分离度和响应值的影响。方法简便、可靠，可用于鲜荔枝样品中有机酸的快速准确定性及定量分析，同时可为其他水果中有机酸的测定提供参考。