2. 山东省农药毒理与应用技术重点实验室,山东 泰安 271018;
3. 山东黄河三角洲国家级自然保护区管理局,山东 东营 257100
2. Key Laboratory of Pesticide Toxicology and Application Technique, Tai'an 271018, Shandong Province, China;
3. Yellow River Delta National Natural Reserve Management Bureau, Dongying 257100, Shandong Province, China
日本看麦娘Alopecurus japonicus是一种恶性禾本科杂草,广泛分布于中国东部、中南部、西南部以及黄河流域下游沿畔[1]。它可以适应复杂的环境条件[2],并逐渐发展成为稻麦轮作田和油菜田等越冬性作物田的优势杂草。日本看麦娘拥有较强的分蘖能力,可与作物竞争水分、养分和光照,从而严重影响作物产量。目前,中国小麦田日本看麦娘的防治主要依赖于精唑禾草灵 (fenoxaprop-p-ethyl) 和甲基二磺隆 (mesosulfuron-methyl)。
精唑禾草灵 (结构式见图式1) 是由德国赫司特 (Hoechst) 公司首先开发成功的芳氧苯氧基丙酸酯类 (Aryloxyphenoxypropionates,APPs) 除草剂,于20世纪90年代在中国正式登记,广泛用于冬小麦田防除禾本科杂草,其作用靶标为乙酰辅酶A羧化酶 (Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)。ACCase类抑制剂还包括环己烯酮类 (Cyclohexanediones,CHDs) 和苯基吡唑啉类 (Phenylpyraxoline,DENs) [3]。该类除草剂具有高效、低毒、低残留及对作物安全性高等优点,但由于其作用位点单一,长期大量重复使用极易导致抗药性杂草的产生。截至2018年10月,全球已有48种杂草对该类除草剂产生了抗性[4]。
目前,杂草对除草剂的抗性机制主要分为靶标抗性 (Target-site resistance,TSR) 和非靶标抗性 (Non-target-site resistance,NTSR) [5]。靶标抗性主要是由于靶标酶基因突变导致酶的构象发生变化,从而使杂草对除草剂的敏感性降低。已经证实,禾本科杂草ACCase基因保守区域有7个氨基酸位点 (1 781、1 999、2 027、2 041、2 078、2 088和2 096) 可以发生14种氨基酸替换,而且不同的突变形式可以对ACCase类抑制剂产生不同的交互抗性[6]。Mohamed等[7]和Tang等[8]曾报道ACCase基因第1 781位异亮氨酸 (Ile) 到亮氨酸 (Leu) 突变和第2 041位Ile到天冬酰胺 (Asn) 突变是日本看麦娘对多种APPs类除草剂产生靶标抗性的原因。非靶标抗性机制则较为复杂,主要包括减少的除草剂吸收、改变的除草剂转运以及增强的除草剂代谢等[9],其中增强的代谢,即代谢抗性是目前研究最多的方面[10]。
安徽省是中国主要稻麦轮作区之一,日本看麦娘等恶性禾本科杂草对冬小麦的生产危害十分严重。目前,该省已发现多例日本看麦娘对精唑禾草灵产生了抗性。毕亚玲等[11]在2015年曾报道,采集自安徽省滁州市定远县冬小麦田的日本看麦娘种群AH-25对精唑禾草灵产生了高水平抗性,抗性倍数为33.82,并于2016年[12]报道采集自安徽省天长市龙集镇的日本看麦娘种群AH-15对精唑禾草灵和甲基二磺隆产生了多抗性。Xu等[1]也曾报道,采集自安徽省合肥市肥东县冬小麦田的日本看麦娘对精唑禾草灵产生了高水平抗性,抗性倍数高达60.31。然而,之前的研究主要集中在特定地点的特定种群,抗性日本看麦娘在安徽省的具体发生情况尚未见报道。本研究在安徽省日本看麦娘发生较为严重的地区采集多个日本看麦娘种群,测定其对精唑禾草灵的敏感性,扩增并比对了抗敏种群间ACCase基因序列差异,以期进一步明确抗性日本看麦娘的发生情况及可能存在的靶标抗性机制,旨在为抗性杂草治理提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 日本看麦娘种子在安徽省滁州市天长市部分地区冬小麦田采集10个日本看麦娘种群,分别标记为AH-1~AH-10;另外,在天长市非耕地采集1个种群作为敏感对照,标记为AH-S。所有采集信息详见表1。
1.1.2 供试药剂与试剂
69 g/L精唑禾草灵 (fenoxaprop-p-ethyl) 水乳剂,拜耳作物科学 (中国) 有限公司;2 × Es Taq MasterMix,康为世纪生物科技有限公司;EasyPure PCR Purification Kit,北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 供试仪器GXZ型智能光照培养箱,宁波江南仪器厂;ASS-4型自动控制农药喷洒系统,北京盛恒天宝科技有限公司;5427R型高速冷冻离心机,Eppendorf中国有限公司;T100型梯度PCR仪,美国Bio-Rad公司;JY300C型电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司;GA110型万分之一天平,德国赛多利斯公司;ChemiDoc XRS + 型凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司。
1.2 日本看麦娘对精鰁唑禾草灵的敏感水平测定采用温室盆栽法对各种群进行敏感性测试[13]。选取均匀一致的日本看麦娘种子,置于铺有2层滤纸 (Whatman No. 1,Maidstone,UK) 的玻璃培养皿中,每皿添加5 mL无菌水以保持湿润;将所有培养皿放入智能光照培养箱进行催芽,设置恒温20 ℃、光照周期12 h、相对湿度75%。待种子发芽后,选取芽长1 cm左右的幼苗移栽到填有壤土直径为12 cm的塑料盆钵内,每盆14株,置于可控日光温室内进行常规培养。试验期间温室温度15~25 ℃,自然光照,相对湿度75%。在2叶1心期间苗,每盆保留长势一致的幼苗10株;在3叶1心期,采用ASS-4型自动控制农药喷洒系统对所有幼苗进行茎叶喷雾处理,喷液压力设置为0.275 MPa,喷液量450 L/hm2。以预试验结果为基础,设定精唑禾草灵有效成分浓度梯度为:抗性种群,0、20.7、62.1、186.3、558.9、1 676.7和5 030.1 g/hm2;敏感种群,0、0.8、2.3、6.9、20.7、62.1和186.3 g/hm2。喷药后将所有幼苗放回温室继续培养。
于处理后第21天剪取植株地上部分,于75 ℃条件下烘干72 h,称量并记录干重。所有数据表示为相对于空白对照的干重百分比。抗性水平测定试验采用完全随机设计,每处理设置3个生物学重复,整个试验重复2次。使用SPSS v19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) 统计学软件对2次试验结果进行ANOVA分析,由于同一处理不同试验之间不存在统计学上的显著性差异 (P > 0.05),故将2次试验结果进行合并后,使用SigmaPlot v14.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA) 中4参数非线性回归模型[14]进行数据处理:
$ y = C + \{ \left( {D-C} \right)/\left[ {1 + {{\left( {x/{\rm{G}}{{\rm{R}}_{{\rm{50}}}}} \right)}^b}} \right] $ |
式中,y为各处理剂量下日本看麦娘干重占空白对照的百分比;C为剂量反应下限;D为剂量反应上限;x为除草剂用量;GR50为抑制杂草50%生长量所需除草剂剂量;b为斜率。杂草对除草剂的抗性水平用抗性指数 (Resistance index,RI) 表示,RI=抗性种群GR50/敏感种群GR50。抗性水平分级标准:RI < 2,敏感;2 ≤ RI < 5,低抗;5 ≤ RI <10,中抗;RI ≥ 10,高抗[15]。
1.3 日本看麦娘ACCase基因抗性突变鉴定 1.3.1 基因组DNA提取和引物选择从抗性、敏感日本看麦娘种群中各随机选择30株进行DNA提取。待植株生长至3叶1心期,每株剪取5~7 cm长的幼嫩叶片组织,采用经典的CTAB法提取DNA[16]。参考已报道的日本看麦娘引物进行ACCase基因扩增[12],引物序列为ACC-F:5’-TTTCCCAGCGGCAGA-3’和ACC-R:5’-TCCCTGGAGTCTTGCTTTCA-3’,所扩增序列包含所有已知能够赋予日本看麦娘抗性的突变位点。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 ACCase基因扩增和比对ACCase基因25 μL PCR扩增体系:2 × Es Taq MasterMix 12.5 μL、10 μmol/L前引物1 μL,10 μmol/L后引物1 μL,基因组DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共34个循环;最后72 ℃延伸10 min。
PCR结束后,取扩增产物5 μL于1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,切取含有目的条带的凝胶,使用EasyPure PCR Purification Kit进行产物纯化后测序。所有测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
使用DNAMAN v6.0 (Lynnon Biosoft,Quebec,Canada) 对基因序列进行比对分析。本研究中,所有日本看麦娘ACCase氨基酸序列位数均参照大穗看麦娘 (Alopecurus myosuroides Huds.) ACCase (GenBank登录号:AJ310767) 氨基酸序列全长进行比对。
2 结果与分析 2.1 不同日本看麦娘种群对精鰁唑禾草灵的抗性水平如表2所示,日本看麦娘种群AH-1~AH-10均对精唑禾草灵产生了不同水平的抗性,GR50值在223.89~429.78 g/hm2之间,远高于该药剂大田推荐剂量62.1 g/hm2。相对于敏感种群,各抗性种群抗性倍数在30.50~58.55之间,均为高水平抗性。
2.2 不同日本看麦娘种群ACCase基因抗性突变鉴定
采用PCR扩增后得到1 437 bp的ACCase基因片段,该片段与亲缘关系较近的大穗看麦娘对应基因的同源性为95%。以大穗看麦娘ACCase基因全长氨基酸序列为基准,将抗性和敏感日本看麦娘种群的ACCase基因进行比对,结果 (表3) 显示,AH-1~AH-10均发生了靶标基因突变。其中,AH-1~AH-3、AH-5~AH-8和AH-10 ACCase基因第1 781位氨基酸密码子由ATA突变为TTA,导致Ile突变为Leu;AH-4和AH-9 ACCase基因第2 027位氨基酸密码子由TGG突变为TGC,导致色氨酸 (Trp) 突变为半胱氨酸 (Cys)。各抗性种群均未发现其他位点突变,敏感种群未发现已知位点突变。
2.3 不同抗性日本看麦娘种群ACCase基因突变频率
对各日本看麦娘种群30个单株测序结果进行分析,得到不同种群的ACCase基因突变频率 (表4)。所有抗性种群靶标基因突变频率均≥ 80%,其中AH-5和AH-10突变频率最高,达100%;AH-6突变频率最低,为80%。
3 结论与讨论
近20年来,由于精唑禾草灵较高的选择性和极佳的除草活性,已被广泛应用于小麦田防除禾本科杂草,也因此导致了杂草抗性的快速产生[17]。本研究所采集的10个日本看麦娘种群均对精唑禾草灵产生了高水平抗性 (RI ≥ 10),抗性水平最高达58.55倍。日本看麦娘对精唑禾草灵高水平抗性发生情况可能与当地的用药历史有关。据报道,ACCase抑制剂连续使用不超过10次就会导致抗性杂草的产生[15],而该地区已经连续使用精唑禾草灵防治小麦田禾本科杂草超过15 a。日本看麦娘是四倍体植株[18],可异花授粉[2],抗性基因很容易通过花粉进行传播,这可能是不同种群均具有较高靶标基因突变频率的主要原因。
本研究中,10个日本看麦娘种群共发生了2种ACCase基因突变,即Ile-1781-Leu和Trp-2027-Cys,其中第1 781位突变发生比例高达80%。基因突变是导致杂草对除草剂产生靶标抗性的主要原因之一[5]。目前,Ile-1781-Leu已在多种杂草中证实可以对精唑禾草灵表达抗性,包括大穗看麦娘[19],野燕麦Avena fatua[20]和瑞士黑麦草Lolium rigidum[21]等。Délye等 [22]报道,Trp-2027-Cys突变是大穗看麦娘对ACCase抑制剂产生抗性的原因。因此,ACCase基因第1781位和第2027位突变很可能与这些种群对精唑禾草灵的抗性有关。Vila-Aiub等[23]研究了Ile-1781-Leu突变对ACCase活性的影响,发现该突变对靶标酶动力学无多效性影响,这可能是该突变形式发生频率较高的主要原因之一。
不同的靶标酶基因突变会导致杂草对除草剂产生不同的交互抗性。Délye等[22]报道,ACCase基因Ile-1781-Leu发生突变的大穗看麦娘可以对精唑禾草灵、炔草酯、氟吡甲和灵和噻草酮同时产生抗性,而Trp-2027-Cys突变则不能对烯草酮和噻草酮产生抗性。Du等[24]证明,ACCase基因Ile-1781-Leu突变可以赋予菵草Beckmannia syzigachne对APPs、CHDs和唑啉草酯产生高水平抗性,对精吡氟氯禾灵产生中等水平的抗性;而Trp-2027-Cys突变可对APPs和唑啉草酯产生高水平抗性,对CHDs产生低水平抗性。本研究仅测试了抗性日本看麦娘种群对精唑禾草灵的抗性水平,而这些种群是否对其他类型的ACCase抑制剂也表现出抗性则有待进一步研究。
现已证明,非靶标抗性是禾本科杂草对ACCase抑制剂产生抗性的主要机制[25]。Neve等[26]报道,长期施用单一除草剂会促进杂草体内非靶标抗性基因的积累。本研究中,10个日本看麦娘种群具有较长的精唑禾草灵单一使用历史 (>15 a),因此种群抗性中非靶标抗性参与的可能性较高。本研究仅从靶标抗性方面鉴定了不同抗性种群的靶标酶基因突变,而其抗性中是否存在非靶标抗性则需要采用细胞色素P450单加氧酶酶活体抑制或除草剂代谢速率测定等试验进一步测定[17,27-28]。
杂草抗性的产生与麦田不合理应用化学除草剂存在很大关系。在实际农业生产中,随意提高应用剂量,或在一个生产季度内多次施用同类药剂,是加快抗性种群产生的主要原因[29]。日本看麦娘抗性的快速发展对田间杂草的综合治理提出了更高的要求。据Wang等[30]报道,日本看麦娘种子在土壤埋藏深度为0~4 cm时适宜萌发,在7 cm时出苗则被完全抑制。因此,合理选择并轮用、混用不同作用机制的除草剂,把药剂防治与作物轮作 (如小麦和油菜轮作) 、深耕等农业措施相结合[31],是延缓日本看麦娘抗性进一步发生发展的有效手段。
[1] |
XU H L, ZHU X D, WANG H C, et al. Mechanism of resistance to fenoxaprop in Japanese foxtail (Alopecurus japonicus) from China
[J]. Pestic Biochem Physiol, 2013, 107(1): 25-31. |
[2] |
WU X B, ZHANG T, PAN L, et al. Germination requirements differ between fenoxaprop-p-ethyl resistant and susceptible Japanese foxtail (Alopecurus japonicus) biotypes
[J]. Weed Sci, 2016, 64(4): 653-663. DOI:10.1614/WS-D-16-00040.1 |
[3] |
HERBERT D, WALKER K A, PRICE L J, et al. Acetyl-CoA carboxylase-a graminicide target site[J]. Pest Manag Sci, 1997, 50(1): 67-71. DOI:10.1002/(SICI)1096-9063(199705)50:1<>1.0.CO;2-C |
[4] |
HEAP I M.The international survey of herbicide resistant weeds[DB/OL].[2018-10-17].http://www.weedscience.org.
|
[5] |
POWLES S B, YU Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides[J]. Annu Rev Plant Biol, 2010, 61: 317-347. DOI:10.1146/annurev-arplant-042809-112119 |
[6] |
KAUNDUN S S. Resistance to acetyl-CoA carboxylase-inhibiting herbicides[J]. Pest Manag Sci, 2014, 70(9): 1405-1417. DOI:10.1002/ps.2014.70.issue-9 |
[7] |
MOHAMED I A, LI R Z, YOU Z G, et al. Japanese foxtail (Alopecurus japonicus) resistance to fenoxaprop and pinoxaden in China
[J]. Weed Sci, 2012, 60(2): 167-171. DOI:10.1614/WS-D-11-00111.1 |
[8] |
TANG H W, LI J, DONG L Y, et al. Molecular bases for resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitor in Japanese foxtail (Alopecurus japonicus)
[J]. Pest Manag Sci, 2012, 68(9): 1241-1247. DOI:10.1002/ps.v68.9 |
[9] |
YUAN J S, TRANEL P J, STEWART C N JR. Non-target-site herbicide resistance: a family business[J]. Trends Plant Sci, 2007, 12(1): 6-13. |
[10] |
GHANIZADEH H, HARRINGTON K C. Non-target site mechanisms of resistance to herbicides[J]. Crit Rev Plant Sci, 2017, 36(1): 24-34. DOI:10.1080/07352689.2017.1316134 |
[11] |
毕亚玲, 吴翠霞, 郭文磊, 等. 抗精唑禾草灵的日本看麦娘ACCase基因突变
[J]. 植物保护学报, 2015, 42(3): 447-452. BI Y L, WU C X, GUO W L, et al. Mutation in the acetyl-CoA carboxylase confers resistance to fenoxaprop-p-ethyl in Alopecurus japonicus populations [J]. J Plant Prot, 2015, 42(3): 447-452. |
[12] |
BI Y L, LIU W T, GUO W L, et al. Molecular basis of multiple resistance to ACCase-and ALS-inhibiting herbicides in Alopecurus japonicus from China
[J]. Pestic Biochem Physiol, 2016, 126: 22-27. DOI:10.1016/j.pestbp.2015.07.002 |
[13] |
赵宁, 郭文磊, 李伟, 等. 抗精唑禾草灵和甲基二磺隆看麦娘ACCase和ALS基因突变
[J]. 植物保护学报, 2017, 44(5): 833-840. ZHAO N, GUO W L, LI W, et al. Mutations in the acetyl-CoA carboxylase and acetolactate synthase confer resistance to fenoxaprop-P-ethyl and mesosulfuron-methyl in Alopecurus aequalis populations [J]. J Plant Prot, 2017, 44(5): 833-840. |
[14] |
SEEFELDT S S, JENSEN J E, FUERST E P. Log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships[J]. Weed Technol, 1995, 9(2): 218-227. DOI:10.1017/S0890037X00023253 |
[15] |
BECKIE H J, TARDIF F J. Herbicide cross resistance in weeds[J]. Crop Prot, 2012, 35: 15-28. |
[16] |
POREBSKI S, BAILEY L G, BAUM B R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J]. Plant Mol Biol Rep, 1997, 15(1): 8-15. DOI:10.1007/BF02772108 |
[17] |
ZHAO N, YAN Y Y, GE L A, et al. Target site mutations and cytochrome P450s confer resistance to fenoxaprop-p-ethyl and mesosulfuron-methyl in Alopecurus aequalis
[J]. Pest Manag Sci, 2019, 75(1): 204-214. DOI:10.1002/ps.2019.75.issue-1 |
[18] |
XU H L, ZHANG W P, ZHANG T, et al. Determination of ploidy level and isolation of genes encoding acetyl-CoA carboxylase in Japanese foxtail (Alopecurus japonicus)
[J]. PLoS One, 2014, 9(12): e114712. DOI:10.1371/journal.pone.0114712 |
[19] |
PETIT C, BAY G, PERNIN F, et al. Prevalence of cross-or multiple resistance to the acetyl-Coenzyme A carboxylase inhibitors fenoxaprop, clodinafop and pinoxaden in black-grass (Alopecurus myosuroides Huds.) in France
[J]. Pest Manag Sci, 2010, 66(2): 168-177. |
[20] |
YU Q, AHMAD-HAMDANI M S, HAN H P, et al. Herbicide resistance-endowing ACCase gene mutations in hexaploid wild oat (Avena fatua): insights into resistance evolution in a hexaploid species
[J]. Heredity, 2013, 110(3): 220-231. DOI:10.1038/hdy.2012.69 |
[21] |
ZHANG X Q, POWLES S B. Six amino acid substitutions in the carboxyl-transferase domain of the plastidic acetyl-CoA carboxylase gene are linked with resistance to herbicides in a Lolium rigidum population
[J]. New Phytol, 2006, 172(4): 636-645. DOI:10.1111/nph.2006.172.issue-4 |
[22] |
DÉLYE C, MATÉJICEK A, MICHEL S. Cross-resistance patterns to ACCase-inhibiting herbicides conferred by mutant ACCase isoforms in Alopecurus myosuroides Huds.(black-grass), re-examined at the recommended herbicide field rate
[J]. Pest Manag Sci, 2008, 64(11): 1179-1186. DOI:10.1002/ps.v64:11 |
[23] |
VILA-AIUB M M, YU Q, HAN H P, et al. Effect of herbicide resistance endowing Ile-1781-Leu and Asp-2078-Gly ACCase gene mutations on ACCase kinetics and growth traits in Lolium rigidum
[J]. J Exp Bot, 2015, 66(15): 4711-4718. DOI:10.1093/jxb/erv248 |
[24] |
DU L, LIU W T, YUAN G H, et al. Cross-resistance patterns to ACCase-inhibitors in American sloughgrass (Beckmannia syzigachne Steud.) homozygous for specific ACCase mutations
[J]. Pestic Biochem Physiol, 2016, 126: 42-48. DOI:10.1016/j.pestbp.2015.07.005 |
[25] |
HAWKINS N J, BASS C, DIXON A, et al. The evolutionary origins of pesticide resistance[J]. Biol Rev, 2018. DOI:10.1111/brv.12440 |
[26] |
NEVE P, VILA-AIUB M, ROUX F. Evolutionary-thinking in agricultural weed management[J]. New Phytol, 2009, 184(4): 783-793. DOI:10.1111/j.1469-8137.2009.03034.x |
[27] |
ZHAO N, LI W, BAI S, et al. Transcriptome profiling to identify genes involved in mesosulfuron-methyl resistance in Alopecurus aequalis
[J]. Front Plant Sci, 2017, 8: 1391. DOI:10.3389/fpls.2017.01391 |
[28] |
HAN H P, YU Q, CAWTHRAY G R, et al. Enhanced herbicide metabolism induced by 2, 4-D in herbicide susceptible Lolium rigidum provides protection against diclofop-methyl
[J]. Pest Manag Sci, 2013, 69(9): 996-1000. DOI:10.1002/ps.2013.69.issue-9 |
[29] |
XU H L, LI J, ZHANG D, et al. Mutations at codon position 1999 of acetyl-CoA carboxylase confer resistance to ACCase-inhibiting herbicides in Japanese foxtail (Alopecurus japonicus)
[J]. Pest Manag Sci, 2014, 70(12): 1894-1901. DOI:10.1002/ps.2014.70.issue-12 |
[30] |
WANG H Z, HUANG Y Z, ZHANG L L, et al. Japanese foxtail (Alopecurus japonicus) management in wheat in China: seed germination, seedling emergence, and response to herbicide treatments
[J]. Weed Technol, 2018, 32(2): 211-220. DOI:10.1017/wet.2017.87 |
[31] |
ZHAO N, LI Q, GUO W L, et al. Effect of environmental factors on germination and emergence of shortawn foxtail (Alopecurus aequalis)
[J]. Weed Sci, 2018, 66(1): 47-56. DOI:10.1017/wsc.2017.42 |