2019, Vol. 21
2. 中国标准化研究院，北京 100191;
3. 中国农业大学 理学院，北京 100193
2. China Institute of Standardization, Beijing 100191, China;
3. College of Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China
人参为名贵中药材，具有抗肿瘤、保护心脑血管系统、神经系统、降低肝损伤、抗病毒及辅助免疫作用[1-2]。随着人们对保健需求的日趋增多，也极大的刺激了人参消费，但野山参产量远远满足不了市场需求，大部分人参还需依赖人工栽培。为保证人参质量和提高产量，在人参种植过程中不可避免的需要使用各种类型的农药[3]。人参中较常见的农药有苯醚甲环唑和嘧菌酯，根据中国国家标准GB2763—2016《食品安全国家标准——食品中农药最大残留限量》规定[4]，要求苯醚甲环唑在人参中的最大残留限量 (MRL值) 在0.5 mg/kg以下，嘧菌酯的MRL值在1 mg/kg以下。
目前，在进行人参中农药残留检测时，样品的前处理方法主要有固相萃取法[5-6]、固相微萃取法[7]、加速溶剂萃取法[8]、液液萃取法[9]、QuEChERS法[10]和基质固相分散法[11]等，快速滤过型净化法 (m-PFC，multi-plug filtration cleanup) 是一种基于QuEChERS法发展起来的对基质中干扰物质进行净化的方法[12]。该方法如图1[13]所示，将填料装于注射器中，使用时将提取液通过抽提或推送方式通过含有多壁碳纳米管、N-丙基乙二胺 (PSA)、C18和无水硫酸镁的填料层，使填料与基质中的色素、脂类、部分糖类、甾醇类、茶多酚、有机酸和生物碱等干扰物作用或吸附，但不与目标物反应，从而完成基质的净化。与传统方法相比，该方法无需称量吸附剂，从而大大缩短了净化时间，同时能够与液相色谱-质谱法 (LC-MS)、气相色谱-质谱法 (GC-MS) 等在线或离线联用，可大幅度提高前处理速率和效率。目前该方法已成功应用于水果[14-15]、蔬菜[16-18]等农药的多残留检测中，但尚未见用于人参中农药的多残留检测中。
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1-注射器，2-净化柱，3-上筛板，4-下筛板，5-吸附填料，6-针头，7-离心管。 1-syringe, 2-purification column, 3-upper sieve plate, 4-lower sieve plate, 5-adsorption packing, 6-needle head, 7-centrifuge tube. 图 1 m-PFC净化小柱示意图[13] Fig. 1 Diagram of m-PFC purification column[13] |
针对人参样品中富含纤维素和多糖等特点，笔者对m-PFC前处理技术进行了改进和优化，选取在中国国家标准GB2763—2016中对人参样品有限量要求的苯醚甲环唑和嘧菌酯，以及在中药材种植中广泛应用的吡虫啉、茚虫威和噻嗪酮为研究对象，结合高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测技术，建立了人参中5种农药残留同时检测的方法。旨在为快速、准确检测人参中的农药多残留提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂ACCELA高效液相色谱仪和TSQ Quantum Access MAX三重四极杆质谱仪 (赛默飞世尔科技有限公司)；高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)；VM200旋涡振荡仪 (托摩根生物科技有限公司)；YP3002电子天平 (上海佑科仪器仪表有限公司)。
人参样品：白参1等、白参2等样品，红参1等、红参2等样品，高丽参1等、高丽参2等 (市售)；吡虫啉 (imidacloprid)、嘧菌酯 (azoxystrobin)、苯醚甲环唑 (difenoconazole)、茚虫威 (indoxacarb) 和噻嗪酮 (buprofezin) 标准品的质量浓度均为100 μg/mL (北京坛墨质检科技有限公司)，于4 ℃冰箱保存；乙腈 (色谱纯，德国默克公司)；甲酸 (分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；m-PFC小柱 (北京绿绵科技有限公司)；0.22 μm有机相微孔滤膜 (天津市津腾实验设备有限公司)；固相萃取柱 (ENVI-Carb，PSA，C18) (西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司)。
1.2 标准溶液的配制空白基质溶液：称取1 g (精确至0.01 g) 空白人参样品于5 mL离心管中，加入3 mL乙腈，旋涡振荡2 min，于5 000 r/min下离心5 min。取上清液2 mL，过0.22 μm有机滤膜后，移入m-PFC小柱上端，缓慢推动注射杆，用液相小瓶承接流出液，即为空白基质溶液，将该溶液置于4 ℃冰箱保存，备用。
标准储备液：将100 μL各标准品溶液移入10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000 μg/L的5种农药混合标准储备液，于4 ℃冰箱保存。
标准工作液：用V (乙腈):V (水) = 40 : 60的混合溶液将标准储备液稀释成质量浓度分别为1、5、10、50、100、250和500 μg/L的系列标准工作液，使用前配制。
基质标准储备液：将100 μL各标准品溶液移入10 mL容量瓶中，用空白基质溶液定容，配制成1 000 μg/L的基质标准储备液，于4 ℃冰箱保存。
基质标准工作液：用空白基质溶液将基质标准储备液稀释成质量浓度分别为1、5、10、50、100、250和500 μg/L的系列基质标准工作液，使用前配制。
1.3 m-PFC样品前处理方法 1.3.1 人参储备样品的制备分别取白参1等、白参2等样品，红参1等、红参2等样品、高丽参1等、高丽参2等样品各50 g，经铡刀切片后，于40 ℃烘箱中烘干，72 h后取出，经高速万能粉碎机粉碎，过筛孔直径为180 μm的筛子，装袋密封，于4 ℃保存，备用。
1.3.2 样品的提取及m-PFC净化方法提取方法：称取1 g (精确至0.01 g) 人参储备样品于5 mL离心管中，加入3 mL乙腈，旋涡振荡2 min，于5 000 r/min下离心5 min。
净化方法：取上清液2 mL，过0.22 μm有机滤膜后，移入m-PFC小柱上端，缓慢推动注射杆，液相小瓶承接流出液，待检测。
1.4 人参中农药残留检测的地方标准前处理方法提取方法[19]：称取人参储备样品1 g于50 mL离心管中，加入丙酮20 mL，高速匀浆1 min后，于8 000 r/min下离心5 min。取上清液，移至浓缩瓶中，再向残渣中加入20 mL丙酮，重复提取1次。合并上清液，于35 ℃下旋转蒸发浓缩至近干，加入5 mL乙腈溶解残渣，待净化。
净化方法[19]：以10 mL乙腈预淋洗固相萃取柱，弃去流出液。将5 mL提取液移入固相萃取柱中，用20 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于250 mL浓缩瓶中，于35 ℃下旋转蒸发浓缩至近干。用乙腈溶解并定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，待检测。
1.5 检测条件 1.5.1 液相色谱条件Zorbax SB-C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，柱温25 ℃。流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进样量10 μL，流速1.8 mL/min。梯度洗脱程序：0~4 min，40%~75%的B；>4~10 min，75%~100%的B。
1.5.2 质谱条件采用电喷雾正离子源 (ESI+) 模式，雾化气为液氮，多反应监测 (Multi reaction monitoring, MRM) 模式，毛细管温度为320 ℃，雾化气温度为300 ℃，鞘气压力为6 125 kPa，辅助气压力为875 kPa，离子喷雾电压为3 200 V，CID压力为0.2 kPa。
1.6 样品中农药残留计算实际样品中农药的残留量 (X) 为待测液检测结果 (C) 的3倍，即X = 3C。
2 结果与讨论 2.1 质谱条件的优化为了最大程度地提高目标物的离子化程度，选择向流动相中添加体积分数为0.1%的甲酸。以嘧菌酯为例，仪器校准后，用流动相初始比例溶液将嘧菌酯标准品稀释成500 μg/L的标准溶液，经蠕动泵注入质谱仪中，当得到稳定的母离子信号后，选择相对丰度较高且有文献记载的一个母离子，调节离子源参数，使母离子响应强度在10e7以上，选择MS/MS模式，输入所选母离子荷质比、期望子离子的携带电荷数和期望子离子个数，点击开始后系统会自动给出相对丰度由大到小排列的子离子的荷质比。选择SRM模式，输入所选的2对子母离子对，系统自动优化碰撞能和套管透镜补偿电压。其余4种农药标准品均用此方法分别优化碰撞能和补偿电压并记录优化结果。5种农药的质谱参数见表1。
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表 1 5种农药的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of 5 pesticides |
2.2 色谱条件的优化
所选用的色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，其流速应在1.0~2.0 mL/min之间为最佳，为了既能满足色谱柱的最佳流速范围又尽可能满足质谱所需的最佳流速范围 (0.2~0.4 mL/min)，本研究采用三通管路分流。经实际测量，在柱流速为1.8 mL/min时，选择流入质谱端的流速为0.39 mL/min，既满足了色谱柱和质谱端对流速的要求，又满足了快速分离和基线分离。所以后续试验流速均选用1.8 mL/min。
2.3 提取与净化条件优化采用m-PFC法提取时，通常需要根据试验对象的差异，选择是否需要添加无水硫酸钠进行干燥以及加入氯化钠促进有机相和水相的分离，同时需选择不同填料的m-PFC净化柱，以促进样品中多残留的充分溶出。在本研究中，鉴于市售人参样品含水量较低，未添加无水硫酸钠和氯化钠，选择吸附填料为多壁碳纳米管的m-PFC小柱对人参的乙腈提取液进行净化，得到了较好的净化效果。
2.4 基质效应基质效应普遍存在于农药残留检测中，容易引起分析结果的误差。基质效应为基质校准曲线的斜率与溶剂标准校准曲线的斜率之比，比值越接近1，则基质效应越小[12]。本研究以不含基质的标准工作溶液和基质 (质量浓度1 g/mL) 标准工作溶液，通过拟合标准曲线比较二者斜率，计算结果见表2。发现嘧菌酯和吡虫啉几乎不受基质效应影响，而苯醚甲环唑、茚虫威和噻嗪酮存在明显的基质增强效应。鉴于有些农药存在明显的基质效应，因此后续试验的混合标准工作液用空白基质溶液配制。
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表 2 5种农药的基质效应对比 Table 2 Comparison of matrix effects of 5 pesticides |
2.5 方法的线性范围、重现性、灵敏度和检出限
5种农药在最佳条件下的总离子流图见图2。可见，在最佳条件下5种农药的分离度良好，在10 min内可完成5种农药的基线分离。
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1-吡虫啉，2-嘧菌酯，3-苯醚甲环唑，4-茚虫威，5-噻嗪酮。 1-imidacloprid；2-azoxystrobin；3-difenoconazole；4-indoxacarb；5-buprofezin. 图 2 5种农药在300 μg/L时的总离子流图 Fig. 2 Total ion outflow diagram of 5 pesticides at a concentration of 300 μg/L |
由表3可知：5种农药的线性范围均在1~500 μg/L之间，色谱峰面积与对应的质量浓度之间的线性关系良好，R2在0.995 4~0.999 6之间。经计算，5种农药的检出限 (LOD，S/N = 3) 均在0.03~0.18 μg/kg之间，定量限 (LOQ，S/N = 10) 均在0.11~0.59 μg/kg之间。
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表 3 5种农药的线性关系、检出限和定量限 Table 3 Linear relationships, detection limits and quantitation limits of 5 pesticides |
2.6 农药添加条件优化
在人参空白样品中添加10 μg/kg的农药混合标准品，比较了添加后立即进行提取净化和静置2 h后再提取净化对添加回收率的影响，每个添加水平重复5次。由表4可知：2种提取净化方法的平均回收率均在80%~120%之间，RSD均小于10%，无显著差异。该结果表明，该方法可以在农药添加后立即进行提取净化。对5种农药添加水平为10 μg/kg的空白基质溶液和未添加农药的空白基质溶液进行检测，结果如图3所示。从图中可以看出，空白基质溶液中无杂质，添加的5种农药也得到了较好的基线分离。
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表 4 人参中添加混合农药后立即提取净化和静置2 h后提取净化对回收率的影响 (n = 5) Table 4 Comparison of recoveries between extraction and purification immediately after pesticides addition and 2 hours after adding pesticides (n = 5) |
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1-吡虫啉，2-嘧菌酯，3-苯醚甲环唑，4-茚虫威，5-噻嗪酮。 1-imidacloprid；2-azoxystrobin；3-difenoconazole；4-indoxacarb；5-buprofezin. 图 3 5种农药添加水平为10 μg/kg的空白基质溶液 (黑色) 和未加农药 (红色) 的总离子流图 Fig. 3 Total ion outflow diagram of 5 pesticides at the spiking level of 10 μg/kg (black) and the blank (red) |
2.7 方法的准确度与精密度
对人参空白样品进行添加回收试验，添加水平分别为2、10、50、100和300 μg/kg的混合标准溶液，每个水平重复5次。由表5可知，在不同的添加水平下，方法的平均回收率在76%–115%之间，RSD均小于11%，表明所开发的方法准确度较好。
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表 5 5种农药的添加回收率及相对标准偏差 (n = 5) Table 5 Recoveries and RSD of 5 pesticides (n = 5) |
2.8 m-PFC方法与地方标准方法的比较
以白参样品为例，当添加水平为50 μg/kg时，采用m-PFC方法和DB 22/T 1848—2013地方标准方法[19]分别对5种农药的回收率进行了检测，结果列于表6中。通过比较可以看出：采用m-PFC法，5种农药的回收率在89%~113%之间，RSD小于9%；采用地方标准方法，5种农药的回收率在78%~104%之间，RSD小于8%。2种方法的回收率差异较小，准确度也接近，但m-PFC法对每个样品的前处理时间可控制在10 min以内，而地方标准方法由于涉及旋转蒸发，通常每个样品的前处理时间需要2.5~3.0 h。由此可见，m-PFC法可以在较短的时间内准确地完成人参样品中农药残留的提取净化工作。
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表 6 采用m-PFC方法和地方标准方法对5种农药净化的回收率与RSD对比 (n = 5) Table 6 The recovery and RSD differences of 5 pesticides between the methods of m-PFC and the local standards (n = 5) |
2.9 实际样品检测结果
以本研究所建立的m-PFC小柱结合HPLC-MS/MS法，对市售的白参、高丽参、红参一等品和二等品共6份人参样品中本文所述的5种农药进行定性定量检测，结果均为未检出。
3 结论针对人参样品富含纤维素和多糖等特点，对m-PFC前处理技术进行了改进和优化，结合HPLC-MS/MS法，建立了人参中嘧菌酯、苯醚甲环唑、吡虫啉、茚虫威和噻嗪酮5种农药残留同时检测的分析方法。该方法可将前处理时间控制在10 min以内，整个样品的前处理及分析时间能够在20 min内完成。5种农药的线性范围在1~500 μg/L之间，检出限为0.03~0.18 μg/kg，定量限为0.11~0.59 μg/kg，其定量限较GB 2763—2016规定的人参中苯醚甲环唑和嘧菌酯的MRL值 (0.5~1 mg/kg) 低3个数量级。在2、10、50、100和300 μg/kg 5个添加水平下，方法平均回收率均在76%~115%之间，RSD均小于11%，回收率较好且方法稳定。与传统样品前处理方法相比，所建立的新方法具有操作简单、省时省力、普适性好和灵敏度高等优点。该方法为研发更为快速、准确的人参中农药残留检测方法提供了思路，也为后续国家标准修订人参中农药最大残留限量提供参考。
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