灰霉病病原菌为灰葡萄孢Botrytis cinerea，是一种兼具强适应性和广寄主性的病原真菌，能引起200余种植物的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窖，并造成严重的经济损失^[1]。烟草灰霉病 (tobacco grey mould) 是烤烟生产过程的重要真菌性病害，于1982年在日本黄花烟草上首次被发现^[2]，随后在新西兰、英国等多个国家陆续有报道^[2-3]，于20世纪90年代开始在中国黑龙江省东部及云南、贵州等烤烟主产区相继出现^[3]。该病害在苗期和成熟期均会发生，烟苗被侵染后主要表现为黑茎、枯萎、叶斑，重者可导致成丛腐烂及死亡^[4]。烟草灰霉病具有潜伏期短、流行速度快等特点，在环境有利的条件下，短时间内即可造成大面积流行^[5]。

目前对灰霉病防治的主要手段依然是施用化学药剂，多菌灵、嘧霉胺、异菌脲和丙环唑等均为高效低毒的内吸性杀菌剂，杀菌谱广泛，是多种作物灰霉病防治的主要药剂^[6-8]，但目前均尚未见在烟草上登记使用。烟草生产上由于烟农对灰霉病缺乏认识，常采用代森锰锌、硫酸铜等药剂进行苗期病害的防治，而有关多菌灵、嘧霉胺、异菌脲和丙环唑等药剂对烟草灰霉病防治的研究鲜有报道。因此，本研究测试了多菌灵等4种杀菌剂对烟草灰霉病菌的室内生物活性和离体抑制作用，旨在评价这4种杀菌剂对烟草灰霉病的防控效果，为该病害的科学防治提供依据和参考。

1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 菌株

供试病原菌来源于贵州省烤烟种植区采集的感烟草灰霉病烟叶，采用常规组织分离法^[9] 分离获得，综合其外观形态特征、生化培养特性及分子生物学特征 (ITS区序列分析) 等鉴定为灰葡萄孢Botrytis cinerea^[3]，分别编号为3、3-2、4和6，用于杀菌剂对菌丝生长及孢子萌发的抑制作用测定。随机选取菌株3-2用于杀菌剂对离体叶片的防效测定。4个供试菌株均于4 ℃下保存于PDA斜面。

1.1.2 杀菌剂

80%多菌灵 (carbendazim) 原药，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；97.30%异菌脲 (iprodione) 原药，泰安圣聚华有限公司；96%嘧霉胺 (pyrimethanil) 原药，江苏耕耘化工有限公司；95%丙环唑 (propiconazole) 原药，上海艾科思生物公司。盐酸和甲醇均为分析纯。将多菌灵溶于0.20 mol/L的稀盐酸，其余药剂均分别溶于甲醇，配成1.0 × 10⁴ mg/L的母液，4 ℃黑暗保存，备用。母液中盐酸和甲醇的体积分数均小于0.25%，预试验表明，此含量的盐酸和甲醇不会影响烟草灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发 (数据略)。分别制备含上述杀菌剂的PDA平板。以无菌水中加入相同体积的盐酸或甲醇作为空白对照。

50%多菌灵可湿性粉剂 (WP)，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；50%异菌脲可湿性粉剂和400 g/L嘧霉胺悬浮剂 (SC)，拜耳作物科学 (中国) 有限公司；25%丙环唑乳油 (EC)，先正达 (中国) 有限公司。各药剂商品制剂用于离体叶片的保护和治疗作用测定。

1.2 试验方法 1.2.1 室内生物活性测定 1.2.1.1 对菌丝生长的抑制作用

采用菌丝生长速率法^[10]测定。将分离所得烟草灰霉病菌菌株接种于PDA平板上，于25 ℃、黑暗条件下预培养7 d，打取直径5 mm的菌碟，接种于直径9 cm、含系列质量浓度杀菌剂的PDA平板上，每处理重复3次。以无菌水中加入相同体积分数甲醇作为空白对照 (下同)。按照预试验结果，4种杀菌剂的最终测试系列质量浓度分别为：多菌灵0、0.01、0.02、0.03、0.06、0.13及0.25 mg/L；异菌脲0、0.06、0.12、0.25、0.50、1及2 mg/L；嘧霉胺0、0.13、0.25、0.50、1、2及4 mg/L；丙环唑0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50及5 mg/L。接菌后将平板置于25 ℃、黑暗条件下培养，当空白处理菌落直径接近2/3培养皿直径时，采用“十字交叉法”测量各处理菌落直径，计算各杀菌剂不同浓度处理对病原菌菌丝生长的抑制率。

1.2.1.2 对孢子萌发的抑制作用

采用孢子萌发法^[11]测定。将供试菌株接种于PDA培养基上，于25 ℃、黑暗条件下预培养7 d后，转至15 ℃、黑暗培养7 d，诱导产生分生孢子。用灭菌牙签挑取含分生孢子的菌丝至无菌水中，于1 000 r/min离心5 min，去除上清液，加入无菌水，振荡制取浓度为每1 mL含10⁵个孢子的悬浮液。

取500 μL孢子悬浮液，与同体积系列质量浓度的杀菌剂溶液于2 mL离心管中混合，以同体积无菌水 (含相同浓度盐酸或甲醇) 为空白对照。分别取100 μL混合液滴于载玻片上，置于培养皿中保湿，于25 ℃、黑暗条件下培养12 h，每处理重复3次。多菌灵和丙环唑的最终供试质量浓度为0、12.5、25、50和100 mg/L；异菌脲和嘧霉胺的最终供试质量浓度为0、5、10、20及40 mg/L。按孢子芽管长度大于其短半径时视为萌发，当空白对照孢子萌发率达90%以上时，检查各处理孢子萌发情况，计算各杀菌剂不同浓度处理对孢子萌发的抑制率。

1.2.2 离体叶片防效测定

供试烟草品种为红花大金元，易感灰霉病。取团棵期长势一致的相同部位烟叶，从茎基部剪下，洗净晾干，作为接种材料。

1.2.2.1 保护作用测定

用无菌水将50%多菌灵WP、50%异菌脲WP、400 g/L嘧霉胺SC及25%丙环唑EC分别配制成不同浓度药液，随机均匀喷洒在离体叶片上，空白对照喷施相同体积的无菌水，24 h后用接种针在叶片相同部位制造相同的伤口。取直径7 mm的菌碟接种于伤口处，菌丝面紧贴叶片，每处理6片烟叶，3次重复。多菌灵、异菌脲、嘧霉胺和丙环唑的最终供试质量浓度 (按有效成分计) 均为0、3.13、12.5、50、200和800 mg/L。离体叶片茎基部用无菌水浸湿的脱脂棉保湿，置于25 ℃、相对湿度大于90%的培养箱内培养5 d后，测量叶片病斑长度和宽度，计算病斑面积^[12]。

1.2.2.2 治疗作用测定

将菌碟接种于叶片伤口处24 h后，再均匀喷洒梯度质量浓度的药液，其余同1.2.2.1节。

1.3 数据处理

采用SPSS(19.0) 软件进行数据统计分析，以杀菌剂质量浓度的对数为横坐标，其对病原菌菌丝生长或孢子萌发抑制率的对数为纵坐标，建立线性回归方程，并进行差异显著性分析。根据回归方程，计算杀菌剂的有效抑制浓度EC₅₀和EC₉₀值。

2 结果与分析 2.1 杀菌剂对烟草灰霉病菌菌丝生长的抑制作用

在测试质量浓度范围内，4种杀菌剂对烟草灰霉病菌菌丝生长均表现出显著的抑制作用。其中，多菌灵的抑制活性最强，其次分别为丙环唑、嘧霉胺和异菌脲 (表1)。

从表1中还可看出，不同菌株对4种杀菌剂的敏感性也存在一定差异。其中，菌株3对多菌灵较为敏感，而菌株4则对其表现为不敏感；异菌脲对菌株6的EC₅₀值约为对其他菌株EC₅₀值的2倍；嘧霉胺对菌株3-2的EC₅₀值则仅为对其他菌株EC₅₀值的1/3~3/5；丙环唑对菌株4的抑制活性较强，其EC₅₀值与对菌株3的EC₅₀值相差了7.6倍。

2.2 杀菌剂对烟草灰霉病菌孢子萌发的抑制作用

结果 (表2) 表明：4种杀菌剂对烟草灰霉病菌孢子萌发的抑制作用存在极显著差异，其中异菌脲和丙环唑的抑制活性较强，EC₅₀值分别仅是活性最差的多菌灵的1/64和1/59；但不同菌株之间对异菌脲和丙环唑的敏感性差异均不显著，对多菌灵和嘧霉胺的敏感性则差异较大，其中，多菌灵对菌株6的EC₅₀值是对菌株3的EC₅₀值的2.40倍，嘧霉胺对菌株3和6以及菌株3-2和4之间EC₅₀值差异较小，但对菌株6的EC₅₀值分别是对菌株3-2和4的EC₅₀值的5.85和3.74倍。

上述结果中，不同菌株间对同一药剂的敏感性差异可能是由于不同采样地区的用药历史背景不同所致。丁中等^[13]的研究也表明，用药水平和用药历史与灰霉病菌的抗药性相关。

2.3 杀菌剂对离体叶片的保护和治疗作用

结果 (表3) 表明：在测试质量浓度范围内，4种杀菌剂对离体叶片上的烟草灰霉病均有较好的保护和治疗作用防效，且不同药剂之间存在显著差异，其中，保护作用和治疗作用防效较强的为多菌灵和异菌脲。

3 结论与讨论

灰霉病是烟草生产集约化育苗期和成株期危害性较强的真菌性病害，但目前相关研究多集中在其对草莓、番茄及葡萄等经济作物^[1-2] 的栽培期及产后为害上，有关烟草灰霉病防治的研究报道较少。宫飞燕等^[14] 测定了8种杀菌剂对烟草灰霉病菌的室内毒力，发现咪鲜胺的抑制活性最强，多菌灵和嘧霉胺等杀菌剂也表现出了较强的活性；徐超^[12] 研究发现，异菌脲对福建地区烟草灰霉病菌有较强的抑制作用，但该地区烟草灰霉病菌已对嘧霉胺表现出中等程度抗性。本研究表明：多菌灵对烟草灰霉病菌菌丝生长的抑制活性最强，其次为丙环唑、嘧霉胺和异菌脲；而异菌脲对烟草灰霉病菌孢子萌发的抑制活性最强，嘧霉胺和多菌灵的活性较弱。所得结果与上述文献结果较为一致，同时，本研究结果与4种杀菌剂对其他作物上灰霉病菌的毒力测定结果也基本一致^[15-16]。

离体叶片防效试验表明，4种药剂的保护作用均优于治疗作用，其中保护和治疗作用防效较强的是异菌脲和多菌灵，其次为丙环唑和嘧霉胺，且各药剂的防效均与浓度呈正相关性。当质量浓度为200 mg/L时，4种药剂对烟草灰霉病的保护作用防效均可达到90%以上。室内毒力测定结果表明，供试4种杀菌剂对烟草灰霉病菌菌丝生长均有较强的抑制作用，但多菌灵对其孢子萌发的抑制作用较差，EC₅₀平均值达131.23 mg/L。结合离体叶片试验结果，4种药剂在>50 mg/L时对烟草灰霉病均有较好的预防和治疗作用，因此可考虑用于烟草灰霉病的防治。

灰葡萄孢属于高抗性风险菌株^[17]，目前已有关于其他作物上灰霉病菌对多菌灵、嘧霉胺和异菌脲产生抗药性的报道^[18-19]。由于烟草灰霉病的病原菌有可能来自于其他作物上的抗性菌株，本研究仅检测了4株菌株对供试药剂的敏感性，因此后续还有待增加菌株数量进一步研究探明。此外，4种药剂是否为防治烟草灰霉病的有效杀菌剂以及其适宜的施用剂量等，还需通过温室盆栽试验及田间防治实践进一步确认。

致谢：长江大学农学院黄艳飞同学 (现在成都农业科技职业技术学院) 参加了部分试验工作，成文过程中承蒙加拿大Guelph大学Tom Hsiang博士帮助修订英文摘要，广西农业科学院植物保护研究所李其利博士提出建设性修改建议，特此一并感谢。