农药学学报  2019, Vol. 21 Issue (1): 19-25   PDF    
马铃薯花杀螨活性成分分离、鉴定及其杀螨活性
王玉灵, 胡冠芳, 牛树君, 余海涛, 赵峰     
甘肃省农业科学院 植物保护研究所,兰州 730070
摘要: 以马铃薯花乙酸乙酯粗提物为分离对象,以朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus等4种叶螨为供试靶标,采用生物活性追踪法,分离得到2种具有杀螨活性的化合物 (6a2′a)。依据质谱、核磁共振氢谱和碳谱,并结合相关文献数据鉴定了其化学结构,分别为江户樱花苷 (5, 7, 4′-三羟基二氢黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(6a) 和α-卡茄碱 (2′a),前者系首次从茄科植物马铃薯中分离得到。采用玻片浸渍法测定了2个化合物对朱砂叶螨等4种叶螨的触杀活性。结果表明,化合物6a(江户樱花苷) 对朱砂叶螨、二斑叶螨T. urticae和山楂叶螨T. viennensis 24 h LC50值分别为461.98、338.76和732.08 mg/L,其触杀活性强于对照药剂鱼藤酮,相对毒力分别为鱼藤酮的1.17、1.52和3.07倍;化合物2′a(α-卡茄碱) 对二斑叶螨和山楂叶螨24 h LC50分别为480.79和834.98 mg/L,相对毒力分别为鱼藤酮的1.07和2.69倍。可见,江户樱花苷和α-卡茄碱具有一定的杀螨活性和潜在的应用价值。
关键词: 植物源农药     马铃薯花     活性成分     分离鉴定     江户樱花苷     卡茄碱     杀螨活性    
Separation and identification of activity ingredients in potato flowers and their acaricidal activities
WANG Yuling, HU Guanfang, NIU Shujun, YU Haitao, ZHAO Feng     
Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China
Abstract: Two compounds, 6a and 2′a, with acaricidal activities against four species of mites using bioassay-guided methods were isolated from the ethyl acetate extract of potato flowers. These two compounds were identified as prunin (5, 7, 4′-trihydroxyflavanone-7-O-β-D-glucopyranoside) (6a) and α-chaconine (2′a) by mass spectrometry, 13C and 1H nuclear magnetic resonance (NMR) and comparison with data from literatures. The former was first isolated from the Solanaceae plant potato. We determined the contact acaricidal activities of prunin and α-chaconine against four species of mites by slide-dip method and the results demonstrated that these compounds were more effective compared to pesticide rotenone, which was the positive control. The 24 h LC50 for prunin against Tetranychus cinnabarinus, T. urticaeand T. viennensis were 461.98, 338.76 and 732.08 mg/L, respectively, which were 1.17, 1.52 and 3.07 times more active than rotenone, respectively. The 24 h LC50 for α-chaconine againstT. urticaeand T. viennensis were 480.79 and 834.98 mg/L, respectively, the relative toxicity are 1.07 and 2.69 times higher compared to rotenone, respectively. Obviously, prunin and α-chaconine have acaricidal activities and potential application value.
Key words: botanical pesticides      potato flowers      active ingredients      separation and identification      prunin      chaconine      acaricidal activity     

马铃薯Solanum tuberosum属茄科 (Solanaceae) 茄属 (Solanum) 一年生草本植物。已有研究证实,马铃薯块茎在发芽过程中可产生一种具有复杂含氮杂环的碱性天然毒素——糖苷生物碱,它是马铃薯在协同进化过程中机体自身产生的针对病原体、昆虫、寄生虫和食肉动物的具有天然防御作用的次生代谢产物,主要为茄碱 (solanine) 和卡茄碱 (chaconine) 2类,占其总含量的90%以上[1]。诸多研究表明,糖苷生物碱对丽蝇科幼虫等昆虫具有拒食作用[2],其中茄碱和卡茄碱具有抵御昆虫侵袭的作用[3],对蜗牛Helix aspersa也有驱食作用[4]。此外,也有研究表明:茄碱和卡茄碱还具有抗真菌活性[5-7],将茄碱和卡茄碱混合使用还具有协同抗真菌效应[8-10]

笔者在进行马铃薯代谢物毒性研究中发现,马铃薯花的提取物具有一定的杀螨活性。马铃薯花是马铃薯生产的下游植物资源,在马铃薯开花时需摘除花茎,以利于薯块膨大生长。目前关于马铃薯花提取物对农业害虫 (螨) 的生物活性研究报道甚少。胡冠芳等[11]、郭致杰等[12]及王玉灵等[13]测定了庄薯3号马铃薯花乙酸乙酯粗提物的杀虫活性。结果表明,其对粘虫Mythimna separate、小菜蛾Plutella xylostella等5种鳞翅目幼虫以及萝卜蚜Lipaphis erysimi具有很强或较强的触杀作用,但并未对其有效成分进行分离鉴定,也未见有关其杀螨活性的报道。鉴于此,笔者对马铃薯花的乙酸乙酯粗提物进行了初步分离,并以4种叶螨为供试靶标,采用生物活性追踪法对其杀螨活性成分进行了分离鉴定。

1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 植物材料

庄薯3号马铃薯盛花期之花于2016年7月采自甘肃省渭源县会川镇,室内自然阴干,粉碎后过380 μm孔径筛,室温下保存备用。

1.1.2 试剂与仪器

江户樱花苷 (prunin,纯度98%)、α-卡茄碱 (α-chaconine,纯度98%) 和鱼藤酮 (rotenone,纯度99%) 标准品均购于百灵威科技有限公司。柱层析硅胶 (48~75 μm)、薄层层析硅胶 (GF254) 和聚酰胺树脂 (250~270 μm) 均由青岛海洋化工有限公司生产。其余试剂均为分析纯。

BrukerAPEXⅡ质谱仪和BrukerDRX400核磁共振波谱仪,德国Bruker公司生产;X-4型显微熔点仪 (温度未校正),上海精密科学仪器有限公司生产;ZF7-C三用紫外分析仪,上海康华生化仪器制造有限公司生产;TSQ QuantumLC/MS液质联用仪,美国Thermo Fisher Scientific公司生产。

1.1.3 供试叶螨

朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus、二斑叶螨T. urticae、截形叶螨T. truncatus和山楂叶螨T. viennensis,均采自甘肃省农业科学院未施药的大豆、菜豆或桃树、苹果树叶片上。

1.2 化合物的分离鉴定方法 1.2.1 活性化合物提取与分离

称取马铃薯花粉末25 kg,用乙醇浸提3次 (浸提时间分别为72、48、24 h),过滤,合并滤液,减压浓缩至干,得到1 150 g乙醇粗提物浸膏 (1a)。将该浸膏575 g悬浮于1 500 mL蒸馏水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取,分别得到石油醚部分 (2a)106.17 g、乙酸乙酯部分 (2b) 20.39 g和正丁醇部分 (2c)226.67 g。

1)化合物6a的分离 将乙酸乙酯部分 (20.39 g) 用硅胶柱进一步分离,依次用水饱和乙酸乙酯、V(水饱和乙酸乙酯) : V(乙醇) = (20 : 1,10 : 1,5 : 1,2 : 1,1 : 1) 和乙醇洗脱,分别按等体积 (150 mL) 收集馏分,以V(乙酸乙酯) : V(乙醇) = 3 : 1为展开剂,经薄层层析 (TLC) 检测 (用5%硫酸-乙醇液显色),合并相同馏分,得到8个极性段 (3a~3 h,产量依次为1.58、0.51、0.95、0.33、1.22、0.88、0.12和0.17 g)。将3e (1.22 g) 极性段用甲醇冲洗除去不溶物,共得到2个部分4a (733 mg) 和4b (322 mg,为不溶物)。在4a (733 mg) 中加入12 g硅胶,减压蒸馏至干,用硅胶柱分离,依次用三氯甲烷、V(三氯甲烷) : V(甲醇) = (20 : 1,10 : 1,5 : 1,3 : 1,2 : 1,1 : 1) 和甲醇梯度洗脱,以V(三氯甲烷) : V(甲醇) = 3 : 1为展开剂,经TLC检测 (用5%硫酸-乙醇液显色),合并相同馏分,共得到3个组分5a (152 mg)、5b (27 mg) 和5c (103 mg)。其中,5a (152 mg) 再用聚酰胺进行柱层析分离,依次用V(甲醇) : V(水) = 1 : 4和甲醇洗脱,收集馏分,减压蒸馏至干,再经硅胶柱层析纯化,以V(二氯甲烷) : V(甲醇) : V(氨水) = 4 : 1 : 0.05 为洗脱剂,最后得到化合物6a (81 mg)。

2)化合物2′a的分离 取乙醇粗提物浸膏 (1a)575 g,用质量分数为4%的盐酸溶液溶解后,于8000 r/min下离心,取上清液。重复浸提1次,合并酸溶液。酸溶液先用少量三氯甲烷洗涤,以除去脂溶性杂质,再用浓氨水调节pH=9~10后,用三氯甲烷等体积萃取2次。合并有机相,减压浓缩至膏状。将膏状物用三氯甲烷溶解,经硅胶柱分离,以V(三氯甲烷) : V(甲醇) = 20 : 1,10 : 1,5 : 1,3 : 1,2 : 1和1 : 1进行梯度洗脱,TLC检测 (以V(三氯甲烷) : V(甲醇) = 3 : 1为展开剂),合并相同馏分,分别得到2个组分1′a (2.23 g) 和1′b (2.66 g)。将1′b (2.66 g) 再经硅胶柱层析,用V(三氯甲烷) : V(甲醇) : V(氨水) = 4 : 1 : 0.05洗脱,得到化合物2′a (72 mg)。

1.2.2 化合物结构鉴定

取分离所得的化合物6a2′a,在紫外灯 (254 nm) 下观察其荧光强弱,用5%硫酸-乙醇溶液加热进行显色反应,观察颜色变化。化合物6a用聚酰胺薄层层析后,用5%的FeCl3水溶液显色;化合物2′a用改良的碘化铋钾试剂显色,观察其颜色变化,通过化合物特征颜色反应对其类型进行初步判定[14]。最后经过质谱、核磁共振氢谱和碳谱分析,并结合相关文献,对化合物的结构进行解析。

1.3 杀螨活性测定 1.3.1 药液配制

将分离得到的不同分离段产物及江户樱花苷、α-卡茄碱标准品以及对照药剂鱼藤酮分别用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解,并加入质量分数为1%的表面活性剂JFC (C7~C9烷醇聚氧乙烯醚)。依据预试验结果,各分离段产物仅设置1个浓度进行杀虫活性追踪,江户樱花苷和α-卡茄碱在166.7~2 000.0 mg/L之间设置5个不同梯度质量浓度进行测定。每个处理均设溶剂对照及药剂对照,其量按处理的同等浓度或梯度浓度设置。

1.3.2 触杀活性测定

采用FAO推荐的玻片浸渍法[15]。用毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨,将其背部粘在载玻片一端的双面胶带上,每片粘30头。在温度 (25 ± 1)℃、相对湿度60%~80%、光照 : 黑暗=14 : 10条件下饲养,及时加水保湿,4 h后用双目镜观察,剔除死亡或不活泼个体。将带螨玻片的一端浸入药液中,轻轻摇动5 s后取出,用吸水纸迅速吸干螨体及其周围多余的药液,每个浓度重复3次。处理后将试螨置于上述条件的生化培养箱中培养。24 h后用双目镜调查死亡数。分别按公式 (1)~(3) 计算死亡率 (M)、校正死亡率 (Mc) 及相对毒力 (Rt)。

$ M/{\text{%}} = \frac{{D_{\rm{n}}}}{{T_{\rm{n}}}} \times 100 $ (1)
$ M_{\rm{c}}/{\text{%}} = \frac{{M_{\rm{t}} - M_{\rm{o}}}}{{100 - M_{\rm{o}}}} \times 100 $ (2)
$ R_{\rm{t}} = \frac{{P_{\rm{c}} ({\rm{LC_{50}}})}}{{P_{\rm{t}} ({\rm{LC_{50}}})}} $ (3)

式中:Dn为死亡螨数,Tn为处理螨数;Mt为处理死亡率,Mo为对照死亡率;Pc(LC50) 为对照药剂的LC50值,Pt (LC50) 为供试药剂LC50值。

用SPSS17.0软件对数据进行回归及方差分析,得毒力回归方程 (y = A + Bx),计算致死中浓度LC50值及95%置信限。

2 结果与分析 2.1 活性化合物结构鉴定

化合物6a:白色粉末,熔点223~224 ℃,254 nm紫外灯下荧光较强,在5%硫酸-乙醇溶液中加热先显黄色,后呈黑色。用聚酰胺薄层层析后,用5%的FeCl3水溶液进行显色处理,呈棕色,说明该化合物可能为黄酮类,且连有糖基,可能为二氢黄酮、二氢黄酮苷或异黄酮类化合物[14]。ESI-MS,m/z: 435 [M + H]+,457 [M + Na]+,473 [M + K]+,表明化合物的相对分子质量为434,分子式C21H22O10。在化合物的 13C NMR数据中,存在δ197.26、42.11和78.72的特征化学位移,表明该化合物母体骨架为二氢黄酮,通过与naringrnin-7-O-neohesperidoside的 13C NMR化学位移进行比较,发现母体骨架与naringrnin[16]完全相同,只是糖苷部分少了一个鼠李糖的信号,但与葡萄糖的信号一致,证明糖苷为葡萄糖且通过糖苷键连接在naringrnin的7位碳上。化合物的核磁共振数据如下。

1H NMR (400 MHz,DMSO-d6), δ:12.03 (1H,s,5-OH),9.62 (1H,s,4′-OH),7.33 (2H,d,J = 8.5 Hz,2′,6′-H),6.80 (2H,d,J = 8.4 Hz,3′,5′-H),6.13 (1H,d,J = 1.8 Hz,6-H),6.14 (1H,d,J = 1.8 Hz,8-H),5.50 (1H,dd,J = 12.7,2.8 Hz,2-H),4.96 (1H,d,J = 7.7 Hz,1′′-H),2.75 (1H,s)。

13C NMR (100 MHz,DMSO-d6), δ:78.72 (C-2),42.11 (C-3),197.26 (C-4),162.98 (C-5),96.54 (C-6),165.35 (C-7),95.49 (C-8),162.79 (C-9),103.29 (C-10),128.67 (C-1′),128.49 (C-2′),115.24 (C-3′),157.84 (C-4′),115.24 (C-5′),128.49 (C-6′),99.64 (C-1′′),73.05 (C-2′′),77.11 (C-3′′),69.53 (C-4′′),76.34 (C-5′′),60.61 (C-6′′)。

通过对比发现,化合物6a1H NMR和13C NMR与文献[16-17]的数值基本一致,由此确定该化合物为5, 7, 4′-三羟基二氢黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,即江户樱花苷 (prunin),结构式见图式 1

图式1 江户樱花苷 (6a) 结构式 Scheme1 Structural formula of prunin (6a)

化合物2′a:白色粉末,熔点230~232 ℃,在254 nm紫外光下荧光很弱,在5%硫酸-乙醇溶液中加热先显红色,后呈暗绿色;用改良的碘化铋钾试剂显色呈阳性,说明该化合物为生物碱类[14]。ESI-MS, m/z:852 [M + H]+,表明该化合物的相对分子质量为851,分子式C45H73O14N。在化合物的13C NMR数据中,存在δ 140.30、121.48、16.66、19.01、18.33和19.43的特征化学位移,表明该化合物母体骨架为茄属生物碱solanidine[16],并含有100.57 (C-1′′′),100.35 (C-1′′) 和98.31 (C-1′)3个糖的异头碳信号,证明是一个生物碱的三糖苷。化合物的核磁共振数据如下。

图式2 α-卡茄碱 (2′a) 结构式 Scheme2 Structural formula of α-chaconine (2′a)

1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ:5.31 (1H,d,J = 4.2 Hz),5.01 (1H,s),4.91 (1H,d,J = 6.5 Hz),4.71-4.66 (3H,m),4.66-4.61 (2H,m),4.55 (1H,d,J = 4.3 Hz),4.45 (2H,dd,J = 11.2,5.9 Hz),4.38 (1H,d,J = 7.8 Hz),4.09 (3H,q,J = 5.2 Hz),3.97 (1H,dd,J = 9.4,6.2 Hz),3.84 (1H,dd,J = 9.3,6.2 Hz),3.67 (1H,s),3.58 (2H,d,J = 10.3 Hz),2.79 (1H,d,J = 7.4 Hz),2.59 (1H,dd,J = 15.8,6.8 Hz),2.38 (1H,dd,J = 12.9,3.2 Hz),2.15 (1H,t,J = 12.0 Hz),1.98-1.87 (1H,m),1.83-1.61 (7H,m),1.56-1.42 (9H,m),1.39-1.29 (2H,m),1.22 (1H,s),1.10-1.07 (10H,m),0.94-0.89 (8H,m),0.80-0.78 (7H,m)。

13C NMR (100 MHz,DMSO-d6),δ:37.68 (C-1),31.56 (C-2),77.02 (C-3),140.30 (C-5),121.48 (C-6),32.96 (C-7),31.29 (C-8),49.72 (C-9),36.89 (C-10),20.46 (C-11),57.01 (C-14),36.21 (C-15),68.73 (C-16),62.54 (C-17),16.66 (C-18),19.01 (C-19),36.429 (C-20),18.33 (C-21),76.74 (C-22),28.98 (C-23),30.71 (C-24),30.99 (C-25),59.64 (C-26),19.43 (C-27),98.31 (C-1′),74.10 (C-2′),76.18 (C-3′),76.42 (C-4′),74.10 (C-5′),60.07 (C-6′),100.35 (C-1′′),70.48 (C-2′′),70.62 (C-3′′),71.97 (C-4′′),68.02 (C-5′′),17.84 (C-6′′),100.57 (C-1′′′),70.76 (C-2′′′),70.62 (C-3′′′),71.97 (C-4′′′),68.47 (C-5′′′),17.79 (C-6′′′)。

经对比,发现化合物2′a与文献[16, 18]数据基本一致,由此确定化合物2′a为α-卡茄碱 (α-chaconine),其结构式见图式 2

2.2 杀螨活性 2.2.1 不同分离段产物的杀螨活性

分离过程中的活性追踪数据表明 (表1),马铃薯花的乙醇粗提物 (1a) 及其乙酸乙酯萃取段 (2b) 的活性较强,在2 000.0 mg/L下对4种叶螨24 h的校正死亡率达70%以上。随后通过柱层析得到的3e极性段及其进一步分离得到的4a部分活性最强,分别在1 333.3和1 000.0 mg/L时,24 h 校正死亡率均在80%左右。由4a部分分离得到的5a,在666.7 mg/L下除对山楂叶螨的活性较弱外,对其他3种叶螨的24 h 校正死亡率均在80%左右。最后从5a中分离获得的化合物6a对朱砂叶螨、二斑叶螨和截形叶螨均具有优异的触杀活性,在666.7 mg/L下的24 h校正死亡率分别为86.2%、94.2%和86.5%,且对前2种叶螨的活性强于对照药剂鱼藤酮,对截形叶螨活性略低于鱼藤酮。以分离生物碱为目的对马铃薯花的乙醇粗提物处理后共得到1′a1′b 2个组分,杀螨活性成分主要存在于1′b组分,继续分离得到的化合物2′a,其对二斑叶螨和截形叶螨均具有很强的触杀活性,在666.7 mg/L下,24 h校正死亡率分别为83.9%和92.1%,活性强于鱼藤酮或与鱼藤酮相当。

表 1 不同分离段产物及活性化合物对4 种叶螨的触杀活性 Table 1 Contact toxicity of different separation products and active compounds against four species of mites

2.2.2 化合物6a2′a的杀螨活性

测定结果 (表2) 表明:化合物6a对朱砂叶螨、二斑叶螨和山楂叶螨的LC50 值分别为461.98、338.76和732.08 mg/L,其触杀活性均强于化合物2′a;而对于截形叶螨,2种化合物的触杀活性相当。与对照药剂鱼藤酮比较,化合物6a对朱砂叶螨、二斑叶螨和山楂叶螨的毒力均高于鱼藤酮,相对毒力分别为鱼藤酮的1.17、1.52和3.07倍,但对截形叶螨的毒力则不及鱼藤酮,相对毒力仅为鱼藤酮的0.45倍;化合物2′a对二斑叶螨和山楂叶螨的毒力高于鱼藤酮,相对毒力为鱼藤酮的1.07和2.69倍,而对朱砂叶螨和截形叶螨的毒力则不及鱼藤酮,相对毒力仅为鱼藤酮的0.56和0.45倍。

表 2 化合物6a2′a对4 种叶螨的毒力 Table 2 Toxicities of compound 6a and 2′a against four species of mites

3 结论与讨论

本文沿2条主线,以朱砂叶螨等4种叶螨为靶标对马铃薯花中的杀螨活性成分进行了追踪分离,以同等浓度下鱼藤酮的活性数据为参考,将校正死亡率略小于鱼藤酮或与其相当的分离段确定为进一步分离的对象,依次递进,并采用硅胶柱层析和薄层层析等方法最终分离获得了2个含量较高的杀螨活性化合物6a2′a,利用核磁共振氢谱和碳谱结合质谱分析,并参照相关文献数据,最终确定2个活性化合物分别为江户樱花苷和α-卡茄碱。杀螨活性测定结果表明:江户樱花苷 (6a) 对朱砂叶螨、二斑叶螨和山楂叶螨的触杀活性强于鱼藤酮;α-卡茄碱 (2′a) 对二斑叶螨和山楂叶螨的触杀活性也强于鱼藤酮。由此可见,来源于马铃薯花的次生代谢产物且未经任何结构修饰的江户樱花苷和α-卡茄碱是2种具有一定杀螨活性的天然化合物。

关于江户樱花苷,已有学者先后从唇形科植物风轮菜Clinopodium umbrosum[19]、报春花科植物珍珠菜Lysimachia clethroides[20]、菊科植物蜡菊Helichrysum bracteatum[21]和水龙骨科植物槲蕨Drymaria fortunei[17]等植物中分离得到,但从茄科植物马铃薯花中分离得到尚属首次。有关其生物活性,研究报道较多的是在医学抗肿瘤方面[22],其对农业害虫 (螨) 的生物活性尚未见报道。从化学结构和杀螨活性分析,江户樱花苷应是一种较理想的先导化合物,对其进行结构优化与衍生合成,极有可能发现杀螨活性更强的新化合物,进而创制出新型植物源杀螨剂。

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