2019, Vol. 21
2. 安顺学院，贵州 安顺 561000
2. Anshun University, Anshun 561000, Guizhou Province, China
牛筋草Eleusine indica (L.) Gaertn. 为穇属一年生禾本科杂草，具有很强的抗逆性和繁殖能力，在中国分布广泛，对农作物、草坪、苗圃、果园等危害严重，已被列为世界十大恶性杂草之一[1]。近年来，随着水稻直播面积不断扩大，部分地区牛筋草已成为稻田主要优势种，严重阻碍了直播稻优质高产和大面积推广应用[2]。
乙酰辅酶A羧化酶 (Acetyl-CoA carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2) 是一类生物羧化酶，能够催化生成脂肪酸合成中的一种关键代谢产物—丙二酸单酰辅酶A，该步反应不仅是反应中的关键步骤，同时也是限速步骤[3]。以ACCase作为靶标的除草剂主要有3种类型，分别是芳氧苯氧丙酸类 (Aryloxyphenoxypropionates，APP)、环己二酮类 (Cyclohexanediones，CHD) 和苯基吡唑啉类 (Phenylpyazolines，PPZ)。ACCase类除草剂通过抑制乙酰辅酶A的羧化反应，使植物的脂肪酸合成受阻，破坏膜的完整性，造成代谢物的渗漏，最终导致植物死亡[4]。该类除草剂具有高效、低毒、施用期长以及对后茬作物安全等优点，但由于靶标位点单一，长期使用极易导致杂草抗药性的产生[5-6]。杂草对除草剂的抗药性机制一般分为靶标抗性 (target site resistance) 和非靶标抗性 (non-target site resistance)。靶标抗性包括靶标酶基因突变和靶标酶的过量表达；非靶标抗性包括除草剂吸收转运的减弱、隔离屏蔽以及代谢和解毒作用增强等[7]。研究发现，多数杂草对ACCase类除草剂产生抗性的主要原因是由于ACCase羧基转移酶 (CT) 结构域内氨基酸发生了突变，从而影响靶标酶与除草剂的有效结合[8]。目前已经报道有7个ACCase 氨基酸位点的14种氨基酸突变类型与抗性相关。靶标酶基因突变通常可导致杂草对相同作用机制的除草剂产生抗性，研究表明，ACCase氨基酸位点的不同突变类型可能会产生相近或不同的交互抗性模式[9]。
噁唑酰草胺和氰氟草酯属于APP类除草剂，主要用于水稻田苗后茎叶防除一年生禾本科杂草，对牛筋草具有较好的防治效果。近年来，上海市部分地区农户反映噁唑酰草胺和氰氟草酯对直播稻田牛筋草的防治无效，推测牛筋草可能产生了抗药性，但其抗性程度和抗性机制尚不明确。Cha等[10]研究证实，牛筋草P2和P3种群对吡氟禾草灵的抗性是由于ACCase基因2027位色氨酸 (Trp) 突变为半胱氨酸 (Cys)。McCullough等[11]报道，ACCase基因2078位点由天冬氨酸 (Asp) 突变为甘氨酸 (Gly)，导致牛筋草对ACCase类除草剂产生抗性。目前有关牛筋草抗药性的报道常见于棉花田、大豆田、果园和草坪中，在水稻田中尚未见报道。因此，本研究对采自上海市松江区水稻田牛筋草疑似抗性种群进行整株生物测定和ACCase基因突变分析，明确牛筋草种群对ACCase类除草剂的抗性水平及其抗药性靶标分子机制，旨在为制定稻田牛筋草防除策略和延缓其抗性种群发展提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料杂草种子：疑似抗性牛筋草种群SJ-1的种子于2016年10 月采自上海市松江区直播水稻田，该地已连续10 a以上使用氰氟草酯和噁唑酰草胺防除禾本科杂草；敏感种群FX-1的种子采自上海市奉贤区上海市农业科学院内河边，该地未使用任何除草剂。
除草剂：10%噁唑酰草胺 (metamifop) 乳油，美国富美实公司；100 g/L氰氟草酯 (cyhalofop-butyl) 乳油和108 g/L 高效氟吡甲禾灵 (haloxyfop-R-methyl) 乳油，美国陶氏益农公司；69 g/L精噁唑禾草灵 (fenoxaprop-p-ethyl) 水乳剂，拜耳股份公司；12.5% 烯禾啶 (sethoxydim) 乳油，中农立华 (天津) 农用化学品有限公司；120 g/L烯草酮 (clethodim) 乳油，合肥星宇化学有限责任公司。
主要仪器：MS105DU半微量天平，瑞士Mettler Toledo公司；ASS-4型化学农药实验自动控制喷洒系统，北京盛恒天宝科技有限公司生产；5804R型台式高速冷冻离心机和BioSpectrometer basic分光光度计，德国Eppendorf公司；T100型PCR仪，美国Bio-Rad公司；Tannon-1600全自动数码凝胶图像处理系统，上海天能科技有限公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MLR-352H植物培养箱，日本SANYO公司；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
1.2 试验方法 1.2.1 试验材料培养将籽粒饱满一致的牛筋草种子放在铺垫2层滤纸的培养皿中，保持滤纸湿润，置于植物培养箱中催芽，催芽条件为温度30 ℃/25 ℃ (L/D)、光周期12 h/12 h (L/D)。将15粒露白的种子均匀播种在直径9 cm的塑料盆钵内，撒上一层薄土 (厚度约0.1 cm) 将种子完全覆盖，置于自控玻璃温室中培养 (自然光照，温度25~35 ℃，相对湿度50%~70%)。待出苗整齐后，每盆保留10株长势基本一致的植株。
1.2.2 牛筋草种群对不同除草剂的抗性水平测定采用整株生物测定法[12]，分别测定牛筋草抗性种群SJ-1和敏感种群FX-1对不同除草剂的敏感性及抗性倍数。当牛筋草生长至3~4叶期，用ASS-4型自动控制喷洒系统进行茎叶喷雾，喷液量为450 L/hm2，喷雾压力为0.275 MPa。通过预试验结果，设定ACCase类除草剂的处理剂量 (表1)，每处理4次重复，整体试验重复2次。
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表 1 整株生物测定中所用除草剂的剂量 Table 1 Herbicides treatments applied for whole-plant bioassay |
喷药14 d后，剪取牛筋草植株地上部分，放入恒温鼓风干燥箱内75 ℃烘干72 h，称量干重并记录。通过双逻辑非线性回归方程y = C + (D – C)/[1 + (x/GR50)b] 进行剂量反应曲线拟合，计算抑制牛筋草生长干重50%所需要的除草剂剂量 (GR50)。式中y 为某一除草剂用量下牛筋草干重相对于对照的百分比，C为剂量反应下限，D 为剂量反应上限，x 为除草剂剂量，b为斜率。
根据相对抗性倍数 (Resistance index，RI) 判定抗性程度，RI = GR50 (SJ-1)/GR50 (FX-1)。参考Beckie等[9]方法将相对抗性倍数分为4个等级：RI＜2表示敏感，2≤RI＜5表示低水平抗性，5≤RI≤10表示中等水平抗性，RI＞10表示高水平抗性。
1.2.3 牛筋草ACCase基因片段克隆待牛筋草生长至4叶期后，分别用液氮处理抗性种群和敏感种群单株植物叶片组织，置于 –80 ℃冰箱保存。利用植物基因组DNA提取试剂盒 (北京全式金生物技术有限公司) 提取总DNA。采用已报道的两对引物序列[13]，分别为：NACC1F (5′-GCGTGCTGCTGGGCTGAAT-3′)/NACC1R (5′-CCGGTCAAAATAATGGGCTGGTC-3′) 和NACC2F (5′-AATGGCTGGGTGGTATGTTTGAC-3′)/NACC2R (5′-ATCCTCCGCCGTAATCTCTTGTAG-3′)，用于牛筋草ACCase基因CT区域已报道的所有与抗性相关的基因片段扩增。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 。PCR扩增反应体系总体积为50 µL，包括：2 µL基因组DNA模板，1 µL正向引物 (10 µmol/L)，1 µL反向引物 (10 µmol/L)，1 µL TopTap DNA Polymerase (2.5 U/µL)，5 µL 10 × TopTap Buffer，4 µL dNTPs (2.5 mmol/L)，36 µL ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。取5 µL PCR扩增产物在1% 的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，将含目的条带的PCR扩增产物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。将测序所得序列在NCBI 上进行BLAST比对，用DNAMAN 5.2.2 软件对扩增出的抗性和敏感种群牛筋草ACCase基因进行比对分析，SnapGene 3.2.1软件分析突变位点的等位基因类型。
1.3 数据处理分析试验数据采用SPSS 20.0软件以单因素方差分析法进行统计分析，用SigmaPlot 12.5 软件绘制剂量反应曲线。
2 结果与分析 2.1 牛筋草种群对6种ACCase类除草剂的抗性水平测定由剂量-反应曲线 (图1) 可知：在噁唑酰草胺、氰氟草酯、精噁唑禾草灵、高效氟吡甲禾灵、烯禾啶和烯草酮6种除草剂的田间推荐剂量下，牛筋草疑似抗性种群SJ-1的干重比值均大于52%，而敏感种群FX-1的干重比值均小于22%。双逻辑非线性回归分析结果 (表2) 显示：SJ-1种群和FX-1种群对6种ACCase类除草剂的GR50值存在显著差异。SJ-1种群对噁唑酰草胺、氰氟草酯、精噁唑禾草灵、高效氟吡甲禾灵和烯禾啶均产生了高水平抗性，抗性倍数分别为56.6、62.5、128、52.0和16.3；对烯草酮产生了低水平抗性，抗性倍数为4.86。
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表 2 牛筋草抗性和敏感种群对ACCase类除草剂的敏感性 Table 2 Sensitivity of the resistant and susceptible E. indica populations to ACCase-inhibiting herbicides |
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图 1 牛筋草抗性和敏感种群对ACCase类除草剂的生长剂量-反应曲线 Fig. 1 Dose–response curves for resistant and susceptibleE. indica populations to ACCase-inhibiting herbicides |
2.2 牛筋草抗性和敏感种群ACCase基因差异
以提取的牛筋草抗性和敏感种群单株基因组DNA为模板，用引物NACC1F/NACC1R和NACC2F/NACC2R对ACCase基因片段进行扩增，分别得到长度为600和832 bp的片段，与GenBank 中牛筋草质体型ACCase基因序列 (KF700369.1) 的同源性均达99%以上。扩增的ACCase基因片段包含所有已报道的ACCase抗性突变位点。参照大穗看麦娘Alopecurus myosuroides ACCase 基因序列 (GenBank No. AJ310767)，将抗性种群SJ-1和敏感种群FX-1的ACCase基因序列进行比对，发现抗性种群中所有单株的ACCase 氨基酸序列在第2078位氨基酸密码子由GAT 突变为GGT ，导致氨基酸由天冬氨酸 (Asp) 突变为甘氨酸 (Gly)(图2)。SJ-1种群中未发现其他位点的突变，全部敏感种群FX-1中均未发现已证实的ACCase基因突变。通过PCR产物直接测序的测序峰图对SJ-1种群中随机选取的60个单株进行突变类型鉴定，发现有58株是纯合型突变 (即2078位密码子为GGT)，有2株为杂合型突变 (即2078位密码子为GAT/GGT)。
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图 2 牛筋草抗性种群ACCase 2078位氨基酸突变的序列分析 Fig. 2 Sequence alignment and derived amino acids at position 2078 of the ACCase gene from E. indica |
3 小结与讨论
噁唑酰草胺和氰氟草酯是目前水稻田防除牛筋草的常用除草剂。文马强等[14]发现在水稻田连续施用氰氟草酯8 a后，千金子Leptochloa chinensis产生了抗药性。左平春等[15]报道，在使用ACCase类除草剂约10 a后，稻田稗草Echinochloa phyllopogon对噁唑唑酰草胺产生了抗药性。本研究中SJ-1种群采集田块连续应用氰氟草酯和噁唑酰草胺的历史超过10 a，通过整株生物测定发现，该种群对噁唑酰草胺和氰氟草酯均产生了高水平抗性，这与当地农户反映直播稻田防除牛筋草失效的情况一致。宗涛等[16]报道，湖南省部分地区棉田连续使用精喹禾灵6~10 a，牛筋草对其产生不同程度的抗药性。单一作用机制的除草剂连续使用是杂草抗药性产生的一个最关键因素[17]。毕亚玲等[18]研究表明，对-羟苯基丙酮酸双氧化酶 (HPPD) 类除草剂双环磺草酮可用于水稻田防除牛筋草等多种秋熟杂草。因此在水稻田牛筋草防治过程中，可以选用不同作用机制的除草剂交替使用和混用，以延缓抗药性杂草的发展。同时，抗药性牛筋草的治理要采用综合防控的策略，利用不同的耕作方式、轮作方式以及杂草管理等措施最大限度地减少田间抗药性杂草种子的密度。
靶标酶基因突变是杂草对ACCase抑制剂除草剂产生抗性的重要机制。2000年，Zhang and Devine[19]首次报道，狗尾草Setaria viridis ACCase CT区域的一个Ile-Leu替换导致了其对烯禾啶的抗性。本研究发现，牛筋草SJ-1种群植株的ACCase第2078位天冬氨酸突变为甘氨酸 (Asp-2078-Gly)，该突变于2005年在抗性大穗看麦娘首次被报道，随后在硬直黑麦草Lolium rigidum、多花黑麦草Lolium multiflorum、不实野燕麦Avena sterilis、奇异虉草Phalaris paradoxa和野燕麦Avena fatua等杂草中被证实与抗性有关[9]。因此Asp-2078-Gly突变很可能是SJ-1种群对噁唑酰草胺和氰氟草酯产生抗药性的重要原因。
通常靶标酶基因突变可能赋予杂草对相同作用机制的除草剂产生交互抗性，但由于不同除草剂在化学结构上的差异，不同氨基酸突变类型以及杂草物种间的差异等因素均会导致其交互抗性谱和抗性强弱的变化[20]。在本研究中，抗性牛筋草种群SJ-1对其他APP和CHD类除草剂也产生了不同水平的交互抗性，其中对精噁唑禾草灵、高效氟吡甲禾灵和烯禾啶产生了高水平抗性，对烯草酮产生了低水平抗性。这与之前报道的ACCase基因Asp-2078-Gly突变赋予了耿氏硬草Pseudosclerochloa kengiana对精噁唑禾草灵、炔草酯、烯禾啶和烯草酮产生抗药性的结论一致[12]。通常，Asp-2078-Gly突变会导致杂草对3类ACCase除草剂均产生抗性。Yu等[21]报道，ACCase基因2078位点发生取代可能会改变活性部位5′α螺旋及附近的空间构象，从而影响APP、CHD和PPZ 3类除草剂分子与ACCase的有效结合。
长期在单一或同一类型的除草剂选择压力下，会加快抗药性杂草的发展，增加杂草的防治难度[22]。本研究中随机选取的SJ-1种群60个单株ACCase基因都发生了Asp-2078-Gly突变，其中96.7%是抗性纯合植株，3.3%是杂合突变型植株。这表明抗性牛筋草在该田块可能已产生多年。研究证实，多倍体杂草ACCase基因的稀释效应会降低基因突变对除草剂的抗性水平，因此多倍体杂草相比二倍体杂草能延缓抗药性的出现[23]。牛筋草为二倍体、自花受粉植物，这可能是牛筋草容易产生抗药性的原因之一。
| [1] |
HOLM L G, PLUCKNETT D L, PANCHO J V, et al. The world’s worst weeds: Distribution and Biology[M]. Honolulu: University of Hawaii Press, 1977: 609.
|
| [2] |
魏守辉, 朱文达, 杨小红, 等. 湖北省水稻田杂草的种类组成及其群落特征[J]. 华中农业大学学报, 2013, 32(2): 44-49. WEI S H, ZHU W D, YANG X H, et al. Species composition and characterization of weed community in rice fields in Hubei Province[J]. J Huazhong Agric Univ, 2013, 32(2): 44-49. DOI:10.3969/j.issn.1000-2421.2013.02.008 |
| [3] |
NIKOLAU B J, OHLROGGE J B, WURTELE E S. Plant biotin-containing carboxylases[J]. Arch Biochem Biophys, 2003, 414(2): 211-222. DOI:10.1016/S0003-9861(03)00156-5 |
| [4] |
DÉLYE C. Weed resistance to acetyl coenzyme A carboxylase inhibitors: an update[J]. Weed Sci, 2005, 53(5): 728-746. DOI:10.1614/WS-04-203R.1 |
| [5] |
李蓉荣, 袁国徽, 郭文磊, 等. 八种除草剂对小麦田三种抗精噁唑禾草灵杂草的生物活性[J]. 植物保护学报, 2016, 43(3): 507-513. LI R R, YUAN G H, GUO W L, et al. Biological activities of eight herbicides to three species of fenoxaprop-P-resistant weeds in wheat fields [J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2016, 43(3): 507-513. |
| [6] |
黄世霞, 王庆亚, 张守栋. 油菜田看麦娘对高效盖草能产生抗药性的现状研究[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(9): 1913-1914. HUANG S X, WANG Q Y, ZHANG S D. Study on the resistance Alopecurus aequalis sobol to haloxyfop-R-methyl [J]. J Anhui Agric Sci, 2006, 34(9): 1913-1914. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2006.09.078 |
| [7] |
DÉLYE C, JASIENIUK M, LE CORRE V. Deciphering the evolution of herbicide resistance in weeds[J]. Trends Genet, 2013, 29(11): 649-658. DOI:10.1016/j.tig.2013.06.001 |
| [8] |
夏向东, 马洪菊, 许孟涵, 等. 杂草对芳氧苯氧丙酸类(APPs)除草剂的抗性分子机理研究进展[J]. 农药学学报, 2013, 15(6): 609-614. XIA X D, MA H J, XU M H, et al. Research progress on molecular mechanism of resistant weeds to aryloxyphenoxypropionate herbicides[J]. Chin J Pestic Sci, 2013, 15(6): 609-614. DOI:10.3969/j.issn.1008-7303.2013.06.02 |
| [9] |
BECKIE H J, TARDIF F J. Herbicide cross resistance in weeds[J]. Crop Prot, 2012, 35: 15-28. |
| [10] |
CHA T S, NAJIHAH M G, SAHID I B, et al. Molecular basis for resistance to ACCase-inhibiting fluazifop in Eleusine indica from Malaysia
[J]. Pestic Biochem Physiol, 2014, 111: 7-13. DOI:10.1016/j.pestbp.2014.04.011 |
| [11] |
MCCULLOUGH P E, YU J L, CZARNOTA M A, et al. Physiological basis for metamifop selectivity on bermudagrass (Cynodon dactylon) and goosegrass (Eleusine indica) in cool-season turfgrasses
[J]. Weed Sci, 2016, 64(1): 12-24. DOI:10.1614/WS-D-15-00107.1 |
| [12] |
袁国徽, 王恒智, 赵宁, 等. 耿氏硬草对乙酰辅酶 A 羧化酶类除草剂抗性水平及分子机制初探[J]. 农药学学报, 2016, 18(3): 304-310. YUAN G H, WANG H Z, ZHAO N, et al. Resistance to acetyl-CoA carboxylase-inhibiting herbicides in Pseudosclerochloa kengiana and its molecular resistance mechanism [J]. Chin J Pestic Sci, 2016, 18(3): 304-310. |
| [13] |
OSUNA M D, GOULART I C G R, VIDAL R A, et al. Resistance to ACCase inhibitors in Eleusine indica from Brazil involves a target site mutation
[J]. Planta Daninha, 2012, 30(3): 675-681. DOI:10.1590/S0100-83582012000300025 |
| [14] |
文马强, 周小毛, 刘佳, 等. 直播水稻田千金子对氰氟草酯抗性测定及抗性生化机理研究[J]. 南方农业学报, 2017, 48(4): 647-652. WEN M Q, ZHOU X M, LIU J, et al. Resistance of Leptochloa chinensis (L) Nees. to cyhalofop-butyl in rice field of direct seeding and resistance biochemical mechanism research [J]. J Southern Agric, 2017, 48(4): 647-652. DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2017.04.013 |
| [15] |
左平春, 臧晓霞, 陈仕红, 等. 稻稗对噁唑酰草胺的非靶标抗药性和对氰氟草酯的交互抗药性[J]. 杂草学报, 2016, 34(4): 28-32. ZUO P C, ZANG X X, CHEN S H, et al. Non-target resistance to metamifop and cross-resistance to cyhalofop-butyl in Echinochloa phyllopogon (Stapf) Koss [J]. Weed Sci, 2016, 34(4): 28-32. DOI:10.3969/j.issn.1003-935X.2016.04.006 |
| [16] |
宗涛, 李洁, 刘祥英, 等. 湖南省部分地区棉田牛筋草 (Eleusine indica) 对精喹禾灵的抗性
[J]. 植物保护, 2015, 41(2): 58-63. ZONG T, LI J, LIU X Y, et al. Resistance of Eleusine indica to quizalofop-p-ethyl in some cotton fields in Hunan Province [J]. Plant Prot, 2015, 41(2): 58-63. DOI:10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.010 |
| [17] |
NORSWORTHY J K, WARD S M, SHAW D R, et al. Reducing the risks of herbicide resistance: best management practices and recommendations[J]. Weed Sci, 2012, 60(SP1): 31-62. DOI:10.1614/WS-D-11-00155.1 |
| [18] |
毕亚玲, 王曹阳, 谷刚, 等. 双环磺草酮除草活性及对水稻的安全性研究[J]. 农药学学报, 2018, 20(1): 18-24. BI Y L, WANG C Y, GU G, et al. Herbicidal activity evaluation of benzobicyclon and its safety to rice[J]. Chin J Pestic Sci, 2018, 20(1): 18-24. |
| [19] |
ZHANG X Q, DEVINE M D. A possible point mutation of plastidic ACCase gene conferring resistance to sethoxydim in green foxtail (Setaria viridis)[C]. Weed Sci Soc Am Abstr, 40, 2000: 33.
|
| [20] |
陈涛, 张善磊, 赵凌, 等. ALS抑制剂类除草剂抗性水稻功能标记的开发与验证[J]. 中国水稻科学, 2018, 32(2): 137-145. CHEN T, ZHANG S L, ZHAO L, et al. Development and verification of a functional marker associated with resistance to ALS inhibitor herbicide[J]. Chin J Rice Sci, 2018, 32(2): 137-145. |
| [21] |
YU L P, KIM Y S, TONG L. Mechanism for the inhibition of the carboxyltransferase domain of acetyl-coenzyme A carboxylase by pinoxaden[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(51): 22072-22077. DOI:10.1073/pnas.1012039107 |
| [22] |
郭水良, 赵铁桥. 除草剂对杂草微观进化及多样性的影响[J]. 生物多样性, 1997, 5(4): 301-306. GUO S L, ZHAO T Q. Influences of herbicide application on weed microevolution and diversity[J]. Biodiv Science, 1997, 5(4): 301-306. DOI:10.3321/j.issn:1005-0094.1997.04.012 |
| [23] |
YU Q, AHMAD-HAMDANI M S, HAN H, et al. Herbicide resistance-endowing ACCase gene mutations in hexaploid wild oat (Avena fatua): insights into resistance evolution in a hexaploid species
[J]. Heredity (Edinb), 2013, 110(3): 220-231. DOI:10.1038/hdy.2012.69 |